CSA系统在免疫组织化学中的应用
作者：倪灿荣 范淼 许炳基
单位：倪灿荣(第二军医大学病理学教研室，上海 200433)；范淼(上海空军455医院 200052)；许炳基(浙江省长兴县人民医院 313100)
关键词：催化信号放大；免疫组织化学；抗体；肿瘤
临床与实验病理学杂志990333分类号 R392.3 文献标识码 A
文章编号 1001-7399(1999)03-0267-03
CSA(catalyzed signal amplification，催化信号放大)法是一种全新的、更为敏感的检测系统，由Bobrow等〔1〕报道应用于酶联免疫和蛋白电泳转移膜的检测。1992年Adams等〔2〕将CSA系统应用于免疫组织化学的检测放大，该方法较传统的PAP、APAAP、ABC、LSAB法具有较高的敏感性，比LSAB法要敏感1 000倍，较EnVision法敏感20～100倍，而且具有稳定性高，背景低等优点，本实验室已引进该方法，应用于免疫组化(IHC)和原位杂交(ISH)组化的放大检测，其原理：第一抗体孵育洗后，滴加生物素化抗第一抗体的二抗，其后滴加的Streptavidin-HRP与生物素结合，再加入生物素化酪胺分子，此时Streptavidin上结合的HRP在H2O2的存在下，催化酪胺分子，形成共价键结合位点，大量的生物素沉积在抗原抗体结合部位，当再一次滴加Streptavidin-HRP复合物时，因在抗原抗体结合部位上存在许许多多的生物素，而使大量的HRP沉积在抗原抗体结合部位的周围，通过DAB-H2O2底物使信号得到几何级的放大。如抗原量少，信号太弱，还可进一步重复上述循环，直到理想为止。
, 百拇医药
本文主要介绍CSA系统在IHC检测中的应用研究，利用40种不同类型的特异性一抗，50例10种肿瘤标本进行CSA-ISH法的检测，并与常规LSAB、EnVision法比较，以探讨该方法的敏感性、背景染色和应注意的问题。
1 材料和方法
1.1 组织标本 肺癌、肝细胞癌、食管癌、胃癌、结肠癌、脑胶质瘤、恶性淋巴瘤、膀胱癌、喉癌、乳腺癌各5例(分别来自本校长海、长征和东方肝胆外科医院)均为10%中性缓冲福尔马林固定24 h，常规脱水、透明和包埋，4 μm厚连续石蜡切片，贴在涂有多聚赖氨酸的载玻片上，58℃烤24 h，4℃保存备用。
1.2 试剂 LSAB kit, EnVision(HRP),BT(生物素化酪胺分子)均购自丹麦Dako公司，3种方法所用第一抗体的稀释度来源及处理方式见表1。
表1 3种IHC方法第一抗体的稀释、来源及处理方式 第一抗体
, 百拇医药
处理方式
种族
稀释度
来 源
LSAB
EnVision
CSA
nm23
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*WMI微波辐射抗原修复，修复液为0.01 mol。L-1柠檬酸缓冲液
1.3 方法 IHC-LSAB，EnVision法参阅相关文献〔3～5〕。CSA法操作流程：石蜡切片脱蜡至水，PBS洗，3%H2O2 20 min，室温，PBS洗3 min×3次。所有一抗按表1进行前处理〔6〕，PBS洗3 min×3次，按表1稀释第一抗体，37℃ 1 h，PBS洗3 min×3次，生物素化抗兔或抗鼠IgG 1∶300 37℃ 20 min，PBS洗3 min×3次；第一次Streptavidin-HRP 1∶500 37℃ 20 min, PBS洗3 min×3次；生物素化酪胺分子(0.007 mmol。L-1 37℃ 12 min，PBS洗3 min×3次；第二次Streptavidin-HRP 1∶1 000 37 ℃ 20 min。PBS洗3 min×3次(如果不理想可重复上述循环数次)，0.05% DAB+0.03% H2O2显色，8～12 min，流水洗终止反应，苏木素衬染，蓝化，常规封片。
, 百拇医药
2 结果
应用40种不同类型的第一抗体，对50例10种脏器肿瘤标本的石蜡包埋连续切片，同时行免疫组化CSA、EnVision和LSAB法染色。从表1中可以看出，CSA法最为敏感，其次是EnVision和LSAB法，CSA较LSAB法敏感500～1 000倍，较EnVision法敏感20～100倍，EnVision较LSAB敏感3～6倍。3种方法背景染色，基本一致，因CSA法中第一抗体高度稀释，背景染色要好于LSAB法；而EnVision法中，组织内无内源性葡聚糖多聚物存在，因此EnVision法略好于CSA和LSAB法。EnVision法孵育时间最短，其次是LSAB法，CSA法最长(表2)。
表2 3种方法染色时间的比较(常规方法，min) 项别
LSAB
EnVision
, 百拇医药
CSA
石蜡切片脱蜡至水
30
30
30
3%H2O2
20
省略
30
抗原修复或消化
20
20
20
