甲型血友病携带者的PCR-RFLP检测
作者：王修海 王培林 杜嗣廉 苏爱 王兰 徐健
单位：王修海 王培林 杜嗣廉 苏爱 青岛医学院生物学教研室(青岛 266021)；王兰 徐健 青岛市市北区医院耳鼻喉科
关键词：血友病；杂合子检测；聚合酶链反应；限制性片段长度多态性
青岛医学院学报990304 【摘要】 ①目的 探讨甲型血友病携带者的基因诊断方法。②方法 应用聚合酶链反应(PCR)结合限制性酶切片段长度多态(RFLP)分析技术,对5个甲型血友病家系的29名成员进行了FⅧ基因外显子18和内含子22两个多态位点的扩增片段限制酶切长度多态性连锁分析。并对其中的1个家系进行了产前基因诊断。③结果 5个家系中有5名女性被确定为携带者，1个家系的男性胎儿被确定为病人。④结论 PCR-RFLP方法可对多数甲型血友病进行基因诊断。
中国图书馆分类法分类号 R554.1
, 百拇医药
DETECTION OF HEMOPHILIA A CARRIER WITH PCR-PFLP
Wang Xiuhai, Wang Peilin, Du Silian, et al
Department of Biology,Qingdao Medical College,Qingdao 266021
【ABSTRACT】 Objective To study the gene diagnosis method of hemophillia A. Methods Amplified fragment restriction length polymorphism linkage analysis of exon 18 and intron 22 of FⅧ gene from 29 peoples of 5 families with hemophilia A were made by polymerase chain reaction(PCR) combined with restriction fragment length polymorphism(RFLP). One prenatal gene diagnosis was performed. Results 5 female carriers and one male fetus patient in all families were identified. Conclusion PCR-RFLP could be used in the gene diagnosis of hemophilia A patients.
, 百拇医药
【KEY WORDS】 hemophilia A; heterozygote detection; polymerase chain reaction; restriction fragment length polymorphism
甲型血友病是由于凝血因子Ⅷ(FⅧ)基因缺陷所致的出血性疾病，其遗传方式为X连锁隐性遗传。发病者几乎均为男性，女性为携带者。临床上通过测定血液中FⅧ活性水平来诊断甲型血友病，但不能对携带者和出生前胎儿进行明确诊断。我们应用聚合酶链反应(PCR)技术，分别扩增含有BcLI和XbaI内切酶多态位点的FⅧ基因片段，结合家系各成员的限制片段长度多态(RFLP)分析技术对可疑携带者和胎儿作出基因诊断。
1 材料和方法
1.1 研究对象
甲型血友病家系5个29名成员，包括发病者5名，其他成员24名。病人均具有典型的临床症状，经临床检查确诊。其中1个家系对胎儿进行了产前基因诊断。
, 百拇医药
1.2 DNA提取
家系各成员均取外周血5mL，孕妇通过羊膜穿刺吸取羊水20mL，按常规方法进行蛋白酶消化4h，用饱和盐析法提取细胞基因组DNA〔1〕.
1.3 基因扩增
基因扩增引物及其他试剂均由中国医学科学院基础所生化研究室提供。采用SRY基因诊断引物扩增羊水细胞DNA进行胎儿性别鉴定。FⅧ基因特异片段扩增体系、温度、时间的设置参照文献〔2，3〕。循环温度和时间为95℃变性7min后加Taq酶2U,BSA 1μL，石膜油35μL封顶，然后94℃变性1min, 55℃退火1min, 70℃延伸1.5min，在480型热循环仪上(美国PE公司产品)进行35个循环，最后70℃延伸5min.
