NMDA受体亚基NR1的体外表达及功能检测
作者：黄福南 刘建伟 房征宇 韩志涛 崔旭 张炳烈 李文彬
单位：解放军总医院老年医学研究所，北京 100853
关键词：NMDA受体；亚基；体外表达；电压钳位
军医进修学院学报000308 [摘要]目的：体外表达NMDA受体亚基NR1 并了解其电生理学特性，探讨体外表达受体亚基的意义。方法：将克隆的NMDA受体亚基NR1 质粒DNA经体外转录成RNA，显微注射到爪蟾卵母细胞后进行受体表达，采用双电极电压钳位技术记录表达的NR1 亚基的激活电流。结果：注射NR1 亚基RNA的爪蟾卵母细胞能表达出具有电生理学功能的受体，其激活电流能被D-AP5 阻断等特性，说明该表达的NR1 亚基具有NMDA受体的功能。结论：爪蟾卵母细胞表达的NR1 亚基具有NMDA受体的生物学功能，爪蟾卵母细胞可以用于体外受体表达。
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中图号：R34 文献标识码：A
文章编号：1005-1139(2000)03-0184-03
In vitro expression and functional dection of one subunit (NR1) of NMDA receptor
HUANG Fu-nan, LIU Jian-wei, FANG Zheng-yu,HAN Zhi-tao, CUI Xu, ZHANG Bing-lie, LI Wen-bin
(Institue of Gerontology and Geriatrics, Departments of Neurobiology and Neurology, PLA General Hospital, Beijing 100853, China)
, 百拇医药
Objective:It was designed to execute in vitro expression and functional dection of one subunit (NR1) of NMDA receptor and to investigate NR1′s electrophysiology characteristics. Methods:Primitive NR1 plasmid DNA from Nakanishi (Japan) was transformed into DH5α and identified by enzyme Not I cut. Then large scale plasmid DNA was prepared and transcripted into RNA. The obtained RNA was microinjected into matured Xenopus oocytes (50 nl, 1 ng/nl) for receptor expression over 24 h incubation in modified Bath′s solution at a temperature of -19 ℃. The functions of these expressed NR1 subunit were detected via two electrode voltage clamp technique. Results:An inward current was induced by 10-4 mol/L NMDA in Xenopus oocytes microinjected with the obtained RNA transcripted from NR1 plasmid DNA. The equibrilium potential of the current was -22 mV, which is close to those of chloride ions. This current could be completely inhibited by the specific antagoinst D-AP5 of NMDA receptor and was dependent on glycine (10-4 mol/L). This current was also blocked by the presence of Mg2+, which was inhibited by the replacement of CaCl2 with MgCl2 in Ringer′s solution. Conclusion:The NR1 subunit of NMDA receptor is functionally in vitro expressed in Xenopus oocytes. Its physiological and pharmacological characteristic is similar to those of whole NMDA receptor.
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Key words:NMDA receptor; subunits; in vitro expression; voltage clamp
