高效液相色谱法测定人血浆中盐酸氨溴索的浓度及其药代动力学研究
作者：史爱欣 李可欣 刘 蕾 李 扬 赫广威 孙春华 宋友华
单位：卫生部北京医院临床药理基地，北京市 100730
关键词：
中国药房000217
摘要：目的：建立测定盐酸氨溴索血药浓度的方法及进行人体药代动力学的研究。方法：采用反相高效液相色谱法，色谱柱：PhenomenexC18色谱柱(5μm，250mm×4.6mm)，柱温：室温，以乙腈-甲醇-0.01mol/L磷酸盐缓冲液(pH=7.0)-四氢呋喃(35∶35∶27.5∶2.5v/v)为流动相，以西替利嗪为内标，流速1.5ml/min，紫外检测波长242nm，用盐酸氨溴索与内标的峰面积比进行定量。线性范围640～10μg/L，最低检测浓度为5μg/L。对12名健康受试者单次口服90mg盐酸氨溴索片剂后的药代动力学进行研究。结果：12名健康受试者的血药浓度数据经3p97拟合，符合血管外给药一室模型，AUC0～t 为(2 240.67±798.48)μg/(h.L)，Cmax为 (253.17±65.11)μg/L，Tpeak为(2.22±0.68)h，T1/2ke为(4.18±1.27)h。结论：方法简便，灵敏度和准确度较高，完全能满足人体内低浓度药物的测定及药代动力学研究的要求。
, http://www.100md.com
关键词：盐酸氨溴索；高效液相色谱法；药代动力学
中图分类号：R97 文献标识码：B 文章编号：1001-0408(2000)02-0075-02
Determination of Ambroxol Hydrochloride in Human Plasma by HPLC and the Pharmacokinetic Study
SHI Aixin， LI Kexin，LIU Lei，LI Yang，HE Guangvei，SUN Chunhua，SONG Youhua(Clinical Pharmaco_logy Base of Beijing Hospital， Beijing 100730)
ABSTRCT：OBJECTIVE：To develop a method for the determination of ambroxol hydrochloride in human plasma ard study the clinical pharmacokinetics.METHODS：Chromatographic separation has been achieved on C18 column with acetonitrile-methyl alcohol-0.01mol/L phosphatic buffer(pH=7.0)-tetrahydrofuran(35∶35∶27.5∶2.5v/v)as the mobile phase.Detection was at UV 242nm The standard curve of ambroxol hydrochloride was linear in the range of 640～10μg/L，The minimum detection concentration was 5μg/L.This assay procedure has been applied to monitoring plasma levels of ambroxol hydrochloride in 12 healthy volunteers who received po administration of drug. RESULTS：The drug concentration-time profile conformed to the one-compartment model.The AUC0～t and Cmax were(2 240.67±798.48)μg/(h.L)，and(253.17±65.11)μg/L，respectively. Tpeak and T1/2ke were(2.22±0.68)h and (4.18±1.27)h， respectively.CONCLUSION：The study will provide a simple method for the determination of the plasma levels of ambroxol hydrochloride.
