束缚应激相关基因L36的序列拼接与鉴定
作者：钟琳 李怡凡 韩文玲 马大龙 范少光 丁桂凤
单位：钟琳 韩文玲 马大龙 丁桂凤(北京大学基础医学院免疫学系)；李怡凡 范少光(北京大学基础医学院生理学系，北京 100083)
关键词：应激；RNA；信使；代谢；克隆；分子；氨基酸序列
北京医科大学学报000428 [中图分类号] Q343.13 [文献标识码] A [文章编号] 1000-1530(2000)04-0381-02
我们以往研究发现应激动物血清中存在着一种应激免疫抑制蛋白，它是在中枢神经系统控制下产生的一种具有多种生物活性的相对分子质量大的蛋白质[1]，近来利用应激免疫抑制蛋白的单克隆抗体进一步证明此蛋白是由外周T淋巴细胞分泌产生的[2]。在应激状态下，免疫系统除了编码应激免疫抑制蛋白的基因被诱发表达外，可能还有更多编码类似调节蛋白的基因也被诱导表达，为了寻找应激条件下淋巴细胞中高表达的基因，我们曾利用suppression subtractive hybridization (SSH)构建了应激状态下差异表达的cDNA文库[3]，进一步克隆化得到两个新基因片段L36(396 bp)和L7(464 bp)[4]。本研究是在此基础上利用EST(expressed sequence tags)数据库中公布的信息，进行EST重叠片断拼接(overlapping fragments assembling); 利用RT-PCR及测序进行拼接工作的验证；并通过狭缝杂交对其mRNA的表达进行分析。
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1 材料与方法
1.1 EST数据库检索和序列拼接
L7(464 bp)和L36(396 bp)在www.ncbi.nlm.nih.gov的Genbank dbest库中进行同源性比较，选择同源性在95%以上，长度超过150 bp的ESTs，在gcg.tigem.it/cgibin/uniestass.p1的the tigemNet EST assembly machine中进行序列拼接。
1.2 RT-PCR的序列测定
将8周龄的BALB/C雄鼠束缚应激16 h后，与对照组小鼠同时断颈处死，分别在无菌条件下制备肠系膜淋巴结单个细胞悬液，调细胞浓度为1×107 ml-1，用TRIzol(Life TechnologiesTM)提取总RNA，用逆转录聚合酶链反应试剂盒得到cDNA；设计拼接后L36(632 bp)的基因特异性引物：
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L36-21 5′ AACCCAAgATCACCAgCCCAg 3′
L36-22 5′ CATgCAgTgTTTTggAgATgCC 3′
得到的PCR产物经酶切鉴定后，由大连宝生物工程有限公司测序。
1.3 狭缝杂交
用DNA化学荧光标记与检测试剂盒-辣根过氧化物酶型(dupont NEN research products)制备L36(631 bp)探针和β-actin探针，按文献[5]进行狭缝杂交。
2 结果
2.1 EST检索和序列拼接
L7在EST中片段同源性低，为86%～94%，通过拼接得到的L7(829 bp)片段，可信度不高，未继续进行RT-PCR和测序；L36在EST中片段同源性为82%～100%，序列拼接、设计基因特异性引物后拼出L36(632 bp)片段。
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2.2 RT-PCR和序列测定
证明了在L36(396 bp)基础上的EST序列拼接成功，由此，实际得到延长的L36(631 bp)片段，它存在于正常小鼠和应激小鼠中，酶切鉴定见(图1)。
1，4 control C1 (632 bp), stress S1 (632 bp)，cut with Bam H1; 2，5, C1，S1 cut with Bgl Ⅱ; 3，6, C1，S1 uneut;
7, marker 1543 bp, 994 bp, 695 bp, 515 bp, 377 bp, 237 bp.
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图1 L36的RT-PCR产物及酶切鉴定
Figure 1 RT-PCR product of L36 and characterization
2.3 狭缝杂交
发现L36(631 bp) mRNA在应激小鼠中的表达高于正常小鼠(图2)，该基因在应激状态下可能发挥一定的作用，但此应激相关基因诱导高表达的性质有待进一步研究。
1，2， β-actin probe labled control, stress；
3，4， L36(631bp) probe labled control, stress.
