伤寒沙门菌耐药基因检测及定位
作者：孙宪锋 刘晓霞
单位：215007 苏州医学院(孙宪锋，研究生)
关键词：沙门菌，伤寒；质粒；染色体；氯霉素乙酰转移酶；抗药性
中华传染病杂志980402 【摘要】 目的 探讨伤寒沙门菌耐药基因的定位。方法 32P随机引物标记氯霉素耐药基因为探针，以Slot blot、Southern blot法检测，同时以氯霉素乙酰转移酶活性(CAT)和药敏试验(MIC)作为耐药标志。结果 16株伤寒菌中有14株含98 600 000大质粒。经杂交，其中7株质粒阳性；1株染色体阳性；3株质粒与染色体均为阳性。质粒杂交带位于4.3kb片段，染色体为5.2kb片段。结论 伤寒菌耐氯霉素基因大部分位于98 600 000大质粒上，少数位于染色体上或两者兼有。
The detection and location of drug resistant gene in Salmonella typhi Sun Xianfeng,Liu Xiaoxia.Department of Microbiology,Suzhou Medical College,Suzhou 215007
, 百拇医药
【Abstract】 Objective In order to probe the location of drug resistance-gene of Salmonella typhi.Methods Detection was carried out by slot blot and southern blot,using Cm-resistance gene labeled with 32P by random primed method as the probe.CAT and MIC were exploited as the marker of drug resistance.Results In sixteen S.T strains,fourteen Strains had one 98 600 000 plasmid.Using hybridization method,we found out that 7 of the 14 strains plasmids were positive.While chromosome was positive for 1 strain.Both plasmid and chromosome were positive for 3 strains.The molecular weights of the hybridization positive fragments of plasmid and chromosome were 4.3kb and 5.2kb,respectively.Conclusion: The Cm-resistance gene of S.T are mainly located on the 98 600 000 plasmid.However,some of them are located on chromosome or on both chromosome and plasmid.
, 百拇医药
【Key words】 Salmonella typhi Plasmids Chromosome Chloramphenicol acetyltransferase Drug resistance
伤寒沙门菌(ST)的耐药由R质粒介导的观点已基本被确认，其通过细菌间质粒的接合传递造成流行。黄瑞等[1]连续五年对伤寒沙门菌耐药质粒进行了监测，发现细菌耐药株均含一个98 600 000大质粒，敏感株则为阴性。然而自1989年以后，耐药菌株明显下降，同时出现少量98 600 000质粒阳性的敏感株。这提示细菌耐药的表达方式不止一种，伤寒杆菌的耐药性与外膜蛋白(OMP)关系的研究[2]也显示OMP的缺失、减少与耐药性有关，但与质粒无正相关，所以关于耐药性还有许多问题有待解决。目前国内外对R质粒介导的耐药性研究较多，而染色体对耐药性的影响尚未引起足够的重视[3]。本实验利用分子杂交手段以氯霉素(Cm)对伤寒沙门菌进行耐药基因定位研究，以进一步了解伤寒沙门菌耐药机制。
, 百拇医药
材料与方法
一、材料来源
(一) 菌株 从各年度临床收集的菌株中选出16株伤寒沙门菌及1株痢疾杆菌(DB3511)；药敏试验质量控制对照菌株为大肠杆菌ATCC25922，金黄色葡萄球菌ATCC25923和铜绿色假单胞菌ATCC27853；PACYC184大肠杆菌含Cm、四环素耐药基因用于制备探针(由军事医学科学院陈添弥教授惠赠)。
(二) 抗生素 氯霉素、四环素、氨苄青霉素、头孢拉啶(北京药品生物制品检定所)、壮观霉素(SP，美国The upjohn Co.)。
(三) 生物制剂 限制性核酸内切酶：EcoRI、Scal(华美生物工程公司产品)，核酸分子量参照物：λDNA/Hind Ⅲ Markers、随机引物标记试剂盒(Prime-a-Gene Labeling System，Promega公司产品)、α-32P-d ATP(北京福瑞公司产品)。
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二、方法
