钙离子选择性微电极直接测试人牙菌斑Ca2＋的初步探讨
作者：刘鲁川 温秀杰 岳松龄 吕太平
单位：刘鲁川(第三军医大学附属大坪医院野战外科研究所口腔科，重庆400042)；温秀杰(第三军医大学附属大坪医院野战外科研究所口腔科，重庆400042)；岳松龄(华西医科大学口腔医学院、药学院，成都 610041)；吕太平(华西医科大学口腔医学院、药学院，成都 610041)
关键词：钙离子选择性微电极；菌斑；测试
第三军医大学学报000224
提要 目的：评价钙离子选择性微电极(Ca2+-ISME)对 原位牙菌斑Ca2+检测、分析的可行性及其意义。方法：采用自制的中性载体Ca2+-ISME直接测试牙菌斑中的 Ca2+，并对Ca2+-ISME进行了进一步的改进。结果：聚氯乙烯毛细管与玻璃毛细管制备的电极具有类似的 性能，但在牙菌斑Ca2+的测试中电位显示不稳定，波动幅度大，重复性差。结论：Ca2+-ISME用于原位牙菌斑Ca2+的测试尚有许多问题有待解决。
, 百拇医药
中图法分类号R781.102;R781.202 文献标识码A
文章编号：1000-5404(2000)02-0180-02
Direct measurement of Ca2+ in human plaque with calcium ion-selective microelectrodes
LIU Lu-chuan, WEN Xiu-jie, YUE Song-ling, LU Tai-ping
(Department of Stomatology, Daping Hospital,Third Military Medical University, Chongqing 400042)
Abstract Objective: To evaluate the feasibility and significance of calcium ion-selective microelectrodes (Ca2+-ISME) in measurement of Ca2+ of in situ human plaque. Methods: The Ca2+-ISME was improved and used in direct measurement of Ca2+ in human plaque. Results: The properties of measurement with both polyvinyl chloride and glass capillary electrodes were similar. However, the application of direct measurement of Ca2+ was not ideal in this study. Conclusion: Many problems remain to be solved in using Ca2+- ISME to measure Ca2+in human plaque.
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Key words calcium ion-selective microelectrode; plaque; measurement
1 材料与方法
龋病的发病机制是一复杂的过程，其形成是以牙体 硬组织的脱矿为特征。牙菌斑是致龋过程中必不可 少的生态环境，过去主要以牙菌斑中pH值的改变作为 评估牙菌斑活性的指标。但仅此为依据尚不足以反 映牙菌斑微生态代谢的实际情况，因为其中的无机 离子(尤其是Ca2+)的动态变化也是主要的影响因素。 曾有学者[1]对牙菌斑中的Ca2+与pH、Ca2+与龋病的关系 作过一些有益的探讨，但多是在离体情况下的间接 分析，目前对菌斑Ca2+的在位分析尚是一项空白。本 研究拟采用自制钙离子选择性微电极(Ca2+-ISME)直接 测试人牙菌斑中的Ca2+活度，探讨其在在体状态下应 用的可行性及其意义，以期为全面、真实反映牙菌 斑致龋病寻求更好的途径。
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1.1 Ca2+-ISME的制备
1.1.1 微型玻璃毛细管Ca2+-ISME的制作 采用中性载体 ETH1001(FlukaAG,Switzerland)作为敏感膜材料，制作方法参见文献[2]。
1.1.2 聚氯乙烯毛细管Ca2+-ISME的制作 取洁净聚氯乙 烯空心管(内径0.5mm)在微火上加热到适当软硬度，手 拉制成尖端直径约0.1～0.5mm的细管，所用敏感膜的配 方及方法同玻璃毛细管电极，但采用先灌膜的方法 ，膜厚度控制在100～200μm，待膜中四氢呋喃挥发数小 时后再从毛细管后端灌注内充液。
1.1.3 Ca2+-ISME的性能测试 对2种不同毛细管制成的Ca2+ -ISME进行各项性能测试，测试方法参见文献[2]。筛选 出性能较佳的Ca2+-ISME用作原位牙菌斑Ca2+的检测。收集10例成人唾液(本校大学生)，用2种毛细管制成 的微电极分别测试唾液Ca2+含量，并作对比分析。