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图2 狭缝杂交结果
Figure 2 Results of slot blot
2.4 Nr数据库检索
发现L36(631bp)与小鼠MHC区(AC005413,AC005665)有99%的高度同源，与小鼠TCRα区(AC005403)有95%的同源，提示它可能属于MHC或TCRα；在检索中还发现鼠17染色体MHC补体区与鼠14染色体TCRα区在1 224 bp的范围内有95.5%同源性。
3 讨论
EST是指cDNA克隆3’或5’端已测序的部分，它们随机分布在染色体上，每个EST代表一个单拷贝的cDNA表达序列。EST数据库在生物学研究中有着重要的作用，能为克隆到的基因提供重要相关资料[5]，包括：获得mRNA表达图谱，对基因突变、缺失、不同剪切方式进行分析，为定位侯选克隆致病基因提供丰富的基因标志等，并可把模式生物基因组的研究成果运用到人类疾病研究中起到桥梁作用。我们的工作证明，利用计算机进行数据检索和分析可使我们在较短的时间内尽可能多地获得有关应激相应基因的信息，从而进一步认识应激状态下免疫功能改变的分子基础。对于已确定的应激差异基因片段可制备成探针，确定在机体其他组织或其他应激模型中该应激差异的表达具有组织特异性，哪些的表达具有普遍性，进而研究其功能意义，对于SSH方法构建的应激状态下差异表达的cDNA文库中已筛选出的其他应激相关克隆，可考虑用此方法去获得全长或更多信息；此外，在检索中发现鼠17染色体MHC补体区与鼠14染色体TCRα区在1224bp的范围内有95.5%同源性，目前在国内外尚未见这方面的报道。二者具有如此高同源性的具体原因有待深入研究。
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参考文献
1，Fan SG, Shao L, Ding GF. A suppressive protein generated in peripheral lymph tissue induced by restraint stress[J]. Adv Neuroimmunol, 1996, 6:279-288
2，范少光，丁桂凤.T淋巴细胞产生的应激免疫抑制蛋白[J].北京医科大学学报，1999，31：197-203
3，Diatchenko L, Lau YF, Campbell AP, et al. Suppression subtractive hybridization: A merbod for generating differeatially regulated or tissue-specific cDNA probes and libraries[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1996,93(12):6025-6030
, 百拇医药
4，李乐群，韩文玲，李怡凡，等. 利用SSH技术研究小鼠淋巴组织中与束缚应激相关的基因[J].科学通报，1999，44(9)：941-944
5，Sambrook J, Frisch EF, Maniatis T. Molecular cloning, a laboratory manual[M]. 2nd ed. New York: Cold spring harbor laboratory press, 1998.565-571
6，Lennin GG, Auffray C, Polymeropoulos, M. The IMAGE consortium: An integrated molecular analysis of genomes and their expression[J]. Pro Natal Acad Sci USA, 1996,93:6025-6030
(1999-04-01收稿), http://www.100md.com
单位：钟琳 韩文玲 马大龙 丁桂凤(北京大学基础医学院免疫学系)；李怡凡 范少光(北京大学基础医学院生理学系，北京 100083)
关键词：应激；RNA；信使；代谢；克隆；分子；氨基酸序列
北京医科大学学报000428 [中图分类号] Q343.13 [文献标识码] A [文章编号] 1000-1530(2000)04-0381-02
我们以往研究发现应激动物血清中存在着一种应激免疫抑制蛋白，它是在中枢神经系统控制下产生的一种具有多种生物活性的相对分子质量大的蛋白质[1]，近来利用应激免疫抑制蛋白的单克隆抗体进一步证明此蛋白是由外周T淋巴细胞分泌产生的[2]。在应激状态下，免疫系统除了编码应激免疫抑制蛋白的基因被诱发表达外，可能还有更多编码类似调节蛋白的基因也被诱导表达，为了寻找应激条件下淋巴细胞中高表达的基因，我们曾利用suppression subtractive hybridization (SSH)构建了应激状态下差异表达的cDNA文库[3]，进一步克隆化得到两个新基因片段L36(396 bp)和L7(464 bp)[4]。本研究是在此基础上利用EST(expressed sequence tags)数据库中公布的信息，进行EST重叠片断拼接(overlapping fragments assembling); 利用RT-PCR及测序进行拼接工作的验证；并通过狭缝杂交对其mRNA的表达进行分析。
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1 材料与方法
1.1 EST数据库检索和序列拼接
L7(464 bp)和L36(396 bp)在www.ncbi.nlm.nih.gov的Genbank dbest库中进行同源性比较，选择同源性在95%以上，长度超过150 bp的ESTs，在gcg.tigem.it/cgibin/uniestass.p1的the tigemNet EST assembly machine中进行序列拼接。
1.2 RT-PCR的序列测定
将8周龄的BALB/C雄鼠束缚应激16 h后，与对照组小鼠同时断颈处死，分别在无菌条件下制备肠系膜淋巴结单个细胞悬液，调细胞浓度为1×107 ml-1，用TRIzol(Life TechnologiesTM)提取总RNA，用逆转录聚合酶链反应试剂盒得到cDNA；设计拼接后L36(632 bp)的基因特异性引物：
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L36-21 5′ AACCCAAgATCACCAgCCCAg 3′
L36-22 5′ CATgCAgTgTTTTggAgATgCC 3′
得到的PCR产物经酶切鉴定后，由大连宝生物工程有限公司测序。
1.3 狭缝杂交
用DNA化学荧光标记与检测试剂盒-辣根过氧化物酶型(dupont NEN research products)制备L36(631 bp)探针和β-actin探针，按文献[5]进行狭缝杂交。
2 结果
2.1 EST检索和序列拼接
L7在EST中片段同源性低，为86%～94%，通过拼接得到的L7(829 bp)片段，可信度不高，未继续进行RT-PCR和测序；L36在EST中片段同源性为82%～100%，序列拼接、设计基因特异性引物后拼出L36(632 bp)片段。
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2.2 RT-PCR和序列测定
证明了在L36(396 bp)基础上的EST序列拼接成功，由此，实际得到延长的L36(631 bp)片段，它存在于正常小鼠和应激小鼠中，酶切鉴定见(图1)。
1，4 control C1 (632 bp), stress S1 (632 bp)，cut with Bam H1; 2，5, C1，S1 cut with Bgl Ⅱ; 3，6, C1，S1 uneut;
7, marker 1543 bp, 994 bp, 695 bp, 515 bp, 377 bp, 237 bp.
