rhTPO对巨核系的定向分化效
作者：应宁丰 王良绪
单位：宁丰(北京军区总医院血液科，北京100700)；王良绪(北京医科大学第三医院，北京100083)
关键词：重组人促血小板生成素(rhTPO)；外周造血干细胞；诱导
中国免疫学杂志000617 摘 要 目的：探讨重组人促血小板生成素(rhTPO)对外周造血干细胞中巨核系祖细胞的定向诱导分化能力。方法：经化疗及G-CSF动员后分离的外周造血干细胞，进行液体和集落培养，研究rhTPO单独及与IL-3、IL-6、SCF的协同作用。结果：液体培养后，TPO组单个核细胞数(MNC)扩增了(1.73±0.49)倍，IL-3+IL-6+SCF组MNC比种植时增加(4.20±1.14)倍，IL-3+IL-6+SCF+TPO组MNC增加了(4.53±1.27)倍。单独应用TPO及TPO与IL-3、IL-6、SCF合用产生高比例的CD41a+细胞，TPO组培养前CD41a+细胞为11.70%±5.23%，培养后CD41a+细胞为19.17%±6.26%(P<0.05)。CD41a+细胞数在TPO组扩增了(3.52±1.18)倍，IL-3+IL-6+SCF组扩增了(5.32±1.79)倍，IL-3+IL-6+SCF+TPO组扩增了(6.94±2.19)倍。结论：TPO可以定向诱导巨核系细胞的分化，IL-3、IL-6、SCF可以协同TPO的作用，这在造血调控研究，体外定向扩增外周血干细胞，促进外周造血干细胞移植患者血小板的恢复具有应用前景。
, 百拇医药
中国图书分类号 R331.1
Committed differentiation effects of rhTPO on megakaryocyte progenitor cells
NING Feng, WANG Liang-Xu
(Beijing General Hospital of PLA，Beijing 100700)
Abstract Objective:To study the capacity of differentiate committedly of recombinant human thrombopoietin(rhTPO) on megakaryocyte progenitor cells in peripheral stem cells(PBMNC). Methods: PBMNC mobolized by chemotherapy and G-CSF were cultured in suspension and colony culture, study the effects of rhTPO along and/with IL-3,IL-6,SCF.Results: After culture, the MNC counts of PBMNC were expansed up to 1.73±0.49 folds by TPO along, a combinantion of IL-3,IL-6,SCF expands the MNC 4.20±1.14 folds, and a combinantion of IL-3,IL-6,SCF and TPO expands the MNC up to 5.43±1.27 folds. TPO along or a combinantion of TPO with other cytokines result a high percentage of CD41a+ cells,with TPO, CD41a+cells were 11.07%±5.23% before culture and 19.17%±6.26% after culture. After culture, the CD41a+cells were expansed up to 3.52±1.18 folds by TPO along, and up to 5.32±1.79 folds by IL-3,IL-6 and SCF, 6.94±2.19 folds by IL-3,IL-6,SCF and TPO. Conclusion:TPO can inducing megakaryocyte progenitor cells differentiate committedly, and IL-3,IL-6 and TPO can synergized with TPO.