(一) 药敏试验 采用平板稀释法。试验时用标准的参考对照菌株与检测菌株平行测定药敏结果，实行质控。
(二) 氯霉素乙酰转移酶(CAT)活性检测 采用快速CAT活性检测法[4]。
(三) 质粒提取 参照Takahashi法。
(四) 染色体DNA的提取 按文献[5]进行。
(五) 氯霉素耐药基因探针的制备
1. 探针提取 用含药(四环素40μg/ml Cm40μg/ml壮观霉素50μg/ml)选择培养基培养PACYC184菌株，采用碱裂解法[6]提取。
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2. 限制性内切酶分析 参照PACYC184遗传图，选用EcoRI和ScaI两种限制性核酸内切酶对PACYC184质粒进行酶切，将质粒切成二个片段，分别为3830bp及414bp，氯霉素耐药基因存在于小片段中，取该段DNA作为探针。
3. DNA回收 凝胶电泳后，在366nm紫外光下将探针片段切下，在Parafilm上切碎，放入eppendorf管加等量TE及等体积的酚，混匀，液氮冷冻5分钟，离心取上清，加无水乙醇沉淀，75%乙醇脱盐，最后溶解在去离子双蒸水中。
(六) DNA探针标记及限制性核酸内切酶分析 待测质粒及染色体均采用EcoRI酶切，用随机引物标记法进行探针的32P标记。
(七) Slot blot[7] 样品DNA(10μl、0.75～1μg)100℃煮沸5分钟变性，放入冰中5分钟。加样，真空抽干，80℃干燥，放入保鲜膜中。然后预杂交、杂交、洗膜、放射自显影。
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(八) Southern blot[8] 将酶切的待检质粒及染色体在1.2%的琼脂糖凝胶上与Markers一起电泳，50V 24小时，溴乙锭染色后照相。然后进行转移、预杂交、杂交、洗膜、放射性自显影。
结果
一、药物敏感试验(MIC)
对16株伤寒沙门菌及1株痢疾杆菌进行了4种抗生素的MIC检测。16株伤寒杆菌中有9株耐Cm，1株痢疾杆菌耐Cm。
二、氯霉素乙酰转移酶活性测定
凡耐Cm菌株，CAT活性均为阳性。
三、质粒检测
16株伤寒菌中，有14株检出98 600 000大质粒；1株痢疾杆菌不含98 600 000大质粒，但有四个小质粒，分别为3 000 000、2 200 000、1 900 000、1 600 000。
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四、Slot blot
14株有98 600 000质粒的伤寒杆菌中有10株质粒杂交阳性，4株阴性。根据Slot blot质粒杂交结果，结合CAT及MIC选择8株做了染色体的Slot blot，其中有4株染色体杂交阳性，4株阴性。1株痢疾杆菌质粒杂交阴性，而染色体杂交阳性，结果见图1。
质粒：A.ST3 B.ST6 C.ST8 D.ST10R E.ST10S F.ST11 G.ST31H.ST39 I.ST80 J.ST81 K.ST84 L.DB3511 M.ST86 N.PACYC184 染色体：A′.ST10S B′.ST11 C′.ST31 D′.ST39 E′.ST40 F′.ST62 G′.ST80 H′.DB3511 I′.ST281 J′.PACYC184
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图1 伤寒杆菌和痢疾杆菌质粒和染色体狭缝杂交结果
五、Southern blot
根据Slot blot结果，选出4株质粒和染色体杂交阳性的伤寒杆菌(ST10R、ST31、ST39、ST80)及1株痢疾杆菌(DB3511)做质粒和染色体的Southern blot，以观察耐氯霉素基因的位置。由结果可知，伤寒菌的质粒、染色体经过EcoRI酶切后，杂交阳性带各均处于一个水平，质粒杂交带为4.3kb，染色体杂交带为5.2kb；而DB3511染色体杂交带与伤寒杆菌的杂交带不处于一个水平，为3.4kb，见图2。Slot blot与Southern blot结果见附表。
讨论
1987～1988年间苏州地区出现伤寒杆菌耐药菌流行，其耐药性主要由一条分子量为98 600 000的大质粒所介导，可编码多种抗性，属不相容性IncC群，其酶切图谱与国外流行的HI群完全不同，说明近年国内流行的耐药伤寒菌与国外不同。1989～1991年，伤寒杆菌耐药菌株有下降趋势，同时出现了少量98 600 000质粒阳性的Cm敏感株。
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质粒：A.ST31 B.ST39 C.ST80 D.ST10R 染色体： E.ST31 F.ST39
G.ST80 H.DB3511 I.λDNA/HindⅢ Markers
图2 伤寒杆菌和痢疾杆菌质粒和染色体酶切图谱
附表 Slot blot和Southern blot结果 菌种
Slot blot
Southern blot
P
, 百拇医药 Ch
P
Ch
ST10R
+
ND
+
ND
ST31
+
+
+
+