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KEY WORDS：ambroxol hydrochloride；HPLC；pharmacokinetics
盐酸氨溴索(Ambroxol Hydrochloride)是目前临床作用较强的祛痰药。其作用机理为裂解痰中酸性粘多糖纤维，减少粘痰，稀释痰液，并提高支气管粘膜上皮纤毛运动频率及运送能力，使痰易于咳出。在临床上用于伴有咳痰及过多粘液分泌物的各种急、慢性呼吸道疾病、成人呼吸道综合征、新生儿呼吸急迫综合征、有呼吸系统疾病史患者术前用药预防及术间肺部开放症，或手术后咳痰困难等[1]。
本文参考国外文献，建立了该药体内血浓度测定方法，并用本法测定了12名健康受试者口服盐酸氨溴索胶囊后的血药浓度，进行了药代动力学的研究。
1 材料与方法
1.1 试药及试剂
, http://www.100md.com
盐酸氨溴索片(沐舒坦
)，30mg/片，德国勃林格殷格翰大药厂生产的市售产品，含量：101.2%，批号：807659；盐酸氨溴索标准品，由山西省医药研究所与天津蓝恒医药化工技术研究所提供，含量：99.5%；西替利嗪标准品，由广州光华制药有限公司提供，含量99.4%。
试剂：乙腈、甲醇、叔丁基甲醚为色谱纯，水为重蒸馏水，磷酸二氢钾、磷酸二氢钠、四氢呋喃、枸橼酸、盐酸为分析纯 。
1.2 仪器
岛津LC-10A高效液相色谱系统，岛津SPD-6AV紫外检测器，岛津C-R6A积分仪，3p97计算程序由中国药理学会数学专业委员会编制。
2 实验方法
2.1 色谱条件
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采用Phenomenex
C18色谱柱(5μm，250mm×4.6mm)，柱温：室温，流动相：乙腈-甲醇-0.01mol/L磷酸盐缓冲液(pH=7.0)-四氢呋喃(35∶35∶27.5∶2.5v/v)，流速1.5ml/min，紫外检测波长242nm，纸速为2cm/min，进样量50μl。
2.2 血样的预处理
取血浆样品1ml置5ml离心管中，加入西替利嗪内标贮备液15μl混匀，加入2.1%枸橼酸水溶液(pH=5.5)1ml，旋涡振荡30s，分两次加入叔丁基甲醚共4ml(每次2ml)，振荡40s。离心(2 000r/min，5min)，吸取有机层至另一试管中，合并两次提取液，加入200μl0.01mol/L盐酸，振荡40s，离心(2 000r/min，5min)，弃去醚层，吸取稀盐酸层50μl进样。
, 百拇医药
2.3 色谱图
在选定的色谱条件下测得的色谱图见图1。
(1)空白血浆图(2)空白血浆中加入样品(3)空白血浆加入内标
(4)健康受试者血浆中加入内标(3.4min为内标，6.887min为盐酸氨溴索)
图1 盐酸氨溴索原始高效液相色谱图
由图1可见，血浆中内标物西替利嗪和盐酸氨溴索的保留时间分别为3.4min和6.887min，两者峰形良好，分离完全，无杂质峰干扰。
3 标准曲线
3.1 标准溶液的配制
, 百拇医药
精密称量盐酸氨溴索标准品25mg，置50ml容量瓶中用流动相溶解并加至刻度成500mg/L，取1ml于100ml容量瓶中用流动相稀释至刻度，使成5mg/L溶液待用。称量西替利嗪适量置100ml容量瓶中用甲醇溶解，并加至刻度成400mg/L的内标贮备液。
3.2 标准曲线的制备
取空白血浆加入盐酸氨溴索标准贮备液(5mg/L)适量使成640μg/L，依次稀释成320、160、80、40、20、10μg/L系列浓度，按上述方法处理后进样测定，记录色谱图、样品峰面积(As)与内标峰面积(Ai)之比。将标准曲线测定项下测得的Ai和As，以R=As/Ai计算不同浓度的R值，以R对浓度C进行直线回归，得标准曲线回归方程：
R=0.0 036 598+0.0 007 698C，γ=0.9 998(n=7)。
线性范围：640～10μg/L，本试验最低检测浓度为5μg/L(S/N≥3)。
, 百拇医药
3.3 回收率与精密度实验
3.3.1 萃取回收率的测定：空白血浆加入盐酸氨溴索标准液使成320、160、40μg/L浓度的样品，按血样处理方法处理后进样，另用流动相配制相应浓度盐酸氨溴索溶液，不经萃取直接进相同量的样，以此为标准，将两组峰面积进行比较计算盐酸氨溴索的萃取回收率。高、中、低3个浓度的萃取回收率分别为(75.31±3.66)%、(75.42±3.63)%、(74.23±3.43)%。
