干细胞因子研究概述
作者：雷呈祥
单位：雷呈祥(军医学研究所，上海市 200433)
关键词：干细胞因子；造血；电离辐射▲
海军医学杂志000141 摘 要：干细胞因子(SCF)是一种重要的多功能细胞因子，它能刺激早期干细胞的增殖及定居，单用或伍用其它细胞因子能刺激造血集落细胞的增生、增大，为人类重要的造血生长因子之一，可应用于致死性急性照射后的造血恢复、放化治疗和骨髓功能衰竭后贫血及其它难治性贫血的治疗等。现已实现了SCF的基因克隆及基因工程表达。
1990年，在《细胞》杂志第65卷第1期上登载了多位研究者关于干细胞因子的文章。其 中有3个研究小组在各自的研究过程中，发现了干细胞生长因子。由于是从不同的组织中分 离得到该因子，因而分别被命名为肥大细胞生长因子(mast cell growth factor, MGF) [1]、干细胞因子(stem cell factor, SCF)[2]和c-kit受体配体(liga nd of the c-kit receptor, KL)[3]，现在通称干细胞因子。研究发现SCF是一 类刺激早期造血干细胞及祖细胞增殖和定居的造血生长因子，单用或伍用其它生长因子如GM -CSF、IL-3等时，能极大地促进造血细胞的增殖[4]，可用于治疗因放疗、化疗及 骨髓功能衰竭等引起的难治性贫血[5，6]，在抗急性辐射损伤及基因治疗等方面 也有较好的应用前景[7，8]。此后的几年中，国内外均有大量有关SCF的研究报 告，并已开展了Ⅲ期临床研究[9]。
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1 SCF的基因及蛋白结构
在Williams[1]等发现小鼠SCF后，又相继鉴定了人、小鼠和犬的SCF[2，3 ，10，11]，对其基因、cDNA、mRNA和蛋白作了详细的研究。小鼠、大鼠和人的SCF 和cDNA的同源性分别为95%和83%。其中小鼠SCF基因系由第10染色体上的青灰位点(steel lo cus, Sl)编码[3，6，12]，因此又被称为青灰因子(steel factor, SLF) [13]，人的SCF基因位于12q22-24。SCF基因至少有6个外显子，cDNA序列已测定，全 长543kb。
从动物组织中分离得到的SCF，大小约28～36kD[1，2]，而从SCF基因开放读码框 分析，蛋白约为18.5kD。其产生差异的原因可能是基因翻译后加工不同或糖基化程度不同。 用糖苷酶处理天然SCF，其分子量逐渐减小，完全处理后得到的SCF大小约18～19kD，与基因 分析所得到的SCF基本一致。
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天然SCF呈酸性，有可能存在二聚体。SCF在体内还表现为高度糖基化，但分析认为糖基化对 SCF来说可能并不是必需的，因为基因工程产品和天然SCF均具有相同的高生物活性[1 ，2]。蛋白结构如图1。
图1 干细胞因子蛋白结构示意图
SP：信号肽；TMS：跨膜区
在机体内，由于编码基因剪切位点不同，可翻译成两种蛋白，表现为膜型和可溶型 [2，3，14]。可溶型SCF由膜外区1～164位氨基酸组成，含有SCF主要生物学活性功 能区域。膜型SCF由248个氨基酸组成，包括23个疏水性氨基酸组成的跨膜区。膜型和可溶型 SCF功能没有明显不同。
2 克隆与表达
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天然SCF来源有限，难以大规模生产，不能满足日益增长的临床需要，因此实现SCF的基因工 程生产是一种必然的趋势。国内外已开展这方面的研究。
两种类型的SCF均具有刺激早期造血干细胞和祖细胞的功能。在SCF基因5’端有一编码25个 氨基酸信号肽的序列，3’端有编码83个氨基酸与膜结合有关的序列。为了在大肠杆菌中 表达有活性的SCF，通常不扩增3’端膜结合相关序列，也有不扩增5’段信号肽序列的 [15]。