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1.2 实验牙齿和受试者的选择
1.2.1 离体牙菌斑中Ca2+的检测 选择临床上牙周病患 者应拔除之松动牙齿，嘱患者24h内不刷牙，拔牙前 禁饮禁食2h。术者小心分离牙龈，钳夹牙齿时尽可能不损及 邻面的牙菌斑。拔除后立即置于密闭瓶中送实验室 测试菌斑Ca2+。
1.2.2 在体牙菌斑中Ca2+的测试 选择无明显龋病、牙周病的本实验室工作人员，先测试受试者唾液Ca2+后 再行邻面牙菌斑Ca2+测试，以作对比分析。将Ca2+-ISME指示电极和微型参比电极与SWT-1型高阻抗微电极 放大器(成都仪器厂)连接。瞩受试者将左手食指浸入 含3mol/LKCl溶液的烧杯中，杯中插有参比电极，通过建 立的盐桥形成测量体系。测试前固定受试者头部，口腔中用纱布块隔湿，轻轻蘸干测试位点上多余的 唾液。操作者分别将玻璃毛细管和聚氯乙烯毛细管 Ca2+-ISME直接插于受试者左、右上颌第一前磨牙与第二前磨牙邻面菌斑中，尽可能靠近邻面接触点，测量其电位变化。
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2 结果
2.1 微型玻璃毛细管与聚氯乙烯毛细管Ca2+-ISME测试成人唾液Ca2+结果
玻璃毛细管测定结果为(0.723±0.116)mmol/L，聚氯乙烯毛 细管测定结果为(0.743±0.089)mmol/L，配对t检验，P>0.05，2种 微电极测试唾液Ca2+无显著性差异。
2.2 微型玻璃毛细管测试菌斑Ca2+
结果显示：①测试唾液Ca2+时电位稳定；而在离体 牙菌斑和口内原位菌斑测试中，电位显示极不稳定 ，波动幅度大；②微型玻璃毛细管Ca2+-ISME尖端细小 ，在肉眼下进行口腔内操作时极易碰折破损；③操 作者固定指示电极，并保持其稳定较困难。因此， 不能准确记录牙菌斑中的电位显示数值。
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2.3 聚氯乙烯毛细管Ca2+-ISME测试菌斑Ca2+
聚氯乙烯毛细管Ca2+-ISME用于口腔原位和离体牙菌 斑Ca2+的测试，解决了微电极易折断损坏的问题，但 测试中显示的电位波动较大，洗空白困难，重复性 差。
3 讨论
龋病的发生是致龋菌利用碳水化合物，在牙菌斑这 一特殊的生态环境下，通过发酵产酸造成牙齿硬组 织脱矿所致的结果。因此，Ca2+在口腔环境中的转换 是一必然过程，了解其规律和各种影响因素无疑对 探明龋病的发病机制，有效地进行龋病的防治具有 重要的意义。由于牙菌斑成分存在很大的个体差异 和部位差异，研究中尤应考虑单一位点上牙菌斑的 特征。而且龋病是一涉及多因素的疾病，随着研究 的深入，人们已认识到仅以pH改变来评估牙菌斑致龋 性的片面性，其依据是：不同的酸在从牙菌斑到釉 质的扩散能力是不同的；牙菌斑中的离子饱和度所 产生的趋动力对釉质脱矿起着致关重要的作用[3]。研 究还发现，饥饿菌斑是处于饱和状态，而且在无龋 部位更明显，说明其再矿化的程度更高。可见，对 牙菌斑矿物成份的分析也是了解其致龋力的重要指 标，尤其分析原位菌斑中的无机离子，是学者们关 注的课题[4～6]。
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鉴于玻璃毛细管在操作中出现的易碰损的问题，我 们采用聚氯乙烯毛细管制备Ca2+-ISME，经各项性能测 试以及检测唾液Ca2+的浓度对比看，两者无明显差异 ，但后者解决了口内操作电极易折断的问题是其可 取之处，但由于聚氯乙烯毛细管在拉制中的局限性 ，很难将其拉制到玻璃毛细管所能达到的直径，限 制了其在极微量样本分析中的应用。此外，聚氯乙 烯毛细管Ca2+-ISME保存时间也较玻璃毛细管微电极为 短，寿命仅在1周内，是值得注意的问题。
本实验将玻璃毛细管和聚氯乙烯毛细管Ca2+-ISME用 于离体或在体牙菌斑Ca2+的检测，结果显示，Ca2+-ISME用于直接测试牙菌斑Ca2+尚不成熟。究其主要原因 可能有：①牙菌斑成分复杂，其形态结构对Ca2+- ISME的测试环境有较大影响；②口腔中的干扰因素多 ；③在我们目前的实验条件下，尚不能将受试者置 于金属网屏闭中，因此外界干扰易于介入；④受试 者的手指、头部、口腔的活动均可直接影响电位的 稳定，操作者也较难固定测试电极；⑤肉眼直视的 情况下，难以准确判断电极是否插入菌斑中；⑥菌 斑中的蛋白等可能产生对微电极的毒性作用。由此 看来，Ca2+-ISME直接用于牙菌斑Ca2+的测试尚有许多 问题有待解决。
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基金项目：国家自然科学基金资助项目(39670784)
作者简介：刘鲁川(1957.1)，男，山东省单县人，博士，副教授，主要从事牙体、牙髓、牙周病学方面的研究，发表论文 20篇。电话：(023)68757738
参考文献
[1]刘鲁川.离子选择性微电极在龋病研究中的应用 [J].国外医学：口腔医学分册，1997，24(1)：27-30.