, 百拇医药
Key words Recombinant human thrombopoietin(rhTPO) Peripheral stem cells(PBMNC) Induce
造血干/祖细胞的分离纯化及体外扩增是近年研究的热点之一[1]，目前的扩增手段在扩增干细胞的同时也加速其分化。但利用造血干/祖细胞具有多向分化的性能，通过不同细胞因子的组合，定向诱导其分化，可以产生所需的功能细胞[2]。我们利用TPO与IL-3、IL-6、SCF进行组合，研究TPO对巨核系的定向分化效应及与其他细胞因子的协同效应。
1 材料与方法
1.1 标本来源 外周血干细胞标本来源于本科自体外周造血干细胞移植(PBSCT)患者经体内动员后用CS-3000血细胞分离机采集的细胞悬液。
1.2 主要试剂及仪器 IMDM培养液购自Sigma公司。淋巴细胞分离液(Ficollo，比重1.077)、马血清来自中国医学科学院血研所。组氨酸、天冬氨酸及丙酮酸钠均购自北京京科生化试剂公司。2-巯基乙醇购自Sigma公司，配成10-3mol/L浓度。PHA-LCM为本科配制。FITC连接的鼠抗人抗GPIIb/IIIa单克隆抗体(CD41a)购自PharMingen公司。IL-3、IL-6为BectonDickinson公司产品。SCF为Sigma公司产品。rhTPO为日本麒麟公司提供。APAAP试剂盒来自军事医学科学院。
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1.3 单个核细胞分离 CS-3000分离的细胞悬液，肝素抗凝，IMDM充分稀释，置于淋巴细胞分离液上，梯度离心，收集界面的单个核细胞(MNC)，洗涤，在塑料培养皿中37C孵育2 h，去除贴壁细胞及残留血小板，洗涤备用，取部分细胞测定CD41a的表达。
1.4 FACS分析 分析CD41a+细胞纯度用流式细胞仪。所用分析软件为LYSIS II， 氩离子激光器激发光为488 mm，FITC的发射光530 mm，激光功率15 mW。
1.5 外周血干细胞体外液体培养体系 IMDM培养基中每2 ml体系含马血清0.7 ml(35%)，2-巯基乙醇10-5mol/L，3%组氨酸、3%天冬氨酸0.03 ml，PHA-LCM 0.2 ml，CD41a+细胞浓度5×105个/ml。上述体系接种于24孔板(Costar)中，每孔1 ml，37C、5%及饱和湿度的CO2培养箱中培养，第7天取细胞测定细胞总数、CD41a+细胞比例。
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1.6 CFU-MK、CFU-Mix集落培养 培养体系及细胞因子同液体体系另加0.8%甲基纤维素，培养10 d。
1.7 CFU-MK、CFU-Mix集落计数及鉴定 倒置镜下直接计数，含有3个以上巨核细胞的集落为CFU-MK，含有巨核细胞及大小不等50个以上细胞的集落为CFU-Mix。巨核细胞集落经抗CD41a单克隆抗体APAAP染色证实。
1.8 重组造血生长因子及浓度 IL-3 40 ng/ml，IL-6 40 ng/ml，SCF 10 ng/ml，TPO 50 ng/ml。实验分组：对照组不加生长因子，TPO、IL-3、IL-6、SCF分别进行单独和不同的组合。
1.9 统计学处理 所有数据的统计学处理采用SPSS软件，统计方法ANOA，P<0.05为统计学意义。
2 结果
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经化疗及G-CSF动员的外周血干细胞在液体培养体系中测定培养前后活细胞数及CD41a+细胞的变化(表1)。除对照组外，其它加因子组细胞总数与种植的细胞数相比均有增长，以IL-3+IL-6+SCF组及IL-3+IL-6+TPO组增加最明显，比种植的细胞分别增加了(4.20±1.14)倍、(5.32±1.79)倍。这两个实验组培养后的细胞总数与对照组的细胞总数相比有统计学差异(P<0.05)。
表1 CS-3000分离的外周血干细胞液体培养7 d后细胞总数及CD41a+细胞的变化
Tab.1 The MNC and CD41a+ cells of PBMNC after 7 days liquid culture Group
MNC(×105)
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CD41a+(%)
Fold increase of MNC
Fold increase of CD41a+cells
Control
4.38±0.60
8.33±2.67
0.86±0.12
0.71±0.12
TPO
9.53±2.23
19.17±6.62
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1.73±0.49
3.52±1.18
IL-3
10.83±2.51
11.46±4.47
2.17±0.50
2.53±1.12
IL-3+IL-6+SCF
21.00±5.71
13.38±5.57
4.20±1.14
5.23±1.79
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IL-3+IL-6+SCF+TPO
22.67±6.33
16.15±6.46
4.53±1.27
6.94±2.19