在骨髓基质细胞和胸腺组织中有SCF mRNA，可通过逆转录PCR方法扩增出人SCF基因。但由于 组织细胞中的SCF mRNA较少，有时需进行2次PCR[15]。SCF基因也可以直接从真 核细胞基因文库筛选。已实现了SCF基因在大肠杆菌[16，17，18]、人造血 干/祖细胞[7]、杆状病毒[19]等中的表达，并证实其与天然SCF有着相 同的生物学活性。重组小鼠SCF对人的骨髓细胞有较好的作用，但重组人SCF对小鼠无作用。
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SCF的活性检测一般采用体外半固体CFU-GM培养方法，在含有一定量GM-CSF因子条件下，加 入不同浓度待测SCF及其标准品，依据SCF可以协同GM-CSF作用，促使CFU-GM集落生成的原理 ，间接检测SCF样品活性。可采用凝胶过滤柱、高压色谱或单克隆抗体免疫亲和柱等方法纯 化SCF[20]。
3 SCF的主要生理作用
在正常成年小鼠的骨髓基质细胞中可检测到SCF mRNA的存在，在胚胎小鼠的脑、脊髓、肺、 肝、肾、骨骼等组织中也发现有SCF的表达；在人的骨髓基质细胞和血清中能够检测到SCF， 其浓度水平相对高于其它的造血生长因子，例如粒细胞集落刺激因子G-CSF，粒-巨噬细胞集 落刺激因子GM-CSF等。说明SCF是正常哺乳动物维持生命所必需的[8，21，22] 。
SCF是跨膜酪氨酸激酶受体(c-kit receptor)的配体。c-kit受体由原癌基因c-kit编码， 属免疫球蛋白超基因家族。据认为，它在依赖基质细胞分化和增殖的造血细胞(如原始生红 细胞系、祖细胞系等)形成过程中起重要作用。SCF与c-kit受体的相互协同作用在造血早期 是非常重要的。
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SCF作用于多系的造血细胞生长因子，它所作用的靶细胞比祖细胞更原始，是极早期的、具 有多向分化潜能的造血干细胞，如CD34+Lin+等，促使这类细胞由静止的、休 眠状态进入细胞周期或加快细胞周期的进程。SCF本身不刺激集落的生成，但与其它生长因 子(GM-CSF、G-CSF、Epo、IL-1,3,5,6,7,9等)有较好的协同作用，能促进多系造血细胞的 增殖与分化，生成各种定向祖细胞集落或使集落体积增大[23]。推测原因可能是 SCF增加了祖细胞对一些造血因子(如Epo,IL-3等)的敏感性，或是由于增加了早期祖细胞的 自我更新，也可能是使休止期细胞进入周期，或是延长了早期祖细胞的存活期[24， 25，26]。需要指出的是SCF对晚期造血细胞很少作用或无作用。
SCF对肥大细胞的发育和生存也有重要作用，在c-kit存在的情况下，还能调节肥大细胞细 胞因子的分泌，促进其释放IL-5，而较少分泌TNF-a。
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4 SCF的临床意义
4.1 SCF与造血
SCF作为造血类生长因子，与其它因子有较好的协同作用，特别是对早期造血细胞的发育生 长有重要作用。
在液体培养体系中，SCF与IL-1和IL-3联合对造血细胞扩增有协同作用，并且体外扩增后的 骨髓细胞能加速移植受体的早期造血重建。
动物实验证实低剂量SCF与G-CSF伍用有协同作用，可增加外周血造血祖细胞(PBPC)、CFU-GM 和HPP-CIC数量。5～20μg/kg SCF加10μg.kg-1.d-1G-CSF可增加PBPC中有 核细胞、CFU-GM及CD34+细胞的数量。该作用比单用G-CSF或单用SCF更强。G-CSF与 SCF伍用或单用SCF作为动员剂正在进行Ⅲ期临床研究[9]。
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4.2 SCF与电离辐射