3.3.2 方法回收率及精密度的测定：空白血浆中加入盐酸氨溴索标准液制成320、160、40μg/L3个浓度的样品，按血样处理方法处理后进样，各浓度日内重复测定5次，并连续测定5d，计算方法回收率及日内、日间的精密度。高、中、低3个浓度的方法回收率分别为(99.70±6.47)%、(99.07±5.79)%、(100.82±6.76)%，日内精密度均小于6.71%，日间精密度均小于12.14%。
, http://www.100md.com
4 人体药代动力学研究
4.1 实验方法
12名健康受试者均为男性，年龄20a～23a，平均(21.17±1.11)a；身高162cm～186cm，平均(172.67±6.61)cm；体重53kg～80kg，平均(65.50±918)kg。受试者在试验前进行体格检查，血、尿常规，肝肾功能，心率、呼吸、血压均正常。受试者试验前2wk及试验期间未服用过其它任何药物。试验前均签署知情同意书。12名受试者禁食12h后，清晨空腹用温开水100ml吞服90mg盐酸氨溴索片剂。受试者在服药抽血期间禁烟、酒，采血后2h给予低脂肪饮食。自给药后0.5、1、1.5、2、2.5、3、4、6、8、12、24h，取上肢静脉血3ml，将血标本置于肝素化的试管中，离心(3 000r/min，5min)，分离出血浆，—40℃避光保存至测定。
4.2 数据处理
, 百拇医药
用中国药理学会数学专业委员会最新编制3p97(生物利用度计算程序)处理血样数据，参考实测值与理论值的相关性、曲线拟合优度、AIC等指标，选择出最优房室模型和权重，求算各药动学参数。
4.3 血样测定结果
12名健康受试者的血药浓度数据见表1，药-时曲线见图2。
表1 12名健康受试者口服90mg盐酸氨溴索片剂后的平均血药浓度(μg/L) 时间
0.5
1
1.5
2
2.5
, http://www.100md.com 3
4
6
8
12
24
83.57
288.19
335.36
325.02
276.79
226.61
, 百拇医药
180.22
139.13
118.11
68.69
34.84
s
40.49
94.19
95.08
102.84
101.94
76.82
70.85
, 百拇医药
49.51
53.20
31.18
17.22
图2 12名健康受试者口服90mg盐酸氨溴索片剂后的平均药一时曲线
4.4 药代动力学研究
将血药浓度时间数据用3p97药动学程序处理拟合，参考实测值与理论值的相关性、曲线拟合优度、AIC等指标，认为该药体内过程符合血管外给药一室模型。健康受试者口服90mg盐酸氨溴索片剂后的药代动力学参数见表2 。
表2 12名健康受试者口服90mg盐酸氨溴索片剂后的平均药代动力学参数 编号
, http://www.100md.com
Ka
1/h
Ke
1/h
T1/2ke
h
T1/2ka
h
V/Fc
L
CL/Fs
L/h
Cmax
, http://www.100md.com
μg/L
Tpeak
h
AUC
μg/(h.L)
1.1020
0.1810
4.18
0.80
261.2
45.0
, 百拇医药
253.17
2.22
2240.67
s
0.5667
0.0575
1.27
0.39
102.7
15.5
65.11
0.68
798.48
, 百拇医药
5 讨论
用高效液相色谱法测定血浆中盐酸氨溴索的浓度及药代动力学的研究，国内、外报道均不多[2，3]。本试验采用高效液相色谱-紫外检测法测定血浆中盐酸氨溴索的浓度，直接用叔丁基甲醚进行提取，方法较为简单，萃取回收率高，杂质干扰少，灵敏度高。其药代动力学参数与国内、外文献报道较为一致[2，3]。
在试验过程中，健康受试者均未出现不良反应。
参考文献：
[1] 维德临床用药年鉴[M].中信出版社，1999：223～224.
[2] Milan Nobilis， Jiri Pastera， Dalibor Svoboda， et al.Hi_gh-performance liquid chromatographic determination of ambroxolin human plasma[J]. Journal of Chromatog_raphy，1992(581):251.
