珍稀中草药金线莲的RAPD研究
作者：胡珊梅 张启国 袁文杰 周涵韬 周兴旺 陈鹭真
单位：胡珊梅 张启国 袁文杰(厦门市药品检验所 厦门 361012)；周涵韬 周兴旺 陈鹭真(厦门大学生命科学学院)
关键词：RAPD；标记；金线莲；遗传异
中草药001234摘 要 为了鉴别金线莲的品种，探索同属植物之间的亲缘关系及同种 植物不同产地的遗传变异，并制定正品金线莲的 DNA 指纹图谱，采用随机扩增多态 DNA(RA PD)技术对兰科开唇兰属植物花叶开唇兰 Anoectochilus roxburghii(Wal l.).Lindl.、台湾开唇兰 A.formosanus Hay. 进行了鉴定，结果选 择的 7 个引物对 3 个品种 共扩增出 98 个位点，其中 3 个引物为高特异性引物。结论 RAPD 技术不仅能鉴别种间差 异，而且能揭示同种不同产地植物的遗传变异。
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Studies on Valuable and Rare Chinese Herbs Anoectochilu s roxburghii by
DNA Fingerprintings Using RAPD
Hu Shanmei Zhang Qiguo and Y uan Wenjie
(Xiamen Institute for Drug Control Xiamen 361012)
Zhou Hantao Zhou Xingwang and Chen Luzhen
(College of Life Science, Xiamen University)
Abstract In order to explore the consanguinity of plants of genus Anoectochilus Bl. (Orchidaceae), and to dis tinguish Anoectochilus roxburghii (Wall.) Lindl. from two diffe r ent localities, Fujian and Guangxi Province, and A. formosanys Hay as to their genetic variance, DNA fingerprintings were analysed with the ai d o f RAPD. Results showed that 7 primers amplified a total of 98 sites for the 3 s pecies. 3 of the 7 primers were highly specific for genuine A. roxburgh i i. Thus, the 3 species could be distinguished according to the bonding pattern of their amplified DNA on agarose gel. It was concluded that the method may be of value for the authentication of different species and same species of Anoectochilus Bl. from different localities.
, 百拇医药
Key words RAPD marker Anoectachilus roxburchii (Wall.) Lindl. (Jin Xian Lian) genetic variation
金线莲为兰科开唇兰属植物，是福建和台湾民间常用的多年生珍稀草药。其性平、味甘，具 有清热凉血、祛风利湿等功效。广泛用于治疗肝炎、肾炎、肺炎、小儿惊风高热、糖尿病、 风湿病等。近年来金线莲的神奇功效倍受人们的关注，享有“药之王”、“金草”等美称。 主要药用品种为花叶开唇兰(福建产者习称福建金线莲、广西产者称为广西金线莲)和台湾开 唇兰(药材称为台湾金线莲)。福建是我国野生金线莲分布区域之一。由于近年来的大量采集 ，天然资源日趋枯竭，已列为濒危药用植物，目前栽培获得成功[1，2]。另据化学 成分初步分析报道，金线莲主要含有多糖、微量元素[3]、强心苷类[4]及 氨基酸等多种成分[5]。台湾的 Cheng 等曾对 Anoectochilus formosanu s 及 A.koshunensis 进行了 RAPD 鉴定研究[6]，并 进 行了二者的杂交，用了 8 个引物，获得 19 种 RAPD 标记。其中 9 种为 A.form o sanus 的特异位点，10 种为 A.koshunensis 的特异位点。有 关 A.roxburghii 与 A.formosanus 亲缘关系的分子标 记 方面的研究及金线莲同种不同产地的遗传变异的研究未见报道。金线莲药材为无花的全草， 药材为干品，性状上难以鉴别。郑纯等曾做过福建金线莲和广西金线莲的生药鉴定，但用传 统的形态组织学无法区别二者遗传上的差异[4]，香港的 Zhang 等成功的应用分子 标 记技术对不同产地的党参进行了鉴定，结果证明 RAPD 技术是鉴定地道药材的有效方法 [7]。近年来随着分子标记技术的发展，中药鉴定的水平逐步从形态组织学、化学水平 提高到分子水平，因为后者更能代表基因多态性的变异类型的遗传标记[8]。因此 ，对以上主要药用品种福建金线莲、广西金线莲和台湾金线莲作了分子标记研究，探索三者 之间的亲缘关系及遗传变异，有利于指导栽培、资源保护、合理利用开发，为金线莲的品种 鉴别及正品 DNA 指纹图谱的制定提供科学依据。