以谷氨酸受体(GluR)为代表的兴奋性氨基酸受体在中枢神经系统具有重要的生理和病理学作用。它既可以介导脑生理学功能如学习记忆的形成，又可以产兴奋毒导致神经元丢失[1]。GluR在神经系统疾病如脑缺血再灌注损伤和神经变性疾病中的作用越来越受到重视[2]。GluR又可以进一步分为NMDA受体和非NMDA受体。随着对GluR研究的不断深入，其分子结构和核苷酸序列得到阐明。NMDA受体(NMDAR)由 5 个亚基组成，分别为NR1 和NR2A-D。1991 年日本东京大学Nakanishi教授研究小组首先在国际上成功地克隆出NMDA受体亚基NR1 和NR2[3]。我们在 1998 年受Nakanishi教授惠赠NMDAR受体质粒DNA，成功地进行了体外表达并对其生理药理特性等进行了观察。
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1 材料和方法
1.1 实验动物 15 只供受体表达用的 1.5～3.0 岁成年雌性非洲爪蟾购自于中国科学院发育所。
1.2 主要试剂 质粒DNA、RNA制备试剂盒(Promega、Qgen公司)，全部的受体激动剂和拮抗剂(Sigma公司)，其它生化试剂均购自华美公司，分析纯。
1.3 实验仪器 双电极电压钳位仪CEZ1100(Nihon Khoden公司)，微电极拉制仪PY-3 (Narishige公司)，数字控温仪TC-1A(北京器件六厂)，紫外分光光度计UV-365(日本岛津)，高速低温台式离心机R22 (德国)。
1.4 质粒DNA的提纯、鉴定及大量制备 NR1质粒(pN60)， 7.2 kb，由pBSⅡ KS+骨架构建，内切酶为NotI，体外转录采用T7RNA多聚酶。原始质粒转化到感受态大肠杆菌DH5α后经蓝白斑筛选阳性转化子，再进行接种扩增，提取质粒DNA进行酶切(NotI)鉴定DNA片段大小。与原始质粒片段长度相同者再进行大量扩增，提取大量质粒DNA，再一次经NotI酶切鉴定确认DNA片段大小，定量后溶解于TE (0.1 μg/μl)。
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1.5 体位转录合成RNA 采用依赖于DNA的RNA多聚酶(T7RNA多聚酶)进行体外转录，并于 5′端加帽 m7GpppG以稳定转录产物。反应体系为： 30 μl NR1 质粒DNA、10×转录缓冲液 10 μl、RNasin 40 单位、加无RNase水至 99 μl。 50 单位T7RNA多聚酶启动转录， 37 ℃ 60 min。加 5U DNaseRQ-1 37 ℃ 15 min去除DNA，酚氯仿抽提后定量，制成RNA水溶液 (1 μg/μl)。
1.6 卵母细胞的获取及显微注射 冰浴麻醉非洲爪蟾，下腹部外侧切口取爪蟾卵母细胞，挑选直径 1.0～1.5 mm 大小、动植物极境界分明、成熟的Ⅳ～Ⅴ期卵母细胞，并以改良蛙Bath液 (mmol/L: NaCl 88，KCl 1，Mg2SO4 0.82，Ca(NO3)2 0.33, CaCl2 0.41, NaHCO3 2.4, HEPES 10)，反复冲洗。在解剖显微镜下通过微量注射仪将体外转录所得RNA (1 μg/μl) 按每个卵母细胞 50 nl 注射到动物极。在 (19±1.0) ℃ 条件下采用改良蛙Bath液孵育 24～48 h 后进行受体功能检测[4，5]。
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1.7 表达的受体电流测定 采用双电极电压钳位仪(CEZ3100)在 -60 mV 维持电位条件下记录表达的受体电流值。注射mRNA的卵母细胞置于约 1 ml 体积的微型浴槽中，以任氏液 (mmol/L: NaCl 115, KCl 1, CaCl2 1.8, HEPES 5) 灌注，流速为每分钟 5 ml。电压电极内灌注 3 mol/L KCl，电流电极内灌注 3 mol/L 醋酸钾，电极电阻在 3～5 mΩ，于 23～25 ℃ 环境温度下加入不同的激动剂记录受体的激活电流[6]。
2 结 果
2.1 爪蟾卵母细胞对NR1的表达 注射NR1亚基RNA的卵母细胞经 24 h 恒温孵育后即可以开始记录。以 10-4 mol/L NMDA作用于注射后的卵母细胞可以记录到一个nA级的内向震荡型电流。它能被NMDA受体的特异性阻断剂D-AP5 阻断。通过阶跃分级钳位 (20 mV, -20 mV, -60 mV, -90 mV 维持电位)检测到其平衡电位为 -22 mV，接近于Cl-平衡电位，说明其载流离子为Cl-，结果见附图(左栏)。
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2.2 表达的NR1生理药理特性 当以 10-4 mol/L NMDA作用时，在 -60 mV 钳制电位下其表现为内向电流。该电流依赖于甘氨酸 (10-4 mol/L) 的存在，并且能被 10-4 mol/L MgCl2 阻断。当将记录液(Ringer液)中的CaCl2以BaCl2替代时该电流消失(附图，右栏)。
附图 表达的NR1亚基电流的生理药理学特性