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ST39
+
+
+
+
ST80
+
+
+
+
DB3511
-
+
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ND
+
P：质粒 Ch：染色体 ND：未做 本实验用氯霉素耐药基因片段制成的探针对1987～1991年间收集的伤寒杆菌的质粒和染色体进行了分子杂交检测，通过耐药基因定位以期了解耐药菌的流行规律。实验结果发现，14株有98 600 000质粒的伤寒菌有10株质粒杂交阳性，其中有7株都能产生CAT，表现为氯霉素的耐药，说明耐Cm是由质粒介导。另3株菌(ST31、ST39、ST80)质粒与染色体杂交均呈阳性，表明氯霉素耐药基因同时存在于质粒和染色体上。所不同的是ST80株CAT阳性，MIC检测为耐药；而ST31、ST39两株虽含Cm耐药基因，但CAT为阴性，药敏试验也表现为对氯霉素敏感。在质粒杂交阴性的4株菌中，ST11的染色体杂交结果呈阳性。表明ST11的Cm耐药基因不在98 600 000大质粒上，而是存在于染色体中，并由染色体编码产生CAT，表现为耐药。而ST10S、ST40、ST84三株菌虽携带98 600 000大质粒、但杂交试验证实此三株菌不含Cm耐药基因，表现为对Cm敏感。另2株无质粒的菌株(ST62、ST281)结果与此相同。由此可知，只有携带有Cm基因且表达CAT者，才表现为耐药。
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关于伤寒杆菌的耐药机制研究已表明细菌的耐药性主要由质粒介导，并通过细菌间的接合进行质粒的转移，而染色体介导伤寒杆菌耐Cm的情况作者尚未见报道。本实验证明Cm耐药基因位于质粒上，但有些菌株则位于染色体上或质粒、染色体均存在。Gennimata等[9]曾在金黄色葡萄球菌耐Bleomycin的基因研究时发现该基因可同时存在于质粒和染色体上。对这一现象的出现原因不明，可能是由转座子(Tn)所为。在实验中发现ST80菌株质粒和染色体均有Cm耐药基因，且表现为耐药，这类ST的耐药是由质粒介导、染色体介导还是二者共同介导，尚需进一步的实验证实。ST31、ST39的质粒和染色体虽含有耐Cm基因，但CAT为阴性，MIC亦显示对Cm敏感，为什么会出现这种情况?可能原因为(1) 自然状态下，有时耐药基因可以不表达。(2) 细菌染色体上自发突变，隐蔽基因的去阻遏可使耐药性发生变化。(3) 耐药基因所在转座子上的调节区基因的变化也可使此耐药基因不表达[10]。关于耐药基因表达问题虽然已有较多的研究但还有很多问题尚未解决。
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另外从酶切图谱及Southern blot结果显示ST质粒与染色体杂交带均分别位于4.3kb与5.2kb片段，显示具有高度同源性，可为ST耐药菌株的分子流行病学监测提供参考，而DB3511染色体的酶切片段，则与伤寒杆菌不同。Cm耐药基因位于3.4kb处，说明了DB与ST菌种间染色体组成的差异。
本课题受国家自然科学基金会资助(39270038)
参考文献
1 黄瑞，穆荣普.耐药伤寒菌耐药质粒的研究.中华传染病杂志，1990，8：139-142.
2 李忠花，刘晓霞.沙门氏菌耐药性与外膜蛋白关系的研究.中华传染病杂志，1995，13：81-84.
3 Doss SA.Chromosomally-mediated antibiotic resistance and virulence.J Med Microbial,1994,305-306.
, http://www.100md.com
4 Azemun P,Stull T.Rapid detection of chloramphenicol resistance in Haemophilus influenzae.Antimicrob agents Chemother,1981,20:168-170.
5 李影林，主编.临床微生物学及检验.第1版.北京：人民卫生出版社，1995.142-144.
6 Birnboim HC,Doly JA.Rapid alkaline extraction procedure for secreening recombiant plasmid DNA.Nucleic Acid Research,1979,7:1513-1523.
7 卢圣栋，主编.现代分子生物学实验技术.第1版.北京：高等教育出版社，1993.107-108.
, 百拇医药
8 Southern EM.Detection of specific sequences among DNA fragments separted by gel electrophoresis.J Mol Biol,1975,98:503-517.
9 Gennimata D,Davies J,Tsiftsoglou AS.Resistence in Staphylococcus aureus clinical isolates.J Antimicrob Chemother,1996,37:65-75.