SCF对受电离辐射照射后的动物或人的造血恢复具有非常明显的作用[27，28] 。Schuening在实验中共使用了41只比格狗，以60Co γ线全身照射，照射后2h开始 皮下注射重组狗SCF(rcSCF)或重组人G-CSF或二者伍用。结果rcSCF使10只400cGy照射狗50% 存活并获得完全而持久的造血恢复；2只受400cGy照射后给予rhG-CSF的狗存活1只并有完全 而持久的造血恢复。表明400cGy照射组给予这两种造血因子，效果相仿，但是SCF使血小板 的恢复加速，推测是由于SCF作用于较早阶段的造血祖细胞，从而使中性粒细胞和血小板都 加速恢复。
以下是另外一部分实验数据[8]。
小鼠：在照射前20h和4h以及照射后4h各在皮下注射一次SCF，能使受全身一次照射9、10、1 1Gy的小鼠分别存活95%、75%和4%，而3个对照组均为0。
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犬：于全身照射后2h开始每天注射2次SCF，共21d。4Gy照射组10只犬存活5只，5Gy照射组 7只犬存活2只。对照组28只犬仅存活1只。
灵长类：每天给狒狒皮下注射SCF共11d，然后收集其外周血单个核细胞冷冻保存；休息1个 月后，以γ线全身照射10.2Gy，并于照射后立即回输自体单个核细胞，3只狒狒存活2只，对 照组4只全部死亡。
考虑到以上结果，我们推测，如果编码SCF或其受体的基因发生突变或者用抗体等抑制其作 用，小鼠对辐射的敏感性应大为提高，实验也证实了这一点。全身一次照射的突变小鼠，半 致死剂量降为3Gy(正常为7Gy)，绝对致死剂量则为2Gy(正常为8Gy)；正常小鼠受照2h后 ，腹腔一次性注射SCF抗体，存活率由对照组的53%降低到0，而且死亡时间也由对照组的15. 5±2.8d缩短到13.0±1.2d。
从以上实验数据看，SCF单用或伍用其它生长因子或抗放药，具有良好的抗放作用，且效价 高、作用时间长、无副作用，兼有预防和治疗的作用。
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4.3 SCF与肿瘤
SCF是原癌基因c-kit受体的配体，而在肿瘤细胞中也曾检测到c-kit受体和SCF[29 ]，那么，SCF是不是会刺激肿瘤细胞的增长呢?Shui等[30]的研究结果表明， 体内SCF不刺激肿瘤细胞的增长，也不增加受照肿瘤细胞的幸存数量。
奚永志等[31]研究了SCF单用或伍用IL3、IL5和GM-CSF对LT12白血病造血的体外 调控效应。结果发现，SCF可直接抑制LT12细胞的CFU-L集落形成、DNA合成及增殖动力，并 认为，在BNML大鼠白血病造血中，SCF具有两种不同的生物效应，即既能有效地刺激正常造 血，又可抑制白血病造血。
骨髓增生异常综合征(myelodysplastic syndromes, MDS)是发生在多潜能造血干细胞阶段的 异质性克隆性疾病，以造血细胞不可逆的质量和数量异常为特点，表现为感染或出血及较高 的白血病转化率。MDS CD34+细胞在增殖分化过程中存在一定程度缺陷，单独应用 生长因子不能有效地改善其缺陷，SCF与GM-CSF、IL-3、Epo等生长因子的联合应用可提高一 部分患者造血祖细胞的集落形成能力，但在MDS高危组，部分患者在正常集落形成能力改善 的同时，白血病细胞集落也有不同程度的增长。
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由于SCF与各系造血细胞生长发育密切相关，且与多种细胞因子具有协同作用，因而SCF在治 疗某些顽固性贫血及抗辐射方面表现出较好的应用价值，而且在哺乳动物模型中长期(28d) 作用SCF，亦未发现毒副作用。因而我们有理由相信，SCF在临床医学上有广泛的应用前景。
参考文献：
[1]Williams DE, Eisenman J, Baird C et al. Identification o f a ligand for the c-kit proto-oncogene. Cell, 1990, 63:167