[3] 李 珍，沈意翔，范国荣，等.盐酸氨溴索胶囊和片剂的药物动力学和生物利用度比较[J].中国药房，1999，10(4)：168
(收稿日期：1999-07-29 修回日期：1999-09-13), http://www.100md.com
单位：卫生部北京医院临床药理基地，北京市 100730
关键词：
中国药房000217
摘要：目的：建立测定盐酸氨溴索血药浓度的方法及进行人体药代动力学的研究。方法：采用反相高效液相色谱法，色谱柱：PhenomenexC18色谱柱(5μm，250mm×4.6mm)，柱温：室温，以乙腈-甲醇-0.01mol/L磷酸盐缓冲液(pH=7.0)-四氢呋喃(35∶35∶27.5∶2.5v/v)为流动相，以西替利嗪为内标，流速1.5ml/min，紫外检测波长242nm，用盐酸氨溴索与内标的峰面积比进行定量。线性范围640～10μg/L，最低检测浓度为5μg/L。对12名健康受试者单次口服90mg盐酸氨溴索片剂后的药代动力学进行研究。结果：12名健康受试者的血药浓度数据经3p97拟合，符合血管外给药一室模型，AUC0～t 为(2 240.67±798.48)μg/(h.L)，Cmax为 (253.17±65.11)μg/L，Tpeak为(2.22±0.68)h，T1/2ke为(4.18±1.27)h。结论：方法简便，灵敏度和准确度较高，完全能满足人体内低浓度药物的测定及药代动力学研究的要求。
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关键词：盐酸氨溴索；高效液相色谱法；药代动力学
中图分类号：R97 文献标识码：B 文章编号：1001-0408(2000)02-0075-02
Determination of Ambroxol Hydrochloride in Human Plasma by HPLC and the Pharmacokinetic Study
SHI Aixin， LI Kexin，LIU Lei，LI Yang，HE Guangvei，SUN Chunhua，SONG Youhua(Clinical Pharmaco_logy Base of Beijing Hospital， Beijing 100730)
ABSTRCT：OBJECTIVE：To develop a method for the determination of ambroxol hydrochloride in human plasma ard study the clinical pharmacokinetics.METHODS：Chromatographic separation has been achieved on C18 column with acetonitrile-methyl alcohol-0.01mol/L phosphatic buffer(pH=7.0)-tetrahydrofuran(35∶35∶27.5∶2.5v/v)as the mobile phase.Detection was at UV 242nm The standard curve of ambroxol hydrochloride was linear in the range of 640～10μg/L，The minimum detection concentration was 5μg/L.This assay procedure has been applied to monitoring plasma levels of ambroxol hydrochloride in 12 healthy volunteers who received po administration of drug. RESULTS：The drug concentration-time profile conformed to the one-compartment model.The AUC0～t and Cmax were(2 240.67±798.48)μg/(h.L)，and(253.17±65.11)μg/L，respectively. Tpeak and T1/2ke were(2.22±0.68)h and (4.18±1.27)h， respectively.CONCLUSION：The study will provide a simple method for the determination of the plasma levels of ambroxol hydrochloride.