, http://www.100md.com
特异性一抗
60
60
60
生物素第二抗体或二抗
30
无
30
多聚物酶结合物Strepavidin-HRP(1)
30
30
20
生物素化酪胺
, 百拇医药
无
无
15
Streptavidin-HRP(2)
无
无
20
0.05% DAB+0.03% H2O2
10
10
10
合计洗涤时间
, 百拇医药
15
10
25
衬染、封片
5
5
5
合 计
220
165
255
比较3种方法的检测结果，发现3种方法的第一抗体经最佳稀释后(表1)，其阳性率和阳性强度基本一致(图1～4)。在肝癌、胶质瘤和喉癌中Ki-67、P-gp、bcl-2的阳性率，CSA法比LSAB和EnVision法高10%，在乳腺癌中ER、PR的检测阳性细胞数，CSA法比LSAB和EnVision法高5%。2例胃癌标本固定4天，常规石蜡包埋连续切片，分别检测Ki-67、Rb、P-gp、PDEF、Bax、CD44、nm23、bcl-2等抗原，结果LSAB和EnVision法均呈阴性，而用CSA法在2个循环后，除Ki-67、P-gp外均检测到阳性结果。
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图1 乳腺癌，P53 1：8 000稀释。×990
图2 c-erbB-2 1:12 000稀释。×990
图3 胶质细胞Ⅲ级，nm23 1: 80 000稀释。×990
图4 P-gp(C219)1：8 000稀释。×396
3 讨论
目前提高免疫组化方法的敏感性有2种途径，一是增加IHC方法的敏感性，例如IGSS、增强型LSAB及最近推出的EnVision法和CSA系统，其方法的敏感性较PAP、APAAP、ABC和SABC法有了较为显著的提高，另一途径是通过对石蜡切片酶消化或热处理使IHC检测敏感性大为提高，使许多原来仅在冷冻切片上表达的抗原能用于石蜡切片。CSA法是一种全新的IHC方法，其敏感性可以与IGSS法媲美，而CSA法克服了IGSS法的高背景，操作也较IGSS简便，是值得推广的一种新方法。C
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SA法应用到原位分子杂交的检测〔7〕，较常规方法敏感，本实验室已应用CSA法检测nm23、MDR、p16、bcl-2、HPV、HBV的cRNA和cDNA探针，并获得较为理想的结果。
近来推出的EnVision也有较高的敏感性，但CSA法要比EnVision法敏感20～100倍，但流程多、孵育时间长，背景染色不如EnVision法。作者认为EnVision法非常适合于IHC的鉴别诊断，而CSA法适合于实验病理学和第一抗体昂贵、抗原性较弱的IHC检测。在使用CSA法过程中，生物素化酪胺分子的浓度不能太高，一般在0.009～0.007 μmol。L-1，如超过0.01 μmol。L-1，常会出现核内的高背景染色，同时酪胺分子是HRP在H2O2存在下进行催化反应，因此时间一般15 min即可。由于该方法仅开展了几十种抗体，对部分肿瘤的检测可能存在一些问题，只有通过大量的使用才能对该方法作出全面的评价。
, 百拇医药
最近，Sabattint等〔8〕介绍利用IHC的EnVision法和53种抗体(均为CD系列)对各类淋巴瘤进行了检测，并和PAP、ABC、SABC、LSAB和CSA法进行比较，认为EnVison较其它方法敏感5～6倍，与CSA法基本一致。此结果与本文所获结果不一致，有待进一步探讨。另外，Sabattint还发现有5例标本因固定时间太长(1周)，其它方法均为阴性结果，仅CSA法阳性表达。这与本文2例胃癌固定5天(其它方法均阴性，仅CSA法阳性表达)的结果相符，认为CSA可作为抗原破坏严重、抗原量较少的组织细胞抗原的检测方法。
作者简介：倪灿荣，男，41岁，高级实验师，上海病理学会委员，主要从事免疫组化和原位杂交的技术工作
参考文献
1，Bobrow MN. Harris TD, Shaughnessy KJ et al. Catalyzed reporter deposition, a novel methed of singal amplification. Application to immunoassys. J Immunol Methods,1989;125:279
, http://www.100md.com
2，Adams JC. Biotin amplification of biotin and horseradish peroxidase signals in histochemical stains. J Histochem Cytochem,1992;40:1457