[2]刘鲁川，吕太平，岳松龄，等.钙离子选择性微电 极在口腔医学研究中应用的初步探讨[J].牙体、牙髓牙周病学杂志，1997，7(3)：158-161.
[3] Margolis H C, Moreno E C. Composition of pooled plaque fluid from Carise-free and Caries- positive indivduals following sucrose exposure[J]. J Dent Res,1992,71(11):1 776-1 784.
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[4] Margolis H C, Zhang Y P, Gewirtz A,et al. Cariogenic potential of pooled plaque fluid from exposed root surfaces in humans[J]. Archs oral Biol,1993,38(2):131-138.
[5] Vogel G L, Carey Cm, Chow L C, et al. Micyo-analysis of plaque fluid from single-site fasted plaque[J]. J Dent Res,1990,69(6):1 316-1 323.
[6] Tatevossian A. Facts and artefacts in research on human dental plaque fluid[J]. J Dent Res,1990,69(6):1 039-1 315.
收稿日期：1999-09-25；修回日期：1999-12-26, 百拇医药
单位：刘鲁川(第三军医大学附属大坪医院野战外科研究所口腔科，重庆400042)；温秀杰(第三军医大学附属大坪医院野战外科研究所口腔科，重庆400042)；岳松龄(华西医科大学口腔医学院、药学院，成都 610041)；吕太平(华西医科大学口腔医学院、药学院，成都 610041)
关键词：钙离子选择性微电极；菌斑；测试
第三军医大学学报000224
提要 目的：评价钙离子选择性微电极(Ca2+-ISME)对 原位牙菌斑Ca2+检测、分析的可行性及其意义。方法：采用自制的中性载体Ca2+-ISME直接测试牙菌斑中的 Ca2+，并对Ca2+-ISME进行了进一步的改进。结果：聚氯乙烯毛细管与玻璃毛细管制备的电极具有类似的 性能，但在牙菌斑Ca2+的测试中电位显示不稳定，波动幅度大，重复性差。结论：Ca2+-ISME用于原位牙菌斑Ca2+的测试尚有许多问题有待解决。
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中图法分类号R781.102;R781.202 文献标识码A
文章编号：1000-5404(2000)02-0180-02
Direct measurement of Ca2+ in human plaque with calcium ion-selective microelectrodes
LIU Lu-chuan, WEN Xiu-jie, YUE Song-ling, LU Tai-ping
(Department of Stomatology, Daping Hospital,Third Military Medical University, Chongqing 400042)
Abstract Objective: To evaluate the feasibility and significance of calcium ion-selective microelectrodes (Ca2+-ISME) in measurement of Ca2+ of in situ human plaque. Methods: The Ca2+-ISME was improved and used in direct measurement of Ca2+ in human plaque. Results: The properties of measurement with both polyvinyl chloride and glass capillary electrodes were similar. However, the application of direct measurement of Ca2+ was not ideal in this study. Conclusion: Many problems remain to be solved in using Ca2+- ISME to measure Ca2+in human plaque.