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1 材料与方法
1.1 植物材料：a)福建金线莲 Anoectochilus roxburghii (Wall.)Li ndl. 福建永安，野生。b)广西金线莲 A.roxburghii (Wall.) Lindl . 福建热带作物技术研究所从广西引种的组培苗，漳州五峰。c)台湾金线莲 A.f ormosanus Hay. 福建热带作物技术研究所从台湾引种的组培苗，漳州五峰。
1.2 DNA 提取分离：取新鲜叶片 0.5 g 于液氮中研成细粉，迅速倒入预热至 60 ℃ 盛 有 CTAB 提取液(100 mmol/L Tris-HCl,20 mmol/L EDTA,1.4 mol/L NaCl,临用前加入 2% C TAB，1% β-巯基乙醇)的 5 mL 离心管中，摇匀，60 ℃ 保温 60 min；取出，离心 10 min(15 00 0×g)，倾出上清液，加入等体积氯仿-异戊醇(24∶1)抽提约 60 min，轻轻颠倒混匀，离 心 10 min(15 000×g)；吸取上清液，加入2/3体积的异丙醇，混匀，-20 ℃ 沉淀 30 min ；离心 10 min(15 000×g)，倾去上清液，70% 乙醇洗涤 2 次，挥干乙醇，加入 400 mL T E (10 mmol/L Tris-HCl,1 mmol/L EDTA,pH 8.0)溶液溶解；加入 RNA 酶至终浓度为 50 ng /mL， 37 ℃ 保温 60 min；等体积苯酚-氯仿(1∶1)抽提一次，离心 10 min(15 000×g)，定量 吸取上清液，加入1/10体积 3 mol/L 醋酸钠和 2 倍量无水乙醇，混匀，-20 ℃ 沉淀 60 min；离心 10 min(15 000×g)，70% 乙醇洗涤 2 次，挥干乙醇，加入 100 mL TE 溶 液溶解，部分作定性定量用，其余 4 ℃ 储存备用。
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1.3 PCR 反应：扩增总体积 25 μL，其中 2.5 μL 10×buffer,Mg2+ 2 mmol/L ，dNTP 0.1 mmol/L，引物 15 ng，DNA 模板 80 ng，0.5 单位 Taq 酶，水 10.5 μL。
在 T3 型 PCR 仪(德国 Biometra)上扩增，扩增程序为 94 ℃，1 min; 36 ℃，1 min；72 ℃，2 min；40 个循环，最后 72 ℃ 延伸 7 min。扩增产物 20 μL 在 1.5% 琼脂糖 凝胶电泳中，经 EB 染色，凝胶成像系统(GDS8000，英国UVP)照相并打印。见表1。
2 结果与分析
实验选择了 7 个扩增多态性好的引物，对 3 个 品种的 DNA 分别进行了扩增，得到清晰稳 定的特征条带。所用 7 个引物共检出 98 个位点，各引物产
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表1 RAPD 所用引物名称及其序列 引物名称
序列5′→3′
OPH13
GACGCCACAC
OPH15
GGCGCAGAAT
OPG2
GGCACTGAGG
OPH3
AGACGTCCAC
OPH17
CACTCTCCTC
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OPH19
CTGACCAGCC
OPH20
GGGAGACATC
生的标记数在 1～7 之间。其 中引物 OPH 15 对福建金线莲扩增出4 条带，另两种则与之不同，广西金线莲为 7 条带， 台 湾金线莲为 5 条带；OPH17 及 OPH19 对 3 个品种扩增出的条带各具有特异性，能用于这 3 个品种的鉴别。对不同样品所扩增 DNA 条带量化为1 或 0(条带存在为1，条带不存在为0 )输入 RAPD 分析软件，得到任意两个样品间的遗传距离。福建金线莲与广西金线莲的遗传 距离为 0.2，与台湾金线莲的遗传距离为 0.45，广西金线莲与台湾金线莲则为0.95(图1 ，表2和图2)。
, 百拇医药
图1 三种金线莲分子聚类图
表2 遗传距离相似性矩阵
福建
广西
台湾
福建
0
广西
0.2
0
台湾
0.45
0.95
, 百拇医药
0
1-福建金线莲 2-广西金线莲 3-台湾金线莲
图2 3种引物对不同种样品的扩增图谱
3 小结与讨论