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收稿日期：1999-06-18, http://www.100md.com
单位：雷呈祥(军医学研究所，上海市 200433)
关键词：干细胞因子；造血；电离辐射▲
海军医学杂志000141 摘 要：干细胞因子(SCF)是一种重要的多功能细胞因子，它能刺激早期干细胞的增殖及定居，单用或伍用其它细胞因子能刺激造血集落细胞的增生、增大，为人类重要的造血生长因子之一，可应用于致死性急性照射后的造血恢复、放化治疗和骨髓功能衰竭后贫血及其它难治性贫血的治疗等。现已实现了SCF的基因克隆及基因工程表达。
1990年，在《细胞》杂志第65卷第1期上登载了多位研究者关于干细胞因子的文章。其 中有3个研究小组在各自的研究过程中，发现了干细胞生长因子。由于是从不同的组织中分 离得到该因子，因而分别被命名为肥大细胞生长因子(mast cell growth factor, MGF) [1]、干细胞因子(stem cell factor, SCF)[2]和c-kit受体配体(liga nd of the c-kit receptor, KL)[3]，现在通称干细胞因子。研究发现SCF是一 类刺激早期造血干细胞及祖细胞增殖和定居的造血生长因子，单用或伍用其它生长因子如GM -CSF、IL-3等时，能极大地促进造血细胞的增殖[4]，可用于治疗因放疗、化疗及 骨髓功能衰竭等引起的难治性贫血[5，6]，在抗急性辐射损伤及基因治疗等方面 也有较好的应用前景[7，8]。此后的几年中，国内外均有大量有关SCF的研究报 告，并已开展了Ⅲ期临床研究[9]。
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1 SCF的基因及蛋白结构
在Williams[1]等发现小鼠SCF后，又相继鉴定了人、小鼠和犬的SCF[2，3 ，10，11]，对其基因、cDNA、mRNA和蛋白作了详细的研究。小鼠、大鼠和人的SCF 和cDNA的同源性分别为95%和83%。其中小鼠SCF基因系由第10染色体上的青灰位点(steel lo cus, Sl)编码[3，6，12]，因此又被称为青灰因子(steel factor, SLF) [13]，人的SCF基因位于12q22-24。SCF基因至少有6个外显子，cDNA序列已测定，全 长543kb。
从动物组织中分离得到的SCF，大小约28～36kD[1，2]，而从SCF基因开放读码框 分析，蛋白约为18.5kD。其产生差异的原因可能是基因翻译后加工不同或糖基化程度不同。 用糖苷酶处理天然SCF，其分子量逐渐减小，完全处理后得到的SCF大小约18～19kD，与基因 分析所得到的SCF基本一致。
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天然SCF呈酸性，有可能存在二聚体。SCF在体内还表现为高度糖基化，但分析认为糖基化对 SCF来说可能并不是必需的，因为基因工程产品和天然SCF均具有相同的高生物活性[1 ，2]。蛋白结构如图1。
图1 干细胞因子蛋白结构示意图
SP：信号肽；TMS：跨膜区
在机体内，由于编码基因剪切位点不同，可翻译成两种蛋白，表现为膜型和可溶型 [2，3，14]。可溶型SCF由膜外区1～164位氨基酸组成，含有SCF主要生物学活性功 能区域。膜型SCF由248个氨基酸组成，包括23个疏水性氨基酸组成的跨膜区。膜型和可溶型 SCF功能没有明显不同。
2 克隆与表达
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天然SCF来源有限，难以大规模生产，不能满足日益增长的临床需要，因此实现SCF的基因工 程生产是一种必然的趋势。国内外已开展这方面的研究。
两种类型的SCF均具有刺激早期造血干细胞和祖细胞的功能。在SCF基因5’端有一编码25个 氨基酸信号肽的序列，3’端有编码83个氨基酸与膜结合有关的序列。为了在大肠杆菌中 表达有活性的SCF，通常不扩增3’端膜结合相关序列，也有不扩增5’段信号肽序列的 [15]。