左栏：在不同的钳制电位下表达的NR1电流(a～d)，可以见到当钳制电位在 -20 mV 条件下电流值接近于零，说明该电流的载流离子的平衡电位接近 -20 mV (c)。右栏：在 -60 mV 的钳制电位下观察的NR1生理药理学特性，即能被NMDA受体的特异性拮抗剂D-AP5阻断(e)、甘氨酸依赖性(f)、被Mg2+阻断(g)、胞外钙离子依赖性即当记录液(Ringer液)中的CaCl2以BaCl2替代时该电流消失(h)。NMDA：10-4 mol/L;D-AP5:10-5 mol/L；甘氨酸：10-4 mol/L；MgCl2:10-4 mol/L
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3 讨 论
爪蟾卵母细胞已被广泛地用于功能性大分子的体外表达研究，特别是用于研究神经递质受体。本实验室自 80 年代中期开始应用此实验模式进行了多种神经递质受体功能的研究，成功地在爪蟾母细胞表达了ACh、谷氨酸受体等[4，6，7]。这些移植到爪蟾卵细胞膜上的受体分子可以和卵母细胞膜上天然的钙依赖氯通道耦合，形成受体通道复合物。表达的受体激活后将导致该氯道激活产生内向氯离子电流。通过采用电压钳位技术检测该复合物的电流就可以真实地反映相应受体的功能[5，7，8]。
本研究成功地从质粒DNA经体外转录后在卵母细胞表达了NMDA受体的一个功能亚基NR1。该亚基具有被NMDA受体特异性阻断剂D-AP5阻断、甘氨酸依赖性、被Mg2+阻断等经典NMDA受体的生理药理特性[3]。通过分级钳位发现当维持电位在 -20 mV 时该表达的受体电流接近于 0，说明其平衡电位接近于 -20 mV，通过计算得出为 -22 mV。这说明该电流由Cl-载流。所有这些特征都符合NMDA受体和爪蟾卵母细胞表达的受体电流特征。
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由于兴奋性氨基酸受体在神经系统具有重要的生理和病理学意义，国内外与之有关的研究报道较多。由于NMDA受体在兴奋毒、细胞凋亡、信号转导、学习记忆机制等方面起重要作用[1~3]，其亚基的克隆、体外表达成功对NMDA受体的深入研究，特别是在亚基的装配等领域具有重要意义。同时对研究NMDA受体在神经系统疾病的发生机制中的作用也可以作为一个较便利的疾病模型。
(致谢：感谢日本东京大学Nakanishi教授提供pN60 质粒DNA，军事医学科学院基因工程研究所苏国富教授提供的DH5α大肠杆菌，军事医学科学院王海涛教授等提供的大力支持)
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39470761)；“九五”军队科研基金项目(98Q091)
作者简介：黄福南(1968-)，男，江西九江籍，1998年军医进修学院博士毕业，主治医师、助研，从事神经系统变性病发病机制与防治研究；发表论文10篇。电话：(010)66939654
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[参考文献]
[1] Ikonomidou C, Bosch F, Miksa M, et al. Blockade of NMDA receptors and apoptotic neurodegeneration in the developing brain [J]. Science, 1999,283:70-74.
[2] Arias C, Becerra-Garcia F, Tapia R. Glutamic acid andAlzheimer′s disease [J]. Neurobiology, 1998,6(1):33-43.
[3] Ishiii T, Moriyoshi K, Sugihara H, et al. Molecular characterization of the faimly of the Nmethyl-D-aspartate receptor subunits [J]. Biol Chem, 1993,268:2836-2843.
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[4] LI Wen-Bin, LI Yu-Zhen, CUI Xu, et al. Features of ion current induced by acetylcholine in Xenopus oocytes injected with sheep blood lymphocyte mRNA[J]. Acta Zoologica Sinica , 1998,44:213-218.
[5] Carpenter MK, Parker I, Miledi R. Messenger RNAs coding for receptors and channels in the cerebral cortex of adult and aged rats 黄福南，陈丰，李文彬,等.淀粉样β蛋白对表达的鼠脑乙酰胆碱受体功能的影响[J].中华精神科杂志，2000，33(2)：39-41.
[7] Huang Funan, Li WB, Zhang BL, et al. Effects of amyloid β protein1-40 on the currents of expressed lymphocyte receptors in Xenopus oocytes [J]. Chin J Toxicol Pharmacol, 2000,1:1-4.