10 林万明，主编.临床基因探针诊断实验技术.第1版.上海：上海科学技术出版社，1993.313-317.
(收稿：1997-07-29 修回：1998-04-19), http://www.100md.com
单位：215007 苏州医学院(孙宪锋，研究生)
关键词：沙门菌，伤寒；质粒；染色体；氯霉素乙酰转移酶；抗药性
中华传染病杂志980402 【摘要】 目的 探讨伤寒沙门菌耐药基因的定位。方法 32P随机引物标记氯霉素耐药基因为探针，以Slot blot、Southern blot法检测，同时以氯霉素乙酰转移酶活性(CAT)和药敏试验(MIC)作为耐药标志。结果 16株伤寒菌中有14株含98 600 000大质粒。经杂交，其中7株质粒阳性；1株染色体阳性；3株质粒与染色体均为阳性。质粒杂交带位于4.3kb片段，染色体为5.2kb片段。结论 伤寒菌耐氯霉素基因大部分位于98 600 000大质粒上，少数位于染色体上或两者兼有。
The detection and location of drug resistant gene in Salmonella typhi Sun Xianfeng,Liu Xiaoxia.Department of Microbiology,Suzhou Medical College,Suzhou 215007
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【Abstract】 Objective In order to probe the location of drug resistance-gene of Salmonella typhi.Methods Detection was carried out by slot blot and southern blot,using Cm-resistance gene labeled with 32P by random primed method as the probe.CAT and MIC were exploited as the marker of drug resistance.Results In sixteen S.T strains,fourteen Strains had one 98 600 000 plasmid.Using hybridization method,we found out that 7 of the 14 strains plasmids were positive.While chromosome was positive for 1 strain.Both plasmid and chromosome were positive for 3 strains.The molecular weights of the hybridization positive fragments of plasmid and chromosome were 4.3kb and 5.2kb,respectively.Conclusion: The Cm-resistance gene of S.T are mainly located on the 98 600 000 plasmid.However,some of them are located on chromosome or on both chromosome and plasmid.
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【Key words】 Salmonella typhi Plasmids Chromosome Chloramphenicol acetyltransferase Drug resistance
伤寒沙门菌(ST)的耐药由R质粒介导的观点已基本被确认，其通过细菌间质粒的接合传递造成流行。黄瑞等[1]连续五年对伤寒沙门菌耐药质粒进行了监测，发现细菌耐药株均含一个98 600 000大质粒，敏感株则为阴性。然而自1989年以后，耐药菌株明显下降，同时出现少量98 600 000质粒阳性的敏感株。这提示细菌耐药的表达方式不止一种，伤寒杆菌的耐药性与外膜蛋白(OMP)关系的研究[2]也显示OMP的缺失、减少与耐药性有关，但与质粒无正相关，所以关于耐药性还有许多问题有待解决。目前国内外对R质粒介导的耐药性研究较多，而染色体对耐药性的影响尚未引起足够的重视[3]。本实验利用分子杂交手段以氯霉素(Cm)对伤寒沙门菌进行耐药基因定位研究，以进一步了解伤寒沙门菌耐药机制。
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材料与方法
一、材料来源
(一) 菌株 从各年度临床收集的菌株中选出16株伤寒沙门菌及1株痢疾杆菌(DB3511)；药敏试验质量控制对照菌株为大肠杆菌ATCC25922，金黄色葡萄球菌ATCC25923和铜绿色假单胞菌ATCC27853；PACYC184大肠杆菌含Cm、四环素耐药基因用于制备探针(由军事医学科学院陈添弥教授惠赠)。
(二) 抗生素 氯霉素、四环素、氨苄青霉素、头孢拉啶(北京药品生物制品检定所)、壮观霉素(SP，美国The upjohn Co.)。
(三) 生物制剂 限制性核酸内切酶：EcoRI、Scal(华美生物工程公司产品)，核酸分子量参照物：λDNA/Hind Ⅲ Markers、随机引物标记试剂盒(Prime-a-Gene Labeling System，Promega公司产品)、α-32P-d ATP(北京福瑞公司产品)。