1.4 限制酶水解与电泳
扩增产物经乙醇沉淀法纯化，提取10μL分别加入含有XbaI酶1μL(10U)和BcLI酶1μL(10U),10×buffer 2μL，H2O 6μL的两个反应管中，分别在37℃和55℃下酶解1.5h，然后用浓度为120g/L的非变性丙烯酰胺凝胶进行电泳，1×TBE,电压200V,电泳2h，凝胶采用银染法进行染色〔3〕，照相并观察检测结果。
, 百拇医药
2 结果
经PCR扩增，两个FⅧ基因特异片段的长度分别为142bp和96bp.若该扩增片段内有BcLI和XbaI限制酶切位点，经酶解后可分别形成142/99和96/68两个片段，观察酶切等位片段的有无即可判断出酶切位点的有无，继而进行家系连锁分析，判断女性携带者和男性病人。
5个家系病人的母亲分别进行两个位点多态分析，其中2个家系由于病人母亲为某片段的纯合子，不能通过家系分析诊断携带者；另3个家系病人母亲为某片段的杂合子，用家系分析方法对7名待测携带者进行分析，结果5名被确定为携带者(杂合子)，其中的一个家系女性携带者的胎儿被确定为男性病人。见表1.
表1 3个甲型血友病家系的RFLP分析结果 家系
成员
酶切片段类型
, http://www.100md.com
基因诊断
BcLI(bp)
XbaI(bp)
1
母亲
142/99
96/68
携带者
父亲
-/99
96/-
女儿
142/99
, http://www.100md.com
96/68
携带者
女婿
142/-
-/68
儿子
142/-
96/-
病人
2
母亲
142/99
96/68
, http://www.100md.com
携带者
父亲
142/-
96/-
儿子
142/-
96/-
先证者
女儿
142/99
96/68
携带者
3
, 百拇医药
母亲
142/99
96/68
携带者
父亲
-/99
96/-
儿子
142/-
96/-
先证者
胎儿
142/-
, 百拇医药
96/-
病人
3 讨论
FⅧ基因位于X染色体长臂2区8带，全长186kbp，由26个外显子和25个内含子组成。由于FⅧ基因结构的病理改变较复杂，存在显著的遗传异质性，因此,直接检测基因突变是困难的。目前,国内外多采用FⅧ基因内或旁侧与其紧密连锁的限制性内切酶酶切位点作为遗传标志，对有缺陷基因进行连锁分析。沈岩等〔4〕对中国人FⅧ基因内及其旁侧的5组RFLP的组成、频率和多态信息量进行分析研究，认为首先联合使用XbaI/FⅧ-i22与BcLI/FⅧ-e18这两组RFLP对携带者进行基因分析是较理想的选择。这两组RFLP联合使用时多态信息量达0.83，实际诊断率达70%.经典的RFLP是采用DNA印迹杂交技术，此法所需DNA量大，操作时间长、技术要求高，而且需接触放射性核素标记的探针，这在一定程度上限制了该技术的应用。PCR技术的应用，大大简化了RFLP作出基因诊断的过程。克服了经典RFLP的缺点，其分析结果也是准确可靠的。
, http://www.100md.com
应用RFLP进行连锁分析时，只要先证者母亲为该多态位点杂合子，基因诊断率很高；若先证者母亲为多态位点纯合子,则无法进行RFLP连锁分析。因此，利用RFLP进行甲型血友病基因诊断时，首先应该确定母亲为杂合子的基因型，然后再进行其子女的携带者身份的确定。这一点对产前诊断也很重要。我们采用BcLI和XbaI两个多态位点只能对5个家系中的3个进行分析，另外2个家系则因先证者母亲是两位点的纯合子，无法用RFLP进行基因诊断。
对于甲型血友病的产前诊断病人，肯定为携带者的女性最好在妊娠前做出RFLP基因型分析，减少产前诊断的盲目性，使产前诊断准确、快速进行。
参考文献
1 Miller SA,Dyker DD,Polesky HF,et al. A simple saltingout precedure for extracting DNA from human nucleated cells.Nucl Acids Res,1988,16(3):1215
, http://www.100md.com
2 Kogan SC,Doherty M,Gitscher J,et al.An improved method for prenatal diagnosis of genetic disease by analysis of amplified DNA sequence:application to hemophilia A.N Engl J Med,1987,317:985