福建金线莲与广西金线莲的遗传距离为0.2，基本上可认为是同种植物，并且二者在形态上 比较相 似，只是产地不同，广西金线莲植株较大，产量高。本研究结果与郑纯和陈裕等的 结论基本上是一致的[4，11]，但用同一种引物对二者扩增出的位点有差异，并且 遗传距离不为零，说明二者长期受不同地区的气候、土壤等多种生态环境的影响，已经产生 了遗传变异，在栽培或组织培养选苗种时，可优先选广西金线莲，以提高产量。台湾金线莲 与福建金线莲的遗传距离为 0.45，而与广西金线莲则为 0.95，表明遗传关系的远近与地 理 距离的远近有密切关系。引物 OPH15、OPH17、OPH19 可作为这3 个品种的高特异性引物， 用这几种鉴别引物对样品的 DNA 进行 PCR 反应，经琼脂糖凝胶电泳，与标准指纹图谱对照 ，就可准确鉴别样品的品种及真伪。
, 百拇医药
Address: Hu Shanmei, Xiamen Institute for Drug Control, Xianmen
厦门市卫生局医学科学技术进步基金科研资助项目
胡珊梅 女，1957年生。副主任药师，药学硕士。1982年江西中医学院中药专业本科毕业， 1991年江西中医学院药学系天然药物资源鉴定与开发专业获硕士学位。从事天然药物的鉴定 与开发研究多年，着重进行了江西地道药材江香薷的生药学研究，并对其他香薷类一并进行 了全面系统的比较鉴定，1994年获国家中医药管理局中医药科技进步三等奖。自1997年以来 ，主要应用分子生物学技术对名贵中药材及地道药材进行鉴定，发表论文10余篇。
参 考 文 献
1，陈 裕，林坤瑞，管其宽，等.亚热带植物通讯，1994，23(1)：46
, 百拇医药
2，江海燕，王 建.中医药研究，1997，13(2)：51
3，赖应辉，吴锦忠.中药材，1997，20(2)：84
4，郑 纯，黄以忠，潘 馨，等.中药材 1997，20(11)：552
5，王振登.福建中医学院学报，1993，3(2)：100
6，Cheng K T, Fu L C.Planta Med,1998,64:46
7，Zhang Y B, Ngan F G. Planta Med.1999，65：157
8，曹 辉，刘玉萍.中国药学杂志，1998，33(5)：269
(2000-03-12收稿), 百拇医药
单位：胡珊梅 张启国 袁文杰(厦门市药品检验所 厦门 361012)；周涵韬 周兴旺 陈鹭真(厦门大学生命科学学院)
关键词：RAPD；标记；金线莲；遗传异
中草药001234摘 要 为了鉴别金线莲的品种，探索同属植物之间的亲缘关系及同种 植物不同产地的遗传变异，并制定正品金线莲的 DNA 指纹图谱，采用随机扩增多态 DNA(RA PD)技术对兰科开唇兰属植物花叶开唇兰 Anoectochilus roxburghii(Wal l.).Lindl.、台湾开唇兰 A.formosanus Hay. 进行了鉴定，结果选 择的 7 个引物对 3 个品种 共扩增出 98 个位点，其中 3 个引物为高特异性引物。结论 RAPD 技术不仅能鉴别种间差 异，而且能揭示同种不同产地植物的遗传变异。
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Studies on Valuable and Rare Chinese Herbs Anoectochilu s roxburghii by
DNA Fingerprintings Using RAPD
Hu Shanmei Zhang Qiguo and Y uan Wenjie
(Xiamen Institute for Drug Control Xiamen 361012)
Zhou Hantao Zhou Xingwang and Chen Luzhen
(College of Life Science, Xiamen University)
Abstract In order to explore the consanguinity of plants of genus Anoectochilus Bl. (Orchidaceae), and to dis tinguish Anoectochilus roxburghii (Wall.) Lindl. from two diffe r ent localities, Fujian and Guangxi Province, and A. formosanys Hay as to their genetic variance, DNA fingerprintings were analysed with the ai d o f RAPD. Results showed that 7 primers amplified a total of 98 sites for the 3 s pecies. 3 of the 7 primers were highly specific for genuine A. roxburgh i i. Thus, the 3 species could be distinguished according to the bonding pattern of their amplified DNA on agarose gel. It was concluded that the method may be of value for the authentication of different species and same species of Anoectochilus Bl. from different localities.