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二、方法
(一) 药敏试验 采用平板稀释法。试验时用标准的参考对照菌株与检测菌株平行测定药敏结果，实行质控。
(二) 氯霉素乙酰转移酶(CAT)活性检测 采用快速CAT活性检测法[4]。
(三) 质粒提取 参照Takahashi法。
(四) 染色体DNA的提取 按文献[5]进行。
(五) 氯霉素耐药基因探针的制备
1. 探针提取 用含药(四环素40μg/ml Cm40μg/ml壮观霉素50μg/ml)选择培养基培养PACYC184菌株，采用碱裂解法[6]提取。
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2. 限制性内切酶分析 参照PACYC184遗传图，选用EcoRI和ScaI两种限制性核酸内切酶对PACYC184质粒进行酶切，将质粒切成二个片段，分别为3830bp及414bp，氯霉素耐药基因存在于小片段中，取该段DNA作为探针。
3. DNA回收 凝胶电泳后，在366nm紫外光下将探针片段切下，在Parafilm上切碎，放入eppendorf管加等量TE及等体积的酚，混匀，液氮冷冻5分钟，离心取上清，加无水乙醇沉淀，75%乙醇脱盐，最后溶解在去离子双蒸水中。
(六) DNA探针标记及限制性核酸内切酶分析 待测质粒及染色体均采用EcoRI酶切，用随机引物标记法进行探针的32P标记。
(七) Slot blot[7] 样品DNA(10μl、0.75～1μg)100℃煮沸5分钟变性，放入冰中5分钟。加样，真空抽干，80℃干燥，放入保鲜膜中。然后预杂交、杂交、洗膜、放射自显影。
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(八) Southern blot[8] 将酶切的待检质粒及染色体在1.2%的琼脂糖凝胶上与Markers一起电泳，50V 24小时，溴乙锭染色后照相。然后进行转移、预杂交、杂交、洗膜、放射性自显影。
结果
一、药物敏感试验(MIC)
对16株伤寒沙门菌及1株痢疾杆菌进行了4种抗生素的MIC检测。16株伤寒杆菌中有9株耐Cm，1株痢疾杆菌耐Cm。
二、氯霉素乙酰转移酶活性测定
凡耐Cm菌株，CAT活性均为阳性。
三、质粒检测
16株伤寒菌中，有14株检出98 600 000大质粒；1株痢疾杆菌不含98 600 000大质粒，但有四个小质粒，分别为3 000 000、2 200 000、1 900 000、1 600 000。
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四、Slot blot
14株有98 600 000质粒的伤寒杆菌中有10株质粒杂交阳性，4株阴性。根据Slot blot质粒杂交结果，结合CAT及MIC选择8株做了染色体的Slot blot，其中有4株染色体杂交阳性，4株阴性。1株痢疾杆菌质粒杂交阴性，而染色体杂交阳性，结果见图1。
质粒：A.ST3 B.ST6 C.ST8 D.ST10R E.ST10S F.ST11 G.ST31H.ST39 I.ST80 J.ST81 K.ST84 L.DB3511 M.ST86 N.PACYC184 染色体：A′.ST10S B′.ST11 C′.ST31 D′.ST39 E′.ST40 F′.ST62 G′.ST80 H′.DB3511 I′.ST281 J′.PACYC184
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图1 伤寒杆菌和痢疾杆菌质粒和染色体狭缝杂交结果
五、Southern blot
根据Slot blot结果，选出4株质粒和染色体杂交阳性的伤寒杆菌(ST10R、ST31、ST39、ST80)及1株痢疾杆菌(DB3511)做质粒和染色体的Southern blot，以观察耐氯霉素基因的位置。由结果可知，伤寒菌的质粒、染色体经过EcoRI酶切后，杂交阳性带各均处于一个水平，质粒杂交带为4.3kb，染色体杂交带为5.2kb；而DB3511染色体杂交带与伤寒杆菌的杂交带不处于一个水平，为3.4kb，见图2。Slot blot与Southern blot结果见附表。
讨论
1987～1988年间苏州地区出现伤寒杆菌耐药菌流行，其耐药性主要由一条分子量为98 600 000的大质粒所介导，可编码多种抗性，属不相容性IncC群，其酶切图谱与国外流行的HI群完全不同，说明近年国内流行的耐药伤寒菌与国外不同。1989～1991年，伤寒杆菌耐药菌株有下降趋势，同时出现了少量98 600 000质粒阳性的Cm敏感株。
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质粒：A.ST31 B.ST39 C.ST80 D.ST10R 染色体： E.ST31 F.ST39
G.ST80 H.DB3511 I.λDNA/HindⅢ Markers
图2 伤寒杆菌和痢疾杆菌质粒和染色体酶切图谱
附表 Slot blot和Southern blot结果 菌种
Slot blot
Southern blot
P
, 百拇医药 Ch
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Ch