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KEY WORDS：ambroxol hydrochloride；HPLC；pharmacokinetics
盐酸氨溴索(Ambroxol Hydrochloride)是目前临床作用较强的祛痰药。其作用机理为裂解痰中酸性粘多糖纤维，减少粘痰，稀释痰液，并提高支气管粘膜上皮纤毛运动频率及运送能力，使痰易于咳出。在临床上用于伴有咳痰及过多粘液分泌物的各种急、慢性呼吸道疾病、成人呼吸道综合征、新生儿呼吸急迫综合征、有呼吸系统疾病史患者术前用药预防及术间肺部开放症，或手术后咳痰困难等[1]。
本文参考国外文献，建立了该药体内血浓度测定方法，并用本法测定了12名健康受试者口服盐酸氨溴索胶囊后的血药浓度，进行了药代动力学的研究。
1 材料与方法
1.1 试药及试剂
, http://www.100md.com
盐酸氨溴索片(沐舒坦
)，30mg/片，德国勃林格殷格翰大药厂生产的市售产品，含量：101.2%，批号：807659；盐酸氨溴索标准品，由山西省医药研究所与天津蓝恒医药化工技术研究所提供，含量：99.5%；西替利嗪标准品，由广州光华制药有限公司提供，含量99.4%。试剂：乙腈、甲醇、叔丁基甲醚为色谱纯，水为重蒸馏水，磷酸二氢钾、磷酸二氢钠、四氢呋喃、枸橼酸、盐酸为分析纯 。
1.2 仪器
岛津LC-10A高效液相色谱系统，岛津SPD-6AV紫外检测器，岛津C-R6A积分仪，3p97计算程序由中国药理学会数学专业委员会编制。
2 实验方法
2.1 色谱条件
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采用Phenomenex
C18色谱柱(5μm，250mm×4.6mm)，柱温：室温，流动相：乙腈-甲醇-0.01mol/L磷酸盐缓冲液(pH=7.0)-四氢呋喃(35∶35∶27.5∶2.5v/v)，流速1.5ml/min，紫外检测波长242nm，纸速为2cm/min，进样量50μl。2.2 血样的预处理
取血浆样品1ml置5ml离心管中，加入西替利嗪内标贮备液15μl混匀，加入2.1%枸橼酸水溶液(pH=5.5)1ml，旋涡振荡30s，分两次加入叔丁基甲醚共4ml(每次2ml)，振荡40s。离心(2 000r/min，5min)，吸取有机层至另一试管中，合并两次提取液，加入200μl0.01mol/L盐酸，振荡40s，离心(2 000r/min，5min)，弃去醚层，吸取稀盐酸层50μl进样。
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2.3 色谱图
在选定的色谱条件下测得的色谱图见图1。
(1)空白血浆图(2)空白血浆中加入样品(3)空白血浆加入内标
(4)健康受试者血浆中加入内标(3.4min为内标，6.887min为盐酸氨溴索)
图1 盐酸氨溴索原始高效液相色谱图
由图1可见，血浆中内标物西替利嗪和盐酸氨溴索的保留时间分别为3.4min和6.887min，两者峰形良好，分离完全，无杂质峰干扰。
3 标准曲线
3.1 标准溶液的配制
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精密称量盐酸氨溴索标准品25mg，置50ml容量瓶中用流动相溶解并加至刻度成500mg/L，取1ml于100ml容量瓶中用流动相稀释至刻度，使成5mg/L溶液待用。称量西替利嗪适量置100ml容量瓶中用甲醇溶解，并加至刻度成400mg/L的内标贮备液。
3.2 标准曲线的制备
取空白血浆加入盐酸氨溴索标准贮备液(5mg/L)适量使成640μg/L，依次稀释成320、160、80、40、20、10μg/L系列浓度，按上述方法处理后进样测定，记录色谱图、样品峰面积(As)与内标峰面积(Ai)之比。将标准曲线测定项下测得的Ai和As，以R=As/Ai计算不同浓度的R值，以R对浓度C进行直线回归，得标准曲线回归方程：
R=0.0 036 598+0.0 007 698C，γ=0.9 998(n=7)。
线性范围：640～10μg/L，本试验最低检测浓度为5μg/L(S/N≥3)。
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3.3 回收率与精密度实验
3.3.1 萃取回收率的测定：空白血浆加入盐酸氨溴索标准液使成320、160、40μg/L浓度的样品，按血样处理方法处理后进样，另用流动相配制相应浓度盐酸氨溴索溶液，不经萃取直接进相同量的样，以此为标准，将两组峰面积进行比较计算盐酸氨溴索的萃取回收率。高、中、低3个浓度的萃取回收率分别为(75.31±3.66)%、(75.42±3.63)%、(74.23±3.43)%。