Note:The planting cell number were 5.0×105，the CD41a+ cells were 11.07%±5.23% before culturre
在CD41a+细胞的测定中，单独应用TPO组及TPO与IL-3、IL-6、SCF合用组CD41a+细胞的比例高于其它组。培养后TPO组CD41a+阳性率为19.17%±6.26%；IL-3+IL-6+SCF+TPO组CD41a+细胞为16.15%±6.46%，对照组与TPO组之间CD41a+细胞比例的差别有统计学意义(P<0.05)。各组培养前后CD41a+细胞数增殖倍数以TPO组[(3.52±1.18)倍]、IL-3+IL-6+SCF组[(5.32±1.79)倍]、IL-3+IL-6+SCF+TPO组[(6.94±2.19)倍]为多，3组培养前后CD41a+细胞的增殖倍数与对照组相比均有统计学差别(P<0.05)。集落分析见表2。
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表2 外周血干细胞CFU-MK和CFU-Mix集落结果
Tab.2 The CFU-MK and CFU-Mix colonies of PBMNC Group
CFU-MK
colonies/2×105MNC
CFU-Mix
colonies/2×105MNC
Control
4.10±3.40
2.00±2.00
TPO
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16.80±5.60
11.30±5.10
IL-3
13.40±4.10
12.00±4.70
IL-3+IL-6+SCF
17.80±7.90
21.40±4.30
IL-3+IL-6+SCF+TPO
26.60±5.30
27.40±6.90
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3 讨论
CD41a+抗原表达在巨核细胞和血小板的表面，是巨核系的特异性标志。TPO可以使动员的外周血干细胞中所含的巨核系祖细胞增殖及分化，使表达GP IIb/IIIa的CD41a+细胞增加[3]，液体培养结果显示TPO单独应用能扩增MNC(1.73±0.49)倍，且TPO组CD41a+细胞的比例和绝对数均高于对照组(P<0.05)，说明TPO对巨核系的特异性作用，单独应用TPO可以引起巨核系细胞的增殖和分化。而其它细胞因子对巨核系的作用则不是特异性的。如混合因子加TPO组，由于引起多系细胞的增殖，从而使CD41a+细胞的比例并不高，但CD41a+ 细胞的增殖倍数最多，与TPO组的CD41a+细胞的增殖倍数相比有统计学差异。说明IL-3、IL-6、SCF这些早期细胞因子可以协同TPO促进细胞中所含的巨核系祖细胞的增殖和分化[4-6]。集落分析显示TPO与IL-3都能刺激CFU-MK和CFU-Mix形成，含TPO的混合因子组的CFU-MK和CFU-Mix集落数明显高于不含TPO的混合因子组(P<0.01)。与IL-3相比，TPO对巨核系的细胞具有特异性，IL-3作用的靶细胞为早期的组细胞，对巨核系的促增殖和分化作用不如TPO。
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利用造血干/祖细胞具有多向分化的潜能，采用不同的造血因子组合，将分离的外周血干细胞中的部分细胞定向诱导分化，产生大量所需的功能细胞，这些细胞输入体内后可以很快使患者的血小板或粒细胞恢复，因此减少了感染的出血的发生，从而提高了干细胞移植或大剂量化疗的安全性，提高了肿瘤的治疗效果，我们的实验表明，TPO具有巨核系的定向诱导分化特性，可以诱导外周血干细胞向巨核系细胞分化。
作者简介：宁丰，女，34岁，硕士，主治医师
参考文献
1，Berardi A C,Wang A,Levin J D et al.Function isolation and characterition of human hematopoietic stem cells. Science, 1995；267：104
2，Emerson S G. Exvivo expansion of hematopoietic precursors, progenitors ans stem cells: the next generation of cellular thrapeutics. Blood, 1996；87：3082
, 百拇医药
3，K aushansky K, Lin N, Grossmann A et al.Thrombopoietin expands erythroid, granulocyte-macrophage, and megakaryocyte progenitor cells in normal and myelosupperssed mice.Exp Hematol, 1996；24；265
4，Kaushansky K, Lok S, Holly R D et al.Promotion of megakaryocyte progenitor expansion and differention by the c-mpl ligand thrombopoietin.Nature，1994；369：568