3 Brandt B,Greger V,Yandell D,et al.A simple and nonradioactive method for detecting the Rb 1.20 DNA polymorphism in the retinoblastoma gene.Am J Hum Genet,1992,51:1450
4 沈岩，吴冠芸，龙桂芳,等.甲型血友病基因诊断的研究.中华医学杂志，1989,69(8):422
(1998-12-15收稿 1999-07-19修回), 百拇医药
单位：王修海 王培林 杜嗣廉 苏爱 青岛医学院生物学教研室(青岛 266021)；王兰 徐健 青岛市市北区医院耳鼻喉科
关键词：血友病；杂合子检测；聚合酶链反应；限制性片段长度多态性
青岛医学院学报990304 【摘要】 ①目的 探讨甲型血友病携带者的基因诊断方法。②方法 应用聚合酶链反应(PCR)结合限制性酶切片段长度多态(RFLP)分析技术,对5个甲型血友病家系的29名成员进行了FⅧ基因外显子18和内含子22两个多态位点的扩增片段限制酶切长度多态性连锁分析。并对其中的1个家系进行了产前基因诊断。③结果 5个家系中有5名女性被确定为携带者，1个家系的男性胎儿被确定为病人。④结论 PCR-RFLP方法可对多数甲型血友病进行基因诊断。
中国图书馆分类法分类号 R554.1
, 百拇医药
DETECTION OF HEMOPHILIA A CARRIER WITH PCR-PFLP
Wang Xiuhai, Wang Peilin, Du Silian, et al
Department of Biology,Qingdao Medical College,Qingdao 266021
【ABSTRACT】 Objective To study the gene diagnosis method of hemophillia A. Methods Amplified fragment restriction length polymorphism linkage analysis of exon 18 and intron 22 of FⅧ gene from 29 peoples of 5 families with hemophilia A were made by polymerase chain reaction(PCR) combined with restriction fragment length polymorphism(RFLP). One prenatal gene diagnosis was performed. Results 5 female carriers and one male fetus patient in all families were identified. Conclusion PCR-RFLP could be used in the gene diagnosis of hemophilia A patients.
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【KEY WORDS】 hemophilia A; heterozygote detection; polymerase chain reaction; restriction fragment length polymorphism
甲型血友病是由于凝血因子Ⅷ(FⅧ)基因缺陷所致的出血性疾病，其遗传方式为X连锁隐性遗传。发病者几乎均为男性，女性为携带者。临床上通过测定血液中FⅧ活性水平来诊断甲型血友病，但不能对携带者和出生前胎儿进行明确诊断。我们应用聚合酶链反应(PCR)技术，分别扩增含有BcLI和XbaI内切酶多态位点的FⅧ基因片段，结合家系各成员的限制片段长度多态(RFLP)分析技术对可疑携带者和胎儿作出基因诊断。
1 材料和方法
1.1 研究对象
甲型血友病家系5个29名成员，包括发病者5名，其他成员24名。病人均具有典型的临床症状，经临床检查确诊。其中1个家系对胎儿进行了产前基因诊断。
, 百拇医药
1.2 DNA提取
家系各成员均取外周血5mL，孕妇通过羊膜穿刺吸取羊水20mL，按常规方法进行蛋白酶消化4h，用饱和盐析法提取细胞基因组DNA〔1〕.
1.3 基因扩增
基因扩增引物及其他试剂均由中国医学科学院基础所生化研究室提供。采用SRY基因诊断引物扩增羊水细胞DNA进行胎儿性别鉴定。FⅧ基因特异片段扩增体系、温度、时间的设置参照文献〔2，3〕。循环温度和时间为95℃变性7min后加Taq酶2U,BSA 1μL，石膜油35μL封顶，然后94℃变性1min, 55℃退火1min, 70℃延伸1.5min，在480型热循环仪上(美国PE公司产品)进行35个循环，最后70℃延伸5min.