[8] Oosawa Y, Yamagishi S. Rat brain glutamate receptors activate chloride channels in Xenopus oocytes coupled by inositol trisphosphate and Ca2+ [J]. J Physiology, 1989,408:223-232.
收稿日期：2000-01-04； 修回日期：2000-02-28, 百拇医药
单位：解放军总医院老年医学研究所，北京 100853
关键词：NMDA受体；亚基；体外表达；电压钳位
军医进修学院学报000308 [摘要]目的：体外表达NMDA受体亚基NR1 并了解其电生理学特性，探讨体外表达受体亚基的意义。方法：将克隆的NMDA受体亚基NR1 质粒DNA经体外转录成RNA，显微注射到爪蟾卵母细胞后进行受体表达，采用双电极电压钳位技术记录表达的NR1 亚基的激活电流。结果：注射NR1 亚基RNA的爪蟾卵母细胞能表达出具有电生理学功能的受体，其激活电流能被D-AP5 阻断等特性，说明该表达的NR1 亚基具有NMDA受体的功能。结论：爪蟾卵母细胞表达的NR1 亚基具有NMDA受体的生物学功能，爪蟾卵母细胞可以用于体外受体表达。
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中图号：R34 文献标识码：A
文章编号：1005-1139(2000)03-0184-03
In vitro expression and functional dection of one subunit (NR1) of NMDA receptor
HUANG Fu-nan, LIU Jian-wei, FANG Zheng-yu,HAN Zhi-tao, CUI Xu, ZHANG Bing-lie, LI Wen-bin
(Institue of Gerontology and Geriatrics, Departments of Neurobiology and Neurology, PLA General Hospital, Beijing 100853, China)
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Objective:It was designed to execute in vitro expression and functional dection of one subunit (NR1) of NMDA receptor and to investigate NR1′s electrophysiology characteristics. Methods:Primitive NR1 plasmid DNA from Nakanishi (Japan) was transformed into DH5α and identified by enzyme Not I cut. Then large scale plasmid DNA was prepared and transcripted into RNA. The obtained RNA was microinjected into matured Xenopus oocytes (50 nl, 1 ng/nl) for receptor expression over 24 h incubation in modified Bath′s solution at a temperature of -19 ℃. The functions of these expressed NR1 subunit were detected via two electrode voltage clamp technique. Results:An inward current was induced by 10-4 mol/L NMDA in Xenopus oocytes microinjected with the obtained RNA transcripted from NR1 plasmid DNA. The equibrilium potential of the current was -22 mV, which is close to those of chloride ions. This current could be completely inhibited by the specific antagoinst D-AP5 of NMDA receptor and was dependent on glycine (10-4 mol/L). This current was also blocked by the presence of Mg2+, which was inhibited by the replacement of CaCl2 with MgCl2 in Ringer′s solution. Conclusion:The NR1 subunit of NMDA receptor is functionally in vitro expressed in Xenopus oocytes. Its physiological and pharmacological characteristic is similar to those of whole NMDA receptor.