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Key words calcium ion-selective microelectrode; plaque; measurement
1 材料与方法
龋病的发病机制是一复杂的过程，其形成是以牙体 硬组织的脱矿为特征。牙菌斑是致龋过程中必不可 少的生态环境，过去主要以牙菌斑中pH值的改变作为 评估牙菌斑活性的指标。但仅此为依据尚不足以反 映牙菌斑微生态代谢的实际情况，因为其中的无机 离子(尤其是Ca2+)的动态变化也是主要的影响因素。 曾有学者[1]对牙菌斑中的Ca2+与pH、Ca2+与龋病的关系 作过一些有益的探讨，但多是在离体情况下的间接 分析，目前对菌斑Ca2+的在位分析尚是一项空白。本 研究拟采用自制钙离子选择性微电极(Ca2+-ISME)直接 测试人牙菌斑中的Ca2+活度，探讨其在在体状态下应 用的可行性及其意义，以期为全面、真实反映牙菌 斑致龋病寻求更好的途径。
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1.1 Ca2+-ISME的制备
1.1.1 微型玻璃毛细管Ca2+-ISME的制作 采用中性载体 ETH1001(FlukaAG,Switzerland)作为敏感膜材料，制作方法参见文献[2]。
1.1.2 聚氯乙烯毛细管Ca2+-ISME的制作 取洁净聚氯乙 烯空心管(内径0.5mm)在微火上加热到适当软硬度，手 拉制成尖端直径约0.1～0.5mm的细管，所用敏感膜的配 方及方法同玻璃毛细管电极，但采用先灌膜的方法 ，膜厚度控制在100～200μm，待膜中四氢呋喃挥发数小 时后再从毛细管后端灌注内充液。
1.1.3 Ca2+-ISME的性能测试 对2种不同毛细管制成的Ca2+ -ISME进行各项性能测试，测试方法参见文献[2]。筛选 出性能较佳的Ca2+-ISME用作原位牙菌斑Ca2+的检测。收集10例成人唾液(本校大学生)，用2种毛细管制成 的微电极分别测试唾液Ca2+含量，并作对比分析。
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1.2 实验牙齿和受试者的选择
1.2.1 离体牙菌斑中Ca2+的检测 选择临床上牙周病患 者应拔除之松动牙齿，嘱患者24h内不刷牙，拔牙前 禁饮禁食2h。术者小心分离牙龈，钳夹牙齿时尽可能不损及 邻面的牙菌斑。拔除后立即置于密闭瓶中送实验室 测试菌斑Ca2+。
1.2.2 在体牙菌斑中Ca2+的测试 选择无明显龋病、牙周病的本实验室工作人员，先测试受试者唾液Ca2+后 再行邻面牙菌斑Ca2+测试，以作对比分析。将Ca2+-ISME指示电极和微型参比电极与SWT-1型高阻抗微电极 放大器(成都仪器厂)连接。瞩受试者将左手食指浸入 含3mol/LKCl溶液的烧杯中，杯中插有参比电极，通过建 立的盐桥形成测量体系。测试前固定受试者头部，口腔中用纱布块隔湿，轻轻蘸干测试位点上多余的 唾液。操作者分别将玻璃毛细管和聚氯乙烯毛细管 Ca2+-ISME直接插于受试者左、右上颌第一前磨牙与第二前磨牙邻面菌斑中，尽可能靠近邻面接触点，测量其电位变化。
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2 结果
2.1 微型玻璃毛细管与聚氯乙烯毛细管Ca2+-ISME测试成人唾液Ca2+结果
玻璃毛细管测定结果为(0.723±0.116)mmol/L，聚氯乙烯毛 细管测定结果为(0.743±0.089)mmol/L，配对t检验，P>0.05，2种 微电极测试唾液Ca2+无显著性差异。
2.2 微型玻璃毛细管测试菌斑Ca2+
结果显示：①测试唾液Ca2+时电位稳定；而在离体 牙菌斑和口内原位菌斑测试中，电位显示极不稳定 ，波动幅度大；②微型玻璃毛细管Ca2+-ISME尖端细小 ，在肉眼下进行口腔内操作时极易碰折破损；③操 作者固定指示电极，并保持其稳定较困难。因此， 不能准确记录牙菌斑中的电位显示数值。
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2.3 聚氯乙烯毛细管Ca2+-ISME测试菌斑Ca2+
聚氯乙烯毛细管Ca2+-ISME用于口腔原位和离体牙菌 斑Ca2+的测试，解决了微电极易折断损坏的问题，但 测试中显示的电位波动较大，洗空白困难，重复性 差。
3 讨论