1.4 限制酶水解与电泳
扩增产物经乙醇沉淀法纯化，提取10μL分别加入含有XbaI酶1μL(10U)和BcLI酶1μL(10U),10×buffer 2μL，H2O 6μL的两个反应管中，分别在37℃和55℃下酶解1.5h，然后用浓度为120g/L的非变性丙烯酰胺凝胶进行电泳，1×TBE,电压200V,电泳2h，凝胶采用银染法进行染色〔3〕，照相并观察检测结果。
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2 结果
经PCR扩增，两个FⅧ基因特异片段的长度分别为142bp和96bp.若该扩增片段内有BcLI和XbaI限制酶切位点，经酶解后可分别形成142/99和96/68两个片段，观察酶切等位片段的有无即可判断出酶切位点的有无，继而进行家系连锁分析，判断女性携带者和男性病人。
5个家系病人的母亲分别进行两个位点多态分析，其中2个家系由于病人母亲为某片段的纯合子，不能通过家系分析诊断携带者；另3个家系病人母亲为某片段的杂合子，用家系分析方法对7名待测携带者进行分析，结果5名被确定为携带者(杂合子)，其中的一个家系女性携带者的胎儿被确定为男性病人。见表1.
表1 3个甲型血友病家系的RFLP分析结果 家系
成员
酶切片段类型
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基因诊断
BcLI(bp)
XbaI(bp)
1
母亲
142/99
96/68
携带者
父亲
-/99
96/-
女儿
142/99
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96/68
携带者
女婿
142/-
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儿子
142/-
96/-
病人
2
母亲
142/99
96/68
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携带者
父亲
142/-
96/-
儿子
142/-
96/-
先证者
女儿
142/99
96/68
携带者
3
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母亲
142/99
96/68
携带者
父亲
-/99
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儿子
142/-
96/-
先证者
胎儿
142/-
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病人
3 讨论
FⅧ基因位于X染色体长臂2区8带，全长186kbp，由26个外显子和25个内含子组成。由于FⅧ基因结构的病理改变较复杂，存在显著的遗传异质性，因此,直接检测基因突变是困难的。目前,国内外多采用FⅧ基因内或旁侧与其紧密连锁的限制性内切酶酶切位点作为遗传标志，对有缺陷基因进行连锁分析。沈岩等〔4〕对中国人FⅧ基因内及其旁侧的5组RFLP的组成、频率和多态信息量进行分析研究，认为首先联合使用XbaI/FⅧ-i22与BcLI/FⅧ-e18这两组RFLP对携带者进行基因分析是较理想的选择。这两组RFLP联合使用时多态信息量达0.83，实际诊断率达70%.经典的RFLP是采用DNA印迹杂交技术，此法所需DNA量大，操作时间长、技术要求高，而且需接触放射性核素标记的探针，这在一定程度上限制了该技术的应用。PCR技术的应用，大大简化了RFLP作出基因诊断的过程。克服了经典RFLP的缺点，其分析结果也是准确可靠的。
, http://www.100md.com
应用RFLP进行连锁分析时，只要先证者母亲为该多态位点杂合子，基因诊断率很高；若先证者母亲为多态位点纯合子,则无法进行RFLP连锁分析。因此，利用RFLP进行甲型血友病基因诊断时，首先应该确定母亲为杂合子的基因型，然后再进行其子女的携带者身份的确定。这一点对产前诊断也很重要。我们采用BcLI和XbaI两个多态位点只能对5个家系中的3个进行分析，另外2个家系则因先证者母亲是两位点的纯合子，无法用RFLP进行基因诊断。
对于甲型血友病的产前诊断病人，肯定为携带者的女性最好在妊娠前做出RFLP基因型分析，减少产前诊断的盲目性，使产前诊断准确、快速进行。
参考文献
1 Miller SA,Dyker DD,Polesky HF,et al. A simple saltingout precedure for extracting DNA from human nucleated cells.Nucl Acids Res,1988,16(3):1215
, http://www.100md.com
2 Kogan SC,Doherty M,Gitscher J,et al.An improved method for prenatal diagnosis of genetic disease by analysis of amplified DNA sequence:application to hemophilia A.N Engl J Med,1987,317:985
3 Brandt B,Greger V,Yandell D,et al.A simple and nonradioactive method for detecting the Rb 1.20 DNA polymorphism in the retinoblastoma gene.Am J Hum Genet,1992,51:1450
4 沈岩，吴冠芸，龙桂芳,等.甲型血友病基因诊断的研究.中华医学杂志，1989,69(8):422
(1998-12-15收稿 1999-07-19修回), 百拇医药