3，Vander Loos CM, Naruko T, Becker AE. The use of enhanced polymer onestep staining reagents for immunoenzyme double-lakelling. Histochem J,1996;28:709
4，Chilosi M, Lestani M, Pedron S et al. A rapid immunostaining method for frozen sections. Biotech Histochem,1994;69:235
, http://www.100md.com
5，倪仙荣. 免疫组织化学实验新技术及应用. 北京：科学技术出版社，1993：P36
6，倪仙荣. 影响免疫组织化学染色结果的各种因素. 中华病理学杂志，1996；25(6)：383～384
7，Kerstens HMJ, Poddighe PJ, Hanselaar AGJM. A novel in situ bybridization signal amplification method based on the deposition of biotinylated tyramine. J Histochem Cytochem,1995;43:437～352
8，Sabattini E, Bisgaard K, Ascani S et al. The Envision TM+ system: a new immunohistochemical method for diagnostic and research. Critical comparison with the APAAP, Chem Mate TM, CSA, LSAB, and SABC Techniques. J Clin Pathol,1998;51:506～511
收稿日期：1999-01-20
修稿日期：1999-03-31, 百拇医药
单位：倪灿荣(第二军医大学病理学教研室，上海 200433)；范淼(上海空军455医院 200052)；许炳基(浙江省长兴县人民医院 313100)
关键词：催化信号放大；免疫组织化学；抗体；肿瘤
临床与实验病理学杂志990333分类号 R392.3 文献标识码 A
文章编号 1001-7399(1999)03-0267-03
CSA(catalyzed signal amplification，催化信号放大)法是一种全新的、更为敏感的检测系统，由Bobrow等〔1〕报道应用于酶联免疫和蛋白电泳转移膜的检测。1992年Adams等〔2〕将CSA系统应用于免疫组织化学的检测放大，该方法较传统的PAP、APAAP、ABC、LSAB法具有较高的敏感性，比LSAB法要敏感1 000倍，较EnVision法敏感20～100倍，而且具有稳定性高，背景低等优点，本实验室已引进该方法，应用于免疫组化(IHC)和原位杂交(ISH)组化的放大检测，其原理：第一抗体孵育洗后，滴加生物素化抗第一抗体的二抗，其后滴加的Streptavidin-HRP与生物素结合，再加入生物素化酪胺分子，此时Streptavidin上结合的HRP在H2O2的存在下，催化酪胺分子，形成共价键结合位点，大量的生物素沉积在抗原抗体结合部位，当再一次滴加Streptavidin-HRP复合物时，因在抗原抗体结合部位上存在许许多多的生物素，而使大量的HRP沉积在抗原抗体结合部位的周围，通过DAB-H2O2底物使信号得到几何级的放大。如抗原量少，信号太弱，还可进一步重复上述循环，直到理想为止。
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本文主要介绍CSA系统在IHC检测中的应用研究，利用40种不同类型的特异性一抗，50例10种肿瘤标本进行CSA-ISH法的检测，并与常规LSAB、EnVision法比较，以探讨该方法的敏感性、背景染色和应注意的问题。
1 材料和方法
1.1 组织标本 肺癌、肝细胞癌、食管癌、胃癌、结肠癌、脑胶质瘤、恶性淋巴瘤、膀胱癌、喉癌、乳腺癌各5例(分别来自本校长海、长征和东方肝胆外科医院)均为10%中性缓冲福尔马林固定24 h，常规脱水、透明和包埋，4 μm厚连续石蜡切片，贴在涂有多聚赖氨酸的载玻片上，58℃烤24 h，4℃保存备用。
1.2 试剂 LSAB kit, EnVision(HRP),BT(生物素化酪胺分子)均购自丹麦Dako公司，3种方法所用第一抗体的稀释度来源及处理方式见表1。
表1 3种IHC方法第一抗体的稀释、来源及处理方式 第一抗体
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处理方式
种族
稀释度
来 源
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EnVision