5，Angchaisuksiri P,Carlson P L,Dessypris E N. Effects of recombinant human thrombopoietin on megakaryocyte colony formation and megakaryoicyte ploidy by human CD34+cells in a serum free system.Br J Hanmatol，1996；93：13
6，Wernet P,Callejas J, Miggliaccio A et al.The effect of different growth factor combinations and medium on the exvivo expansion of umbilical cord blood committed and primitive progenitors. Exp Hematol，1996；24：1049
收稿1999-06-25, http://www.100md.com
单位：宁丰(北京军区总医院血液科，北京100700)；王良绪(北京医科大学第三医院，北京100083)
关键词：重组人促血小板生成素(rhTPO)；外周造血干细胞；诱导
中国免疫学杂志000617 摘 要 目的：探讨重组人促血小板生成素(rhTPO)对外周造血干细胞中巨核系祖细胞的定向诱导分化能力。方法：经化疗及G-CSF动员后分离的外周造血干细胞，进行液体和集落培养，研究rhTPO单独及与IL-3、IL-6、SCF的协同作用。结果：液体培养后，TPO组单个核细胞数(MNC)扩增了(1.73±0.49)倍，IL-3+IL-6+SCF组MNC比种植时增加(4.20±1.14)倍，IL-3+IL-6+SCF+TPO组MNC增加了(4.53±1.27)倍。单独应用TPO及TPO与IL-3、IL-6、SCF合用产生高比例的CD41a+细胞，TPO组培养前CD41a+细胞为11.70%±5.23%，培养后CD41a+细胞为19.17%±6.26%(P<0.05)。CD41a+细胞数在TPO组扩增了(3.52±1.18)倍，IL-3+IL-6+SCF组扩增了(5.32±1.79)倍，IL-3+IL-6+SCF+TPO组扩增了(6.94±2.19)倍。结论：TPO可以定向诱导巨核系细胞的分化，IL-3、IL-6、SCF可以协同TPO的作用，这在造血调控研究，体外定向扩增外周血干细胞，促进外周造血干细胞移植患者血小板的恢复具有应用前景。
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中国图书分类号 R331.1
Committed differentiation effects of rhTPO on megakaryocyte progenitor cells
NING Feng, WANG Liang-Xu
(Beijing General Hospital of PLA，Beijing 100700)
Abstract Objective:To study the capacity of differentiate committedly of recombinant human thrombopoietin(rhTPO) on megakaryocyte progenitor cells in peripheral stem cells(PBMNC). Methods: PBMNC mobolized by chemotherapy and G-CSF were cultured in suspension and colony culture, study the effects of rhTPO along and/with IL-3,IL-6,SCF.Results: After culture, the MNC counts of PBMNC were expansed up to 1.73±0.49 folds by TPO along, a combinantion of IL-3,IL-6,SCF expands the MNC 4.20±1.14 folds, and a combinantion of IL-3,IL-6,SCF and TPO expands the MNC up to 5.43±1.27 folds. TPO along or a combinantion of TPO with other cytokines result a high percentage of CD41a+ cells,with TPO, CD41a+cells were 11.07%±5.23% before culture and 19.17%±6.26% after culture. After culture, the CD41a+cells were expansed up to 3.52±1.18 folds by TPO along, and up to 5.32±1.79 folds by IL-3,IL-6 and SCF, 6.94±2.19 folds by IL-3,IL-6,SCF and TPO. Conclusion:TPO can inducing megakaryocyte progenitor cells differentiate committedly, and IL-3,IL-6 and TPO can synergized with TPO.