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Key words:NMDA receptor; subunits; in vitro expression; voltage clamp
以谷氨酸受体(GluR)为代表的兴奋性氨基酸受体在中枢神经系统具有重要的生理和病理学作用。它既可以介导脑生理学功能如学习记忆的形成，又可以产兴奋毒导致神经元丢失[1]。GluR在神经系统疾病如脑缺血再灌注损伤和神经变性疾病中的作用越来越受到重视[2]。GluR又可以进一步分为NMDA受体和非NMDA受体。随着对GluR研究的不断深入，其分子结构和核苷酸序列得到阐明。NMDA受体(NMDAR)由 5 个亚基组成，分别为NR1 和NR2A-D。1991 年日本东京大学Nakanishi教授研究小组首先在国际上成功地克隆出NMDA受体亚基NR1 和NR2[3]。我们在 1998 年受Nakanishi教授惠赠NMDAR受体质粒DNA，成功地进行了体外表达并对其生理药理特性等进行了观察。
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1 材料和方法
1.1 实验动物 15 只供受体表达用的 1.5～3.0 岁成年雌性非洲爪蟾购自于中国科学院发育所。
1.2 主要试剂 质粒DNA、RNA制备试剂盒(Promega、Qgen公司)，全部的受体激动剂和拮抗剂(Sigma公司)，其它生化试剂均购自华美公司，分析纯。
1.3 实验仪器 双电极电压钳位仪CEZ1100(Nihon Khoden公司)，微电极拉制仪PY-3 (Narishige公司)，数字控温仪TC-1A(北京器件六厂)，紫外分光光度计UV-365(日本岛津)，高速低温台式离心机R22 (德国)。
1.4 质粒DNA的提纯、鉴定及大量制备 NR1质粒(pN60)， 7.2 kb，由pBSⅡ KS+骨架构建，内切酶为NotI，体外转录采用T7RNA多聚酶。原始质粒转化到感受态大肠杆菌DH5α后经蓝白斑筛选阳性转化子，再进行接种扩增，提取质粒DNA进行酶切(NotI)鉴定DNA片段大小。与原始质粒片段长度相同者再进行大量扩增，提取大量质粒DNA，再一次经NotI酶切鉴定确认DNA片段大小，定量后溶解于TE (0.1 μg/μl)。
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1.5 体位转录合成RNA 采用依赖于DNA的RNA多聚酶(T7RNA多聚酶)进行体外转录，并于 5′端加帽 m7GpppG以稳定转录产物。反应体系为： 30 μl NR1 质粒DNA、10×转录缓冲液 10 μl、RNasin 40 单位、加无RNase水至 99 μl。 50 单位T7RNA多聚酶启动转录， 37 ℃ 60 min。加 5U DNaseRQ-1 37 ℃ 15 min去除DNA，酚氯仿抽提后定量，制成RNA水溶液 (1 μg/μl)。
1.6 卵母细胞的获取及显微注射 冰浴麻醉非洲爪蟾，下腹部外侧切口取爪蟾卵母细胞，挑选直径 1.0～1.5 mm 大小、动植物极境界分明、成熟的Ⅳ～Ⅴ期卵母细胞，并以改良蛙Bath液 (mmol/L: NaCl 88，KCl 1，Mg2SO4 0.82，Ca(NO3)2 0.33, CaCl2 0.41, NaHCO3 2.4, HEPES 10)，反复冲洗。在解剖显微镜下通过微量注射仪将体外转录所得RNA (1 μg/μl) 按每个卵母细胞 50 nl 注射到动物极。在 (19±1.0) ℃ 条件下采用改良蛙Bath液孵育 24～48 h 后进行受体功能检测[4，5]。
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1.7 表达的受体电流测定 采用双电极电压钳位仪(CEZ3100)在 -60 mV 维持电位条件下记录表达的受体电流值。注射mRNA的卵母细胞置于约 1 ml 体积的微型浴槽中，以任氏液 (mmol/L: NaCl 115, KCl 1, CaCl2 1.8, HEPES 5) 灌注，流速为每分钟 5 ml。电压电极内灌注 3 mol/L KCl，电流电极内灌注 3 mol/L 醋酸钾，电极电阻在 3～5 mΩ，于 23～25 ℃ 环境温度下加入不同的激动剂记录受体的激活电流[6]。
2 结 果
2.1 爪蟾卵母细胞对NR1的表达 注射NR1亚基RNA的卵母细胞经 24 h 恒温孵育后即可以开始记录。以 10-4 mol/L NMDA作用于注射后的卵母细胞可以记录到一个nA级的内向震荡型电流。它能被NMDA受体的特异性阻断剂D-AP5 阻断。通过阶跃分级钳位 (20 mV, -20 mV, -60 mV, -90 mV 维持电位)检测到其平衡电位为 -22 mV，接近于Cl-平衡电位，说明其载流离子为Cl-，结果见附图(左栏)。
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2.2 表达的NR1生理药理特性 当以 10-4 mol/L NMDA作用时，在 -60 mV 钳制电位下其表现为内向电流。该电流依赖于甘氨酸 (10-4 mol/L) 的存在，并且能被 10-4 mol/L MgCl2 阻断。当将记录液(Ringer液)中的CaCl2以BaCl2替代时该电流消失(附图，右栏)。
附图 表达的NR1亚基电流的生理药理学特性