龋病的发生是致龋菌利用碳水化合物，在牙菌斑这 一特殊的生态环境下，通过发酵产酸造成牙齿硬组 织脱矿所致的结果。因此，Ca2+在口腔环境中的转换 是一必然过程，了解其规律和各种影响因素无疑对 探明龋病的发病机制，有效地进行龋病的防治具有 重要的意义。由于牙菌斑成分存在很大的个体差异 和部位差异，研究中尤应考虑单一位点上牙菌斑的 特征。而且龋病是一涉及多因素的疾病，随着研究 的深入，人们已认识到仅以pH改变来评估牙菌斑致龋 性的片面性，其依据是：不同的酸在从牙菌斑到釉 质的扩散能力是不同的；牙菌斑中的离子饱和度所 产生的趋动力对釉质脱矿起着致关重要的作用[3]。研 究还发现，饥饿菌斑是处于饱和状态，而且在无龋 部位更明显，说明其再矿化的程度更高。可见，对 牙菌斑矿物成份的分析也是了解其致龋力的重要指 标，尤其分析原位菌斑中的无机离子，是学者们关 注的课题[4～6]。
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鉴于玻璃毛细管在操作中出现的易碰损的问题，我 们采用聚氯乙烯毛细管制备Ca2+-ISME，经各项性能测 试以及检测唾液Ca2+的浓度对比看，两者无明显差异 ，但后者解决了口内操作电极易折断的问题是其可 取之处，但由于聚氯乙烯毛细管在拉制中的局限性 ，很难将其拉制到玻璃毛细管所能达到的直径，限 制了其在极微量样本分析中的应用。此外，聚氯乙 烯毛细管Ca2+-ISME保存时间也较玻璃毛细管微电极为 短，寿命仅在1周内，是值得注意的问题。
本实验将玻璃毛细管和聚氯乙烯毛细管Ca2+-ISME用 于离体或在体牙菌斑Ca2+的检测，结果显示，Ca2+-ISME用于直接测试牙菌斑Ca2+尚不成熟。究其主要原因 可能有：①牙菌斑成分复杂，其形态结构对Ca2+- ISME的测试环境有较大影响；②口腔中的干扰因素多 ；③在我们目前的实验条件下，尚不能将受试者置 于金属网屏闭中，因此外界干扰易于介入；④受试 者的手指、头部、口腔的活动均可直接影响电位的 稳定，操作者也较难固定测试电极；⑤肉眼直视的 情况下，难以准确判断电极是否插入菌斑中；⑥菌 斑中的蛋白等可能产生对微电极的毒性作用。由此 看来，Ca2+-ISME直接用于牙菌斑Ca2+的测试尚有许多 问题有待解决。
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基金项目：国家自然科学基金资助项目(39670784)
作者简介：刘鲁川(1957.1)，男，山东省单县人，博士，副教授，主要从事牙体、牙髓、牙周病学方面的研究，发表论文 20篇。电话：(023)68757738
参考文献
[1]刘鲁川.离子选择性微电极在龋病研究中的应用 [J].国外医学：口腔医学分册，1997，24(1)：27-30.
[2]刘鲁川，吕太平，岳松龄，等.钙离子选择性微电 极在口腔医学研究中应用的初步探讨[J].牙体、牙髓牙周病学杂志，1997，7(3)：158-161.
[3] Margolis H C, Moreno E C. Composition of pooled plaque fluid from Carise-free and Caries- positive indivduals following sucrose exposure[J]. J Dent Res,1992,71(11):1 776-1 784.
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[4] Margolis H C, Zhang Y P, Gewirtz A,et al. Cariogenic potential of pooled plaque fluid from exposed root surfaces in humans[J]. Archs oral Biol,1993,38(2):131-138.
[5] Vogel G L, Carey Cm, Chow L C, et al. Micyo-analysis of plaque fluid from single-site fasted plaque[J]. J Dent Res,1990,69(6):1 316-1 323.
[6] Tatevossian A. Facts and artefacts in research on human dental plaque fluid[J]. J Dent Res,1990,69(6):1 039-1 315.
收稿日期：1999-09-25；修回日期：1999-12-26, 百拇医药