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Key words Recombinant human thrombopoietin(rhTPO) Peripheral stem cells(PBMNC) Induce
造血干/祖细胞的分离纯化及体外扩增是近年研究的热点之一[1]，目前的扩增手段在扩增干细胞的同时也加速其分化。但利用造血干/祖细胞具有多向分化的性能，通过不同细胞因子的组合，定向诱导其分化，可以产生所需的功能细胞[2]。我们利用TPO与IL-3、IL-6、SCF进行组合，研究TPO对巨核系的定向分化效应及与其他细胞因子的协同效应。
1 材料与方法
1.1 标本来源 外周血干细胞标本来源于本科自体外周造血干细胞移植(PBSCT)患者经体内动员后用CS-3000血细胞分离机采集的细胞悬液。
1.2 主要试剂及仪器 IMDM培养液购自Sigma公司。淋巴细胞分离液(Ficollo，比重1.077)、马血清来自中国医学科学院血研所。组氨酸、天冬氨酸及丙酮酸钠均购自北京京科生化试剂公司。2-巯基乙醇购自Sigma公司，配成10-3mol/L浓度。PHA-LCM为本科配制。FITC连接的鼠抗人抗GPIIb/IIIa单克隆抗体(CD41a)购自PharMingen公司。IL-3、IL-6为BectonDickinson公司产品。SCF为Sigma公司产品。rhTPO为日本麒麟公司提供。APAAP试剂盒来自军事医学科学院。
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1.3 单个核细胞分离 CS-3000分离的细胞悬液，肝素抗凝，IMDM充分稀释，置于淋巴细胞分离液上，梯度离心，收集界面的单个核细胞(MNC)，洗涤，在塑料培养皿中37C孵育2 h，去除贴壁细胞及残留血小板，洗涤备用，取部分细胞测定CD41a的表达。
1.4 FACS分析 分析CD41a+细胞纯度用流式细胞仪。所用分析软件为LYSIS II， 氩离子激光器激发光为488 mm，FITC的发射光530 mm，激光功率15 mW。
1.5 外周血干细胞体外液体培养体系 IMDM培养基中每2 ml体系含马血清0.7 ml(35%)，2-巯基乙醇10-5mol/L，3%组氨酸、3%天冬氨酸0.03 ml，PHA-LCM 0.2 ml，CD41a+细胞浓度5×105个/ml。上述体系接种于24孔板(Costar)中，每孔1 ml，37C、5%及饱和湿度的CO2培养箱中培养，第7天取细胞测定细胞总数、CD41a+细胞比例。
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1.6 CFU-MK、CFU-Mix集落培养 培养体系及细胞因子同液体体系另加0.8%甲基纤维素，培养10 d。
1.7 CFU-MK、CFU-Mix集落计数及鉴定 倒置镜下直接计数，含有3个以上巨核细胞的集落为CFU-MK，含有巨核细胞及大小不等50个以上细胞的集落为CFU-Mix。巨核细胞集落经抗CD41a单克隆抗体APAAP染色证实。
1.8 重组造血生长因子及浓度 IL-3 40 ng/ml，IL-6 40 ng/ml，SCF 10 ng/ml，TPO 50 ng/ml。实验分组：对照组不加生长因子，TPO、IL-3、IL-6、SCF分别进行单独和不同的组合。
1.9 统计学处理 所有数据的统计学处理采用SPSS软件，统计方法ANOA，P<0.05为统计学意义。
2 结果
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经化疗及G-CSF动员的外周血干细胞在液体培养体系中测定培养前后活细胞数及CD41a+细胞的变化(表1)。除对照组外，其它加因子组细胞总数与种植的细胞数相比均有增长，以IL-3+IL-6+SCF组及IL-3+IL-6+TPO组增加最明显，比种植的细胞分别增加了(4.20±1.14)倍、(5.32±1.79)倍。这两个实验组培养后的细胞总数与对照组的细胞总数相比有统计学差异(P<0.05)。
表1 CS-3000分离的外周血干细胞液体培养7 d后细胞总数及CD41a+细胞的变化
Tab.1 The MNC and CD41a+ cells of PBMNC after 7 days liquid culture Group
MNC(×105)
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CD41a+(%)
Fold increase of MNC
Fold increase of CD41a+cells
Control
4.38±0.60
8.33±2.67
0.86±0.12
0.71±0.12
TPO
9.53±2.23
19.17±6.62
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1.73±0.49
3.52±1.18
IL-3
10.83±2.51
11.46±4.47
2.17±0.50
2.53±1.12
IL-3+IL-6+SCF
21.00±5.71
13.38±5.57
4.20±1.14
5.23±1.79
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IL-3+IL-6+SCF+TPO
22.67±6.33
16.15±6.46
4.53±1.27
6.94±2.19
Note:The planting cell number were 5.0×105，the CD41a+ cells were 11.07%±5.23% before culturre