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图1 L36的RT-PCR产物及酶切鉴定
Figure 1 RT-PCR product of L36 and characterization
2.3 狭缝杂交
发现L36(631 bp) mRNA在应激小鼠中的表达高于正常小鼠(图2)，该基因在应激状态下可能发挥一定的作用，但此应激相关基因诱导高表达的性质有待进一步研究。
1，2， β-actin probe labled control, stress；
3，4， L36(631bp) probe labled control, stress.
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图2 狭缝杂交结果
Figure 2 Results of slot blot
2.4 Nr数据库检索
发现L36(631bp)与小鼠MHC区(AC005413,AC005665)有99%的高度同源，与小鼠TCRα区(AC005403)有95%的同源，提示它可能属于MHC或TCRα；在检索中还发现鼠17染色体MHC补体区与鼠14染色体TCRα区在1 224 bp的范围内有95.5%同源性。
3 讨论
EST是指cDNA克隆3’或5’端已测序的部分，它们随机分布在染色体上，每个EST代表一个单拷贝的cDNA表达序列。EST数据库在生物学研究中有着重要的作用，能为克隆到的基因提供重要相关资料[5]，包括：获得mRNA表达图谱，对基因突变、缺失、不同剪切方式进行分析，为定位侯选克隆致病基因提供丰富的基因标志等，并可把模式生物基因组的研究成果运用到人类疾病研究中起到桥梁作用。我们的工作证明，利用计算机进行数据检索和分析可使我们在较短的时间内尽可能多地获得有关应激相应基因的信息，从而进一步认识应激状态下免疫功能改变的分子基础。对于已确定的应激差异基因片段可制备成探针，确定在机体其他组织或其他应激模型中该应激差异的表达具有组织特异性，哪些的表达具有普遍性，进而研究其功能意义，对于SSH方法构建的应激状态下差异表达的cDNA文库中已筛选出的其他应激相关克隆，可考虑用此方法去获得全长或更多信息；此外，在检索中发现鼠17染色体MHC补体区与鼠14染色体TCRα区在1224bp的范围内有95.5%同源性，目前在国内外尚未见这方面的报道。二者具有如此高同源性的具体原因有待深入研究。
, http://www.100md.com
参考文献
1，Fan SG, Shao L, Ding GF. A suppressive protein generated in peripheral lymph tissue induced by restraint stress[J]. Adv Neuroimmunol, 1996, 6:279-288
2，范少光，丁桂凤.T淋巴细胞产生的应激免疫抑制蛋白[J].北京医科大学学报，1999，31：197-203
3，Diatchenko L, Lau YF, Campbell AP, et al. Suppression subtractive hybridization: A merbod for generating differeatially regulated or tissue-specific cDNA probes and libraries[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1996,93(12):6025-6030
, 百拇医药
4，李乐群，韩文玲，李怡凡，等. 利用SSH技术研究小鼠淋巴组织中与束缚应激相关的基因[J].科学通报，1999，44(9)：941-944
5，Sambrook J, Frisch EF, Maniatis T. Molecular cloning, a laboratory manual[M]. 2nd ed. New York: Cold spring harbor laboratory press, 1998.565-571
6，Lennin GG, Auffray C, Polymeropoulos, M. The IMAGE consortium: An integrated molecular analysis of genomes and their expression[J]. Pro Natal Acad Sci USA, 1996,93:6025-6030
(1999-04-01收稿), http://www.100md.com