在骨髓基质细胞和胸腺组织中有SCF mRNA，可通过逆转录PCR方法扩增出人SCF基因。但由于 组织细胞中的SCF mRNA较少，有时需进行2次PCR[15]。SCF基因也可以直接从真 核细胞基因文库筛选。已实现了SCF基因在大肠杆菌[16，17，18]、人造血 干/祖细胞[7]、杆状病毒[19]等中的表达，并证实其与天然SCF有着相 同的生物学活性。重组小鼠SCF对人的骨髓细胞有较好的作用，但重组人SCF对小鼠无作用。
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SCF的活性检测一般采用体外半固体CFU-GM培养方法，在含有一定量GM-CSF因子条件下，加 入不同浓度待测SCF及其标准品，依据SCF可以协同GM-CSF作用，促使CFU-GM集落生成的原理 ，间接检测SCF样品活性。可采用凝胶过滤柱、高压色谱或单克隆抗体免疫亲和柱等方法纯 化SCF[20]。
3 SCF的主要生理作用
在正常成年小鼠的骨髓基质细胞中可检测到SCF mRNA的存在，在胚胎小鼠的脑、脊髓、肺、 肝、肾、骨骼等组织中也发现有SCF的表达；在人的骨髓基质细胞和血清中能够检测到SCF， 其浓度水平相对高于其它的造血生长因子，例如粒细胞集落刺激因子G-CSF，粒-巨噬细胞集 落刺激因子GM-CSF等。说明SCF是正常哺乳动物维持生命所必需的[8，21，22] 。
SCF是跨膜酪氨酸激酶受体(c-kit receptor)的配体。c-kit受体由原癌基因c-kit编码， 属免疫球蛋白超基因家族。据认为，它在依赖基质细胞分化和增殖的造血细胞(如原始生红 细胞系、祖细胞系等)形成过程中起重要作用。SCF与c-kit受体的相互协同作用在造血早期 是非常重要的。
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SCF作用于多系的造血细胞生长因子，它所作用的靶细胞比祖细胞更原始，是极早期的、具 有多向分化潜能的造血干细胞，如CD34+Lin+等，促使这类细胞由静止的、休 眠状态进入细胞周期或加快细胞周期的进程。SCF本身不刺激集落的生成，但与其它生长因 子(GM-CSF、G-CSF、Epo、IL-1,3,5,6,7,9等)有较好的协同作用，能促进多系造血细胞的 增殖与分化，生成各种定向祖细胞集落或使集落体积增大[23]。推测原因可能是 SCF增加了祖细胞对一些造血因子(如Epo,IL-3等)的敏感性，或是由于增加了早期祖细胞的 自我更新，也可能是使休止期细胞进入周期，或是延长了早期祖细胞的存活期[24， 25，26]。需要指出的是SCF对晚期造血细胞很少作用或无作用。
SCF对肥大细胞的发育和生存也有重要作用，在c-kit存在的情况下，还能调节肥大细胞细 胞因子的分泌，促进其释放IL-5，而较少分泌TNF-a。
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4 SCF的临床意义
4.1 SCF与造血
SCF作为造血类生长因子，与其它因子有较好的协同作用，特别是对早期造血细胞的发育生 长有重要作用。
在液体培养体系中，SCF与IL-1和IL-3联合对造血细胞扩增有协同作用，并且体外扩增后的 骨髓细胞能加速移植受体的早期造血重建。
动物实验证实低剂量SCF与G-CSF伍用有协同作用，可增加外周血造血祖细胞(PBPC)、CFU-GM 和HPP-CIC数量。5～20μg/kg SCF加10μg.kg-1.d-1G-CSF可增加PBPC中有 核细胞、CFU-GM及CD34+细胞的数量。该作用比单用G-CSF或单用SCF更强。G-CSF与 SCF伍用或单用SCF作为动员剂正在进行Ⅲ期临床研究[9]。
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4.2 SCF与电离辐射
