豚鼠球囊毛细胞的分离及钾离子流的研究
作者：沙建慧 李云义 李云阁 刘焕珠 王清 姚萍
单位：第四军医大学吉林军医学院生理教研室，吉林市 132013
关键词：球囊；毛细胞；K+电流；膜片钳技术
中国应用生理学杂志000323摘要 目的：研究前庭毛细胞的细胞活性及膜上钾通道的类型。方法：用酶 消化后机械法分离豚鼠球囊毛细胞，并用全细胞膜片钳技术观察豚鼠球囊Ⅱ型毛细胞侧膜上 的钾通道电流。结果：①胶原酶Ⅳ浓度为0.35 mg/ml时，分离的毛细胞数量最 多，存活时间最长；②当钳制电位为-100 mV，以10 mV的步距，从-70 mV至+20 mV阶跃，随 着 膜电位的去极化，可记录到一系列快速、瞬时的以A型钾通道为主的外向电流，4-Ap对其有 特异性阻断作用。激活电压为-60～-50 mV；③当钳制电位为-70 mV，以10 mV的步距阶跃去 极化(-50 mV～+40 mV)，可产生一系列延迟整流性钾离子流，TEA能使该电流幅度下降53.3 %±6.0%。结论：分离豚鼠球囊毛细胞酶的最佳浓度为0.35 mg/ml,Ⅱ型毛细 胞膜上有A型钾通道和延迟整流性钾通道。
, http://www.100md.com
中图分类号： Q2；Q437文献标识码：A 文章编号 ：1000-6834(2000)03-0279-04
THE STUDIES OF CELL ISOLATION AND POTASSIUM CURRENTS IN GUINEA-PIG SACCULAR HAIR CELLS
SHA Jian-hui,Li yun-yi, LI Yun-ge, LIU Huan-zhu, WANG Qing
(Department of Physiology,Fourth Military Medical University,College of Medicine at Jilin,Jilin City, 132013)
ABSTRACT
Aim:To study the cell viability in the guinea-pig's saccular hair cells and the type of potassium channels on their membrane.Methods:En zymatic and mechanical dissociation were used to separate guinea-pig's saccular hair cells and whole cell patch-clamp technique was used to observe potassium current on guinea-pig's saccular Ⅱ type hair cells membrane. Results:①When the concentration of collagenase Ⅳ was 0.35 mg/ml,single living hair cells were the most numerous and the longest in survial.②A series of rapid and instant outward currents of which were A-type of potassium channel mainly could be recorded when the holding potential was at -100mV and the depolarized poten tials from -70 mV to +20 mV were in 10 mV increments.They could be blocked by 4 -Ap especially.The activated membrane potential was (-60～-50)mV.③When the hol din g potential was at -70 mV and the depolarized potentials from -50 mV to +40 mV w ere in 10 mV increments,depolariztion could produce a series of delayed rectifie r potassium currents .TEA could decrease it by 53.3±6.0%.Conclusion: The enzymatic concentration of 0.35 mg/ml could achieve the best result in iso lating saccular hair cells of guinea-pig.There are A-type and delaged rectifie r potassium channel on guinea-pig's saccular Ⅱ type hair cells' membrane.
, 百拇医药
KEY WORDS: saccule; hair cells; K+currents; patc h clamp