左栏：在不同的钳制电位下表达的NR1电流(a～d)，可以见到当钳制电位在 -20 mV 条件下电流值接近于零，说明该电流的载流离子的平衡电位接近 -20 mV (c)。右栏：在 -60 mV 的钳制电位下观察的NR1生理药理学特性，即能被NMDA受体的特异性拮抗剂D-AP5阻断(e)、甘氨酸依赖性(f)、被Mg2+阻断(g)、胞外钙离子依赖性即当记录液(Ringer液)中的CaCl2以BaCl2替代时该电流消失(h)。NMDA：10-4 mol/L;D-AP5:10-5 mol/L；甘氨酸：10-4 mol/L；MgCl2:10-4 mol/L
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爪蟾卵母细胞已被广泛地用于功能性大分子的体外表达研究，特别是用于研究神经递质受体。本实验室自 80 年代中期开始应用此实验模式进行了多种神经递质受体功能的研究，成功地在爪蟾母细胞表达了ACh、谷氨酸受体等[4，6，7]。这些移植到爪蟾卵细胞膜上的受体分子可以和卵母细胞膜上天然的钙依赖氯通道耦合，形成受体通道复合物。表达的受体激活后将导致该氯道激活产生内向氯离子电流。通过采用电压钳位技术检测该复合物的电流就可以真实地反映相应受体的功能[5，7，8]。
本研究成功地从质粒DNA经体外转录后在卵母细胞表达了NMDA受体的一个功能亚基NR1。该亚基具有被NMDA受体特异性阻断剂D-AP5阻断、甘氨酸依赖性、被Mg2+阻断等经典NMDA受体的生理药理特性[3]。通过分级钳位发现当维持电位在 -20 mV 时该表达的受体电流接近于 0，说明其平衡电位接近于 -20 mV，通过计算得出为 -22 mV。这说明该电流由Cl-载流。所有这些特征都符合NMDA受体和爪蟾卵母细胞表达的受体电流特征。
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(致谢：感谢日本东京大学Nakanishi教授提供pN60 质粒DNA，军事医学科学院基因工程研究所苏国富教授提供的DH5α大肠杆菌，军事医学科学院王海涛教授等提供的大力支持)
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39470761)；“九五”军队科研基金项目(98Q091)
作者简介：黄福南(1968-)，男，江西九江籍，1998年军医进修学院博士毕业，主治医师、助研，从事神经系统变性病发病机制与防治研究；发表论文10篇。电话：(010)66939654
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[参考文献]
[1] Ikonomidou C, Bosch F, Miksa M, et al. Blockade of NMDA receptors and apoptotic neurodegeneration in the developing brain [J]. Science, 1999,283:70-74.
[2] Arias C, Becerra-Garcia F, Tapia R. Glutamic acid andAlzheimer′s disease [J]. Neurobiology, 1998,6(1):33-43.
[3] Ishiii T, Moriyoshi K, Sugihara H, et al. Molecular characterization of the faimly of the Nmethyl-D-aspartate receptor subunits [J]. Biol Chem, 1993,268:2836-2843.
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[4] LI Wen-Bin, LI Yu-Zhen, CUI Xu, et al. Features of ion current induced by acetylcholine in Xenopus oocytes injected with sheep blood lymphocyte mRNA[J]. Acta Zoologica Sinica , 1998,44:213-218.
[5] Carpenter MK, Parker I, Miledi R. Messenger RNAs coding for receptors and channels in the cerebral cortex of adult and aged rats 黄福南，陈丰，李文彬,等.淀粉样β蛋白对表达的鼠脑乙酰胆碱受体功能的影响[J].中华精神科杂志，2000，33(2)：39-41.
[7] Huang Funan, Li WB, Zhang BL, et al. Effects of amyloid β protein1-40 on the currents of expressed lymphocyte receptors in Xenopus oocytes [J]. Chin J Toxicol Pharmacol, 2000,1:1-4.
[8] Oosawa Y, Yamagishi S. Rat brain glutamate receptors activate chloride channels in Xenopus oocytes coupled by inositol trisphosphate and Ca2+ [J]. J Physiology, 1989,408:223-232.
收稿日期：2000-01-04； 修回日期：2000-02-28, 百拇医药