ST10R
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P：质粒 Ch：染色体 ND：未做 本实验用氯霉素耐药基因片段制成的探针对1987～1991年间收集的伤寒杆菌的质粒和染色体进行了分子杂交检测，通过耐药基因定位以期了解耐药菌的流行规律。实验结果发现，14株有98 600 000质粒的伤寒菌有10株质粒杂交阳性，其中有7株都能产生CAT，表现为氯霉素的耐药，说明耐Cm是由质粒介导。另3株菌(ST31、ST39、ST80)质粒与染色体杂交均呈阳性，表明氯霉素耐药基因同时存在于质粒和染色体上。所不同的是ST80株CAT阳性，MIC检测为耐药；而ST31、ST39两株虽含Cm耐药基因，但CAT为阴性，药敏试验也表现为对氯霉素敏感。在质粒杂交阴性的4株菌中，ST11的染色体杂交结果呈阳性。表明ST11的Cm耐药基因不在98 600 000大质粒上，而是存在于染色体中，并由染色体编码产生CAT，表现为耐药。而ST10S、ST40、ST84三株菌虽携带98 600 000大质粒、但杂交试验证实此三株菌不含Cm耐药基因，表现为对Cm敏感。另2株无质粒的菌株(ST62、ST281)结果与此相同。由此可知，只有携带有Cm基因且表达CAT者，才表现为耐药。
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关于伤寒杆菌的耐药机制研究已表明细菌的耐药性主要由质粒介导，并通过细菌间的接合进行质粒的转移，而染色体介导伤寒杆菌耐Cm的情况作者尚未见报道。本实验证明Cm耐药基因位于质粒上，但有些菌株则位于染色体上或质粒、染色体均存在。Gennimata等[9]曾在金黄色葡萄球菌耐Bleomycin的基因研究时发现该基因可同时存在于质粒和染色体上。对这一现象的出现原因不明，可能是由转座子(Tn)所为。在实验中发现ST80菌株质粒和染色体均有Cm耐药基因，且表现为耐药，这类ST的耐药是由质粒介导、染色体介导还是二者共同介导，尚需进一步的实验证实。ST31、ST39的质粒和染色体虽含有耐Cm基因，但CAT为阴性，MIC亦显示对Cm敏感，为什么会出现这种情况?可能原因为(1) 自然状态下，有时耐药基因可以不表达。(2) 细菌染色体上自发突变，隐蔽基因的去阻遏可使耐药性发生变化。(3) 耐药基因所在转座子上的调节区基因的变化也可使此耐药基因不表达[10]。关于耐药基因表达问题虽然已有较多的研究但还有很多问题尚未解决。
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另外从酶切图谱及Southern blot结果显示ST质粒与染色体杂交带均分别位于4.3kb与5.2kb片段，显示具有高度同源性，可为ST耐药菌株的分子流行病学监测提供参考，而DB3511染色体的酶切片段，则与伤寒杆菌不同。Cm耐药基因位于3.4kb处，说明了DB与ST菌种间染色体组成的差异。
本课题受国家自然科学基金会资助(39270038)
参考文献
1 黄瑞，穆荣普.耐药伤寒菌耐药质粒的研究.中华传染病杂志，1990，8：139-142.
2 李忠花，刘晓霞.沙门氏菌耐药性与外膜蛋白关系的研究.中华传染病杂志，1995，13：81-84.
3 Doss SA.Chromosomally-mediated antibiotic resistance and virulence.J Med Microbial,1994,305-306.
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4 Azemun P,Stull T.Rapid detection of chloramphenicol resistance in Haemophilus influenzae.Antimicrob agents Chemother,1981,20:168-170.
5 李影林，主编.临床微生物学及检验.第1版.北京：人民卫生出版社，1995.142-144.
6 Birnboim HC,Doly JA.Rapid alkaline extraction procedure for secreening recombiant plasmid DNA.Nucleic Acid Research,1979,7:1513-1523.
7 卢圣栋，主编.现代分子生物学实验技术.第1版.北京：高等教育出版社，1993.107-108.
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8 Southern EM.Detection of specific sequences among DNA fragments separted by gel electrophoresis.J Mol Biol,1975,98:503-517.
9 Gennimata D,Davies J,Tsiftsoglou AS.Resistence in Staphylococcus aureus clinical isolates.J Antimicrob Chemother,1996,37:65-75.
10 林万明，主编.临床基因探针诊断实验技术.第1版.上海：上海科学技术出版社，1993.313-317.
(收稿：1997-07-29 修回：1998-04-19), http://www.100md.com