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Key words RAPD marker Anoectachilus roxburchii (Wall.) Lindl. (Jin Xian Lian) genetic variation
金线莲为兰科开唇兰属植物，是福建和台湾民间常用的多年生珍稀草药。其性平、味甘，具 有清热凉血、祛风利湿等功效。广泛用于治疗肝炎、肾炎、肺炎、小儿惊风高热、糖尿病、 风湿病等。近年来金线莲的神奇功效倍受人们的关注，享有“药之王”、“金草”等美称。 主要药用品种为花叶开唇兰(福建产者习称福建金线莲、广西产者称为广西金线莲)和台湾开 唇兰(药材称为台湾金线莲)。福建是我国野生金线莲分布区域之一。由于近年来的大量采集 ，天然资源日趋枯竭，已列为濒危药用植物，目前栽培获得成功[1，2]。另据化学 成分初步分析报道，金线莲主要含有多糖、微量元素[3]、强心苷类[4]及 氨基酸等多种成分[5]。台湾的 Cheng 等曾对 Anoectochilus formosanu s 及 A.koshunensis 进行了 RAPD 鉴定研究[6]，并 进 行了二者的杂交，用了 8 个引物，获得 19 种 RAPD 标记。其中 9 种为 A.form o sanus 的特异位点，10 种为 A.koshunensis 的特异位点。有 关 A.roxburghii 与 A.formosanus 亲缘关系的分子标 记 方面的研究及金线莲同种不同产地的遗传变异的研究未见报道。金线莲药材为无花的全草， 药材为干品，性状上难以鉴别。郑纯等曾做过福建金线莲和广西金线莲的生药鉴定，但用传 统的形态组织学无法区别二者遗传上的差异[4]，香港的 Zhang 等成功的应用分子 标 记技术对不同产地的党参进行了鉴定，结果证明 RAPD 技术是鉴定地道药材的有效方法 [7]。近年来随着分子标记技术的发展，中药鉴定的水平逐步从形态组织学、化学水平 提高到分子水平，因为后者更能代表基因多态性的变异类型的遗传标记[8]。因此 ，对以上主要药用品种福建金线莲、广西金线莲和台湾金线莲作了分子标记研究，探索三者 之间的亲缘关系及遗传变异，有利于指导栽培、资源保护、合理利用开发，为金线莲的品种 鉴别及正品 DNA 指纹图谱的制定提供科学依据。
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1 材料与方法
1.1 植物材料：a)福建金线莲 Anoectochilus roxburghii (Wall.)Li ndl. 福建永安，野生。b)广西金线莲 A.roxburghii (Wall.) Lindl . 福建热带作物技术研究所从广西引种的组培苗，漳州五峰。c)台湾金线莲 A.f ormosanus Hay. 福建热带作物技术研究所从台湾引种的组培苗，漳州五峰。
1.2 DNA 提取分离：取新鲜叶片 0.5 g 于液氮中研成细粉，迅速倒入预热至 60 ℃ 盛 有 CTAB 提取液(100 mmol/L Tris-HCl,20 mmol/L EDTA,1.4 mol/L NaCl,临用前加入 2% C TAB，1% β-巯基乙醇)的 5 mL 离心管中，摇匀，60 ℃ 保温 60 min；取出，离心 10 min(15 00 0×g)，倾出上清液，加入等体积氯仿-异戊醇(24∶1)抽提约 60 min，轻轻颠倒混匀，离 心 10 min(15 000×g)；吸取上清液，加入2/3体积的异丙醇，混匀，-20 ℃ 沉淀 30 min ；离心 10 min(15 000×g)，倾去上清液，70% 乙醇洗涤 2 次，挥干乙醇，加入 400 mL T E (10 mmol/L Tris-HCl,1 mmol/L EDTA,pH 8.0)溶液溶解；加入 RNA 酶至终浓度为 50 ng /mL， 37 ℃ 保温 60 min；等体积苯酚-氯仿(1∶1)抽提一次，离心 10 min(15 000×g)，定量 吸取上清液，加入1/10体积 3 mol/L 醋酸钠和 2 倍量无水乙醇，混匀，-20 ℃ 沉淀 60 min；离心 10 min(15 000×g)，70% 乙醇洗涤 2 次，挥干乙醇，加入 100 mL TE 溶 液溶解，部分作定性定量用，其余 4 ℃ 储存备用。
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1.3 PCR 反应：扩增总体积 25 μL，其中 2.5 μL 10×buffer,Mg2+ 2 mmol/L ，dNTP 0.1 mmol/L，引物 15 ng，DNA 模板 80 ng，0.5 单位 Taq 酶，水 10.5 μL。