3.3.2 方法回收率及精密度的测定：空白血浆中加入盐酸氨溴索标准液制成320、160、40μg/L3个浓度的样品，按血样处理方法处理后进样，各浓度日内重复测定5次，并连续测定5d，计算方法回收率及日内、日间的精密度。高、中、低3个浓度的方法回收率分别为(99.70±6.47)%、(99.07±5.79)%、(100.82±6.76)%，日内精密度均小于6.71%，日间精密度均小于12.14%。
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4 人体药代动力学研究
4.1 实验方法
12名健康受试者均为男性，年龄20a～23a，平均(21.17±1.11)a；身高162cm～186cm，平均(172.67±6.61)cm；体重53kg～80kg，平均(65.50±918)kg。受试者在试验前进行体格检查，血、尿常规，肝肾功能，心率、呼吸、血压均正常。受试者试验前2wk及试验期间未服用过其它任何药物。试验前均签署知情同意书。12名受试者禁食12h后，清晨空腹用温开水100ml吞服90mg盐酸氨溴索片剂。受试者在服药抽血期间禁烟、酒，采血后2h给予低脂肪饮食。自给药后0.5、1、1.5、2、2.5、3、4、6、8、12、24h，取上肢静脉血3ml，将血标本置于肝素化的试管中，离心(3 000r/min，5min)，分离出血浆，—40℃避光保存至测定。
4.2 数据处理
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用中国药理学会数学专业委员会最新编制3p97(生物利用度计算程序)处理血样数据，参考实测值与理论值的相关性、曲线拟合优度、AIC等指标，选择出最优房室模型和权重，求算各药动学参数。
4.3 血样测定结果
12名健康受试者的血药浓度数据见表1，药-时曲线见图2。
表1 12名健康受试者口服90mg盐酸氨溴索片剂后的平均血药浓度(μg/L) 时间
0.5
1
1.5
2
2.5
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4
6
8
12
24
83.57
288.19
335.36
325.02
276.79
226.61
, 百拇医药
180.22
139.13
118.11
68.69
34.84
s
40.49
94.19
95.08
102.84
101.94
76.82
70.85
, 百拇医药
49.51
53.20
31.18
17.22
图2 12名健康受试者口服90mg盐酸氨溴索片剂后的平均药一时曲线
4.4 药代动力学研究
将血药浓度时间数据用3p97药动学程序处理拟合，参考实测值与理论值的相关性、曲线拟合优度、AIC等指标，认为该药体内过程符合血管外给药一室模型。健康受试者口服90mg盐酸氨溴索片剂后的药代动力学参数见表2 。
表2 12名健康受试者口服90mg盐酸氨溴索片剂后的平均药代动力学参数 编号
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Ka
1/h
Ke
1/h
T1/2ke
h
T1/2ka
h
V/Fc
L
CL/Fs
L/h
Cmax
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μg/L
Tpeak
h
AUC
μg/(h.L)
1.1020
0.1810
4.18
0.80
261.2
45.0
, 百拇医药
253.17
2.22
2240.67
s
0.5667
0.0575
1.27
0.39
102.7
15.5
65.11
0.68
798.48
, 百拇医药
5 讨论
用高效液相色谱法测定血浆中盐酸氨溴索的浓度及药代动力学的研究，国内、外报道均不多[2，3]。本试验采用高效液相色谱-紫外检测法测定血浆中盐酸氨溴索的浓度，直接用叔丁基甲醚进行提取，方法较为简单，萃取回收率高，杂质干扰少，灵敏度高。其药代动力学参数与国内、外文献报道较为一致[2，3]。
在试验过程中，健康受试者均未出现不良反应。
参考文献：
[1] 维德临床用药年鉴[M].中信出版社，1999：223～224.
[2] Milan Nobilis， Jiri Pastera， Dalibor Svoboda， et al.Hi_gh-performance liquid chromatographic determination of ambroxolin human plasma[J]. Journal of Chromatog_raphy，1992(581):251.
[3] 李 珍，沈意翔，范国荣，等.盐酸氨溴索胶囊和片剂的药物动力学和生物利用度比较[J].中国药房，1999，10(4)：168
(收稿日期：1999-07-29 修回日期：1999-09-13), http://www.100md.com