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*WMI微波辐射抗原修复，修复液为0.01 mol。L-1柠檬酸缓冲液
1.3 方法 IHC-LSAB，EnVision法参阅相关文献〔3～5〕。CSA法操作流程：石蜡切片脱蜡至水，PBS洗，3%H2O2 20 min，室温，PBS洗3 min×3次。所有一抗按表1进行前处理〔6〕，PBS洗3 min×3次，按表1稀释第一抗体，37℃ 1 h，PBS洗3 min×3次，生物素化抗兔或抗鼠IgG 1∶300 37℃ 20 min，PBS洗3 min×3次；第一次Streptavidin-HRP 1∶500 37℃ 20 min, PBS洗3 min×3次；生物素化酪胺分子(0.007 mmol。L-1 37℃ 12 min，PBS洗3 min×3次；第二次Streptavidin-HRP 1∶1 000 37 ℃ 20 min。PBS洗3 min×3次(如果不理想可重复上述循环数次)，0.05% DAB+0.03% H2O2显色，8～12 min，流水洗终止反应，苏木素衬染，蓝化，常规封片。
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2 结果
应用40种不同类型的第一抗体，对50例10种脏器肿瘤标本的石蜡包埋连续切片，同时行免疫组化CSA、EnVision和LSAB法染色。从表1中可以看出，CSA法最为敏感，其次是EnVision和LSAB法，CSA较LSAB法敏感500～1 000倍，较EnVision法敏感20～100倍，EnVision较LSAB敏感3～6倍。3种方法背景染色，基本一致，因CSA法中第一抗体高度稀释，背景染色要好于LSAB法；而EnVision法中，组织内无内源性葡聚糖多聚物存在，因此EnVision法略好于CSA和LSAB法。EnVision法孵育时间最短，其次是LSAB法，CSA法最长(表2)。
表2 3种方法染色时间的比较(常规方法，min) 项别
LSAB
EnVision
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CSA
石蜡切片脱蜡至水
30
30
30
3%H2O2
20
省略
30
抗原修复或消化
20
20
20
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特异性一抗
60
60
60
生物素第二抗体或二抗
30
无
30
多聚物酶结合物Strepavidin-HRP(1)
30
30
20
生物素化酪胺
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无
无
15
Streptavidin-HRP(2)
无
无
20
0.05% DAB+0.03% H2O2
10
10
10
合计洗涤时间
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15
10
25
衬染、封片
5
5
5
合 计
220
165
255
比较3种方法的检测结果，发现3种方法的第一抗体经最佳稀释后(表1)，其阳性率和阳性强度基本一致(图1～4)。在肝癌、胶质瘤和喉癌中Ki-67、P-gp、bcl-2的阳性率，CSA法比LSAB和EnVision法高10%，在乳腺癌中ER、PR的检测阳性细胞数，CSA法比LSAB和EnVision法高5%。2例胃癌标本固定4天，常规石蜡包埋连续切片，分别检测Ki-67、Rb、P-gp、PDEF、Bax、CD44、nm23、bcl-2等抗原，结果LSAB和EnVision法均呈阴性，而用CSA法在2个循环后，除Ki-67、P-gp外均检测到阳性结果。
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图1 乳腺癌，P53 1：8 000稀释。×990
图2 c-erbB-2 1:12 000稀释。×990
图3 胶质细胞Ⅲ级，nm23 1: 80 000稀释。×990
图4 P-gp(C219)1：8 000稀释。×396
3 讨论
目前提高免疫组化方法的敏感性有2种途径，一是增加IHC方法的敏感性，例如IGSS、增强型LSAB及最近推出的EnVision法和CSA系统，其方法的敏感性较PAP、APAAP、ABC和SABC法有了较为显著的提高，另一途径是通过对石蜡切片酶消化或热处理使IHC检测敏感性大为提高，使许多原来仅在冷冻切片上表达的抗原能用于石蜡切片。CSA法是一种全新的IHC方法，其敏感性可以与IGSS法媲美，而CSA法克服了IGSS法的高背景，操作也较IGSS简便，是值得推广的一种新方法。C