SCF对受电离辐射照射后的动物或人的造血恢复具有非常明显的作用[27，28] 。Schuening在实验中共使用了41只比格狗，以60Co γ线全身照射，照射后2h开始 皮下注射重组狗SCF(rcSCF)或重组人G-CSF或二者伍用。结果rcSCF使10只400cGy照射狗50% 存活并获得完全而持久的造血恢复；2只受400cGy照射后给予rhG-CSF的狗存活1只并有完全 而持久的造血恢复。表明400cGy照射组给予这两种造血因子，效果相仿，但是SCF使血小板 的恢复加速，推测是由于SCF作用于较早阶段的造血祖细胞，从而使中性粒细胞和血小板都 加速恢复。
以下是另外一部分实验数据[8]。
小鼠：在照射前20h和4h以及照射后4h各在皮下注射一次SCF，能使受全身一次照射9、10、1 1Gy的小鼠分别存活95%、75%和4%，而3个对照组均为0。
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犬：于全身照射后2h开始每天注射2次SCF，共21d。4Gy照射组10只犬存活5只，5Gy照射组 7只犬存活2只。对照组28只犬仅存活1只。
灵长类：每天给狒狒皮下注射SCF共11d，然后收集其外周血单个核细胞冷冻保存；休息1个 月后，以γ线全身照射10.2Gy，并于照射后立即回输自体单个核细胞，3只狒狒存活2只，对 照组4只全部死亡。
考虑到以上结果，我们推测，如果编码SCF或其受体的基因发生突变或者用抗体等抑制其作 用，小鼠对辐射的敏感性应大为提高，实验也证实了这一点。全身一次照射的突变小鼠，半 致死剂量降为3Gy(正常为7Gy)，绝对致死剂量则为2Gy(正常为8Gy)；正常小鼠受照2h后 ，腹腔一次性注射SCF抗体，存活率由对照组的53%降低到0，而且死亡时间也由对照组的15. 5±2.8d缩短到13.0±1.2d。
从以上实验数据看，SCF单用或伍用其它生长因子或抗放药，具有良好的抗放作用，且效价 高、作用时间长、无副作用，兼有预防和治疗的作用。
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4.3 SCF与肿瘤
SCF是原癌基因c-kit受体的配体，而在肿瘤细胞中也曾检测到c-kit受体和SCF[29 ]，那么，SCF是不是会刺激肿瘤细胞的增长呢?Shui等[30]的研究结果表明， 体内SCF不刺激肿瘤细胞的增长，也不增加受照肿瘤细胞的幸存数量。
奚永志等[31]研究了SCF单用或伍用IL3、IL5和GM-CSF对LT12白血病造血的体外 调控效应。结果发现，SCF可直接抑制LT12细胞的CFU-L集落形成、DNA合成及增殖动力，并 认为，在BNML大鼠白血病造血中，SCF具有两种不同的生物效应，即既能有效地刺激正常造 血，又可抑制白血病造血。
骨髓增生异常综合征(myelodysplastic syndromes, MDS)是发生在多潜能造血干细胞阶段的 异质性克隆性疾病，以造血细胞不可逆的质量和数量异常为特点，表现为感染或出血及较高 的白血病转化率。MDS CD34+细胞在增殖分化过程中存在一定程度缺陷，单独应用 生长因子不能有效地改善其缺陷，SCF与GM-CSF、IL-3、Epo等生长因子的联合应用可提高一 部分患者造血祖细胞的集落形成能力，但在MDS高危组，部分患者在正常集落形成能力改善 的同时，白血病细胞集落也有不同程度的增长。
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由于SCF与各系造血细胞生长发育密切相关，且与多种细胞因子具有协同作用，因而SCF在治 疗某些顽固性贫血及抗辐射方面表现出较好的应用价值，而且在哺乳动物模型中长期(28d) 作用SCF，亦未发现毒副作用。因而我们有理由相信，SCF在临床医学上有广泛的应用前景。
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收稿日期：1999-06-18, http://www.100md.com