在 T3 型 PCR 仪(德国 Biometra)上扩增，扩增程序为 94 ℃，1 min; 36 ℃，1 min；72 ℃，2 min；40 个循环，最后 72 ℃ 延伸 7 min。扩增产物 20 μL 在 1.5% 琼脂糖 凝胶电泳中，经 EB 染色，凝胶成像系统(GDS8000，英国UVP)照相并打印。见表1。
2 结果与分析
实验选择了 7 个扩增多态性好的引物，对 3 个 品种的 DNA 分别进行了扩增，得到清晰稳 定的特征条带。所用 7 个引物共检出 98 个位点，各引物产
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表1 RAPD 所用引物名称及其序列 引物名称
序列5′→3′
OPH13
GACGCCACAC
OPH15
GGCGCAGAAT
OPG2
GGCACTGAGG
OPH3
AGACGTCCAC
OPH17
CACTCTCCTC
, http://www.100md.com
OPH19
CTGACCAGCC
OPH20
GGGAGACATC
生的标记数在 1～7 之间。其 中引物 OPH 15 对福建金线莲扩增出4 条带，另两种则与之不同，广西金线莲为 7 条带， 台 湾金线莲为 5 条带；OPH17 及 OPH19 对 3 个品种扩增出的条带各具有特异性，能用于这 3 个品种的鉴别。对不同样品所扩增 DNA 条带量化为1 或 0(条带存在为1，条带不存在为0 )输入 RAPD 分析软件，得到任意两个样品间的遗传距离。福建金线莲与广西金线莲的遗传 距离为 0.2，与台湾金线莲的遗传距离为 0.45，广西金线莲与台湾金线莲则为0.95(图1 ，表2和图2)。
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图1 三种金线莲分子聚类图
表2 遗传距离相似性矩阵
福建
广西
台湾
福建
0
广西
0.2
0
台湾
0.45
0.95
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0
1-福建金线莲 2-广西金线莲 3-台湾金线莲
图2 3种引物对不同种样品的扩增图谱
3 小结与讨论
福建金线莲与广西金线莲的遗传距离为0.2，基本上可认为是同种植物，并且二者在形态上 比较相 似，只是产地不同，广西金线莲植株较大，产量高。本研究结果与郑纯和陈裕等的 结论基本上是一致的[4，11]，但用同一种引物对二者扩增出的位点有差异，并且 遗传距离不为零，说明二者长期受不同地区的气候、土壤等多种生态环境的影响，已经产生 了遗传变异，在栽培或组织培养选苗种时，可优先选广西金线莲，以提高产量。台湾金线莲 与福建金线莲的遗传距离为 0.45，而与广西金线莲则为 0.95，表明遗传关系的远近与地 理 距离的远近有密切关系。引物 OPH15、OPH17、OPH19 可作为这3 个品种的高特异性引物， 用这几种鉴别引物对样品的 DNA 进行 PCR 反应，经琼脂糖凝胶电泳，与标准指纹图谱对照 ，就可准确鉴别样品的品种及真伪。
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厦门市卫生局医学科学技术进步基金科研资助项目
胡珊梅 女，1957年生。副主任药师，药学硕士。1982年江西中医学院中药专业本科毕业， 1991年江西中医学院药学系天然药物资源鉴定与开发专业获硕士学位。从事天然药物的鉴定 与开发研究多年，着重进行了江西地道药材江香薷的生药学研究，并对其他香薷类一并进行 了全面系统的比较鉴定，1994年获国家中医药管理局中医药科技进步三等奖。自1997年以来 ，主要应用分子生物学技术对名贵中药材及地道药材进行鉴定，发表论文10余篇。
参 考 文 献
1，陈 裕，林坤瑞，管其宽，等.亚热带植物通讯，1994，23(1)：46
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2，江海燕，王 建.中医药研究，1997，13(2)：51
3，赖应辉，吴锦忠.中药材，1997，20(2)：84
4，郑 纯，黄以忠，潘 馨，等.中药材 1997，20(11)：552
5，王振登.福建中医学院学报，1993，3(2)：100
6，Cheng K T, Fu L C.Planta Med,1998,64:46
7，Zhang Y B, Ngan F G. Planta Med.1999，65：157
8，曹 辉，刘玉萍.中国药学杂志，1998，33(5)：269
(2000-03-12收稿), 百拇医药