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SA法应用到原位分子杂交的检测〔7〕，较常规方法敏感，本实验室已应用CSA法检测nm23、MDR、p16、bcl-2、HPV、HBV的cRNA和cDNA探针，并获得较为理想的结果。
近来推出的EnVision也有较高的敏感性，但CSA法要比EnVision法敏感20～100倍，但流程多、孵育时间长，背景染色不如EnVision法。作者认为EnVision法非常适合于IHC的鉴别诊断，而CSA法适合于实验病理学和第一抗体昂贵、抗原性较弱的IHC检测。在使用CSA法过程中，生物素化酪胺分子的浓度不能太高，一般在0.009～0.007 μmol。L-1，如超过0.01 μmol。L-1，常会出现核内的高背景染色，同时酪胺分子是HRP在H2O2存在下进行催化反应，因此时间一般15 min即可。由于该方法仅开展了几十种抗体，对部分肿瘤的检测可能存在一些问题，只有通过大量的使用才能对该方法作出全面的评价。
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最近，Sabattint等〔8〕介绍利用IHC的EnVision法和53种抗体(均为CD系列)对各类淋巴瘤进行了检测，并和PAP、ABC、SABC、LSAB和CSA法进行比较，认为EnVison较其它方法敏感5～6倍，与CSA法基本一致。此结果与本文所获结果不一致，有待进一步探讨。另外，Sabattint还发现有5例标本因固定时间太长(1周)，其它方法均为阴性结果，仅CSA法阳性表达。这与本文2例胃癌固定5天(其它方法均阴性，仅CSA法阳性表达)的结果相符，认为CSA可作为抗原破坏严重、抗原量较少的组织细胞抗原的检测方法。
作者简介：倪灿荣，男，41岁，高级实验师，上海病理学会委员，主要从事免疫组化和原位杂交的技术工作
参考文献
1，Bobrow MN. Harris TD, Shaughnessy KJ et al. Catalyzed reporter deposition, a novel methed of singal amplification. Application to immunoassys. J Immunol Methods,1989;125:279
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2，Adams JC. Biotin amplification of biotin and horseradish peroxidase signals in histochemical stains. J Histochem Cytochem,1992;40:1457
3，Vander Loos CM, Naruko T, Becker AE. The use of enhanced polymer onestep staining reagents for immunoenzyme double-lakelling. Histochem J,1996;28:709
4，Chilosi M, Lestani M, Pedron S et al. A rapid immunostaining method for frozen sections. Biotech Histochem,1994;69:235
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5，倪仙荣. 免疫组织化学实验新技术及应用. 北京：科学技术出版社，1993：P36
6，倪仙荣. 影响免疫组织化学染色结果的各种因素. 中华病理学杂志，1996；25(6)：383～384
7，Kerstens HMJ, Poddighe PJ, Hanselaar AGJM. A novel in situ bybridization signal amplification method based on the deposition of biotinylated tyramine. J Histochem Cytochem,1995;43:437～352
8，Sabattini E, Bisgaard K, Ascani S et al. The Envision TM+ system: a new immunohistochemical method for diagnostic and research. Critical comparison with the APAAP, Chem Mate TM, CSA, LSAB, and SABC Techniques. J Clin Pathol,1998;51:506～511
收稿日期：1999-01-20
修稿日期：1999-03-31, 百拇医药