在CD41a+细胞的测定中，单独应用TPO组及TPO与IL-3、IL-6、SCF合用组CD41a+细胞的比例高于其它组。培养后TPO组CD41a+阳性率为19.17%±6.26%；IL-3+IL-6+SCF+TPO组CD41a+细胞为16.15%±6.46%，对照组与TPO组之间CD41a+细胞比例的差别有统计学意义(P<0.05)。各组培养前后CD41a+细胞数增殖倍数以TPO组[(3.52±1.18)倍]、IL-3+IL-6+SCF组[(5.32±1.79)倍]、IL-3+IL-6+SCF+TPO组[(6.94±2.19)倍]为多，3组培养前后CD41a+细胞的增殖倍数与对照组相比均有统计学差别(P<0.05)。集落分析见表2。
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表2 外周血干细胞CFU-MK和CFU-Mix集落结果
Tab.2 The CFU-MK and CFU-Mix colonies of PBMNC Group
CFU-MK
colonies/2×105MNC
CFU-Mix
colonies/2×105MNC
Control
4.10±3.40
2.00±2.00
TPO
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16.80±5.60
11.30±5.10
IL-3
13.40±4.10
12.00±4.70
IL-3+IL-6+SCF
17.80±7.90
21.40±4.30
IL-3+IL-6+SCF+TPO
26.60±5.30
27.40±6.90
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3 讨论
CD41a+抗原表达在巨核细胞和血小板的表面，是巨核系的特异性标志。TPO可以使动员的外周血干细胞中所含的巨核系祖细胞增殖及分化，使表达GP IIb/IIIa的CD41a+细胞增加[3]，液体培养结果显示TPO单独应用能扩增MNC(1.73±0.49)倍，且TPO组CD41a+细胞的比例和绝对数均高于对照组(P<0.05)，说明TPO对巨核系的特异性作用，单独应用TPO可以引起巨核系细胞的增殖和分化。而其它细胞因子对巨核系的作用则不是特异性的。如混合因子加TPO组，由于引起多系细胞的增殖，从而使CD41a+细胞的比例并不高，但CD41a+ 细胞的增殖倍数最多，与TPO组的CD41a+细胞的增殖倍数相比有统计学差异。说明IL-3、IL-6、SCF这些早期细胞因子可以协同TPO促进细胞中所含的巨核系祖细胞的增殖和分化[4-6]。集落分析显示TPO与IL-3都能刺激CFU-MK和CFU-Mix形成，含TPO的混合因子组的CFU-MK和CFU-Mix集落数明显高于不含TPO的混合因子组(P<0.01)。与IL-3相比，TPO对巨核系的细胞具有特异性，IL-3作用的靶细胞为早期的组细胞，对巨核系的促增殖和分化作用不如TPO。
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利用造血干/祖细胞具有多向分化的潜能，采用不同的造血因子组合，将分离的外周血干细胞中的部分细胞定向诱导分化，产生大量所需的功能细胞，这些细胞输入体内后可以很快使患者的血小板或粒细胞恢复，因此减少了感染的出血的发生，从而提高了干细胞移植或大剂量化疗的安全性，提高了肿瘤的治疗效果，我们的实验表明，TPO具有巨核系的定向诱导分化特性，可以诱导外周血干细胞向巨核系细胞分化。
作者简介：宁丰，女，34岁，硕士，主治医师
参考文献
1，Berardi A C,Wang A,Levin J D et al.Function isolation and characterition of human hematopoietic stem cells. Science, 1995；267：104
2，Emerson S G. Exvivo expansion of hematopoietic precursors, progenitors ans stem cells: the next generation of cellular thrapeutics. Blood, 1996；87：3082
, 百拇医药
3，K aushansky K, Lin N, Grossmann A et al.Thrombopoietin expands erythroid, granulocyte-macrophage, and megakaryocyte progenitor cells in normal and myelosupperssed mice.Exp Hematol, 1996；24；265
4，Kaushansky K, Lok S, Holly R D et al.Promotion of megakaryocyte progenitor expansion and differention by the c-mpl ligand thrombopoietin.Nature，1994；369：568
5，Angchaisuksiri P,Carlson P L,Dessypris E N. Effects of recombinant human thrombopoietin on megakaryocyte colony formation and megakaryoicyte ploidy by human CD34+cells in a serum free system.Br J Hanmatol，1996；93：13
6，Wernet P,Callejas J, Miggliaccio A et al.The effect of different growth factor combinations and medium on the exvivo expansion of umbilical cord blood committed and primitive progenitors. Exp Hematol，1996；24：1049
收稿1999-06-25, http://www.100md.com