为了从细胞水平上探讨前庭的生理机能和前庭系统疾病的致病机理，前庭毛细胞的分离技术 及离子通道的研究十分重要。目前，关于毛细胞的分离技术，国内曾有报道[1，2] ， 但选用消化酶的种类及浓度各不相同。近十余年来，相关离子通道研究的迅速发展，深入揭 示了毛细胞进行机械电换能的分子机制[3，4]，即静纤毛的换能通道产生感受器电 位、侧膜离子通道的调节作用及突触释放递质这样三个互相关联的过程。通过膜片钳技术研 究前庭毛细胞离子通道的机能活动，国内仅报道了应用单通道膜片钳技术对牛蛙球囊钾通道 和钙通道的研究[5，6]。记录到钙依赖性钾通道(Kca)，但对豚鼠球囊毛细 胞钾通道的研究尚未见报道，为了获得较多具有活性的单个前庭毛细胞，进一步揭示哺乳动 物前庭毛细胞中钾离子通道的类型，以便为机械电换能机制的研究提供实验依据，我们采用 酶消化辅以机械法分离豚鼠球囊毛细胞，并用全细胞膜片钳技术观察了豚鼠球囊毛细胞的钾 离子通道电流。
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 毛细胞的分离
选用耳廓反射正常的成年花色豚鼠42只，雌雄不拘，体重250～300 g。培养液为Hank＇s液( mmol/L):NaCl 137.0、KCl 5.4、CaCl2 1.3、MgSO4 0.8、Na2HPO4 0.4、KH2HPO 4 0.4、Glucose 5.0,HEPES 5.0，用1 mol/L NaOH调节pH至7.4，然后用4 mol/L NaCl将 渗透压调节为300 mOsm。含酶液由无钙、镁的Hank＇s液加胶原酶Ⅳ(Sigma公司)配制而成， 酶浓度分别为0.2、0.35、0.5 mg/ml。动物断头后取出两侧听泡，剪开前庭骨质，置于H ank＇s液中，在解剖显微镜下取出球囊斑，分别置于不同浓度的酶溶液中，35～37℃下孵育 50～60 min，间断给氧后用微量吸管反复机械吹打，直至组织块离散，将此细胞悬液移至含 有盖玻片的培养皿中，盖玻片预先涂有刀豆球蛋白，静止20～25min,待细胞贴附后，用Hank ＇s液清洗三次，去酶后在倒置显微镜下，观察毛细胞的形态、分类，再 于孵育后2、3、5、7 h分别观察不同酶浓度下毛细胞成活率及变性情况。选择活性良好的Ⅱ 型毛细胞进行离子通道实验。
, 百拇医药
1.2 离子通道电流的记录
记录用的微电极由软质玻璃经玻璃微电极拉制仪(Narishige PB-7,Japan)制成，其尖端内径 约1 μm,电极阻抗3～5 MΩ，电极内液(mmol/L):KCl 140,MnCl2 2,CaCl2 1,EGTA 11,H EPES 10,用 KOH将pH值调至7.4，渗透压调至300 mOsm，电极充灌前液体经0.22 μm的滤器过滤，在微 操纵器(MO-202，Japan)控制下，逐步推进电极至尖端接触细胞侧膜，稍加负压，获得1～5 GΩ以上的封接电阻，给电极内增加负压，电极尖端膜片破裂，形成了全细胞式记录方式。 补偿电容电流及电极串联阻抗，信号经Ag/AgCl电极引导，由膜片钳放大器(ECZ 2300)放大 ，滤波为1 kHz。为了防止细胞外液中钙产生的内向电流的影响，细胞外液中加入79 μmol/ L异搏定(江苏连云港制药厂生产)。
1.3 数据分析
, 百拇医药
实验过程由pClamp6.01(Axon Instrument,INC)控制，通过放大器及A/D、D/A转换控制刺激 的连续发放、信号采集和数据分析，并将信号存贮于486计算机硬盘中进行分析。统计数据 以均数±标准差(
±s)表示。
2 结果
2.1 正常球囊毛细胞的形态特点
豚鼠球囊毛细胞膜光滑，胞浆透明，细胞分为两型：Ⅰ型细胞呈烧瓶状，核位于基底部，细 胞中部有明显的颈，颈顶端有皮板和一束纤毛，颈和纤毛长度各异，细胞底部到皮板的长度 为(19.32±1.57) μm(n=29);Ⅱ型细胞体呈椭圆或圆形，比Ⅰ型细胞小，核位于中央，也 有皮板及纤毛，胞体长度为(14.11±2.69) μm(n=14)，细胞器主要位于皮板处，纤毛 从动毛向静毛侧按长短顺序排列。Ⅰ、Ⅱ型细胞的比例是65∶35(n=8)。
, 百拇医药
2.2 球囊毛细胞的变性表现
失活的毛细胞早期变化是胞内出现颗粒，细胞膜不平，以后是颈部(Ⅰ型)消失或纤毛脱落， 最后是细胞水肿，胞浆外溢。
2.3 不同酶浓度下单个毛细胞数及存活时间
在室温下(22～24℃)培养期间，当酶浓度较低(0.2 mg/ml)或较高(0.5 mg/ml)时，分离的 毛细胞数均较少(分别为15±7个，n=7；19±1个,n=7)，存活时间达7 h的也较少(1 2%；2%)。当酶浓度为0.35 mg/ml时，分离的毛细胞数最多(27±2个，n=8)存活时间也 最长，存活超7 h的达21%。
2.4 A型钾离子流(IA)的分析
实验记录了14个毛细胞，钳制电位在-100 mV，阶跃由电位-70 mV开始至+20 mV，间隔10 mV，脉冲保持时间200 ms。随着膜的去极化，在毛细胞侧膜上可记录到一个电压依赖性复合 外向电流，这个外向电流以快电流为主(图1A)，最大去极化电流的峰值范围为0.9～1.4 nA 。去极化电压越靠近正值，电流激活速度越快。电压激活范围为-50～-60 mV，向细胞 外液 加入4-Ap(四氨基吡啶，Sigma公司，浓度为16 mmol/L[7])，2 min后，复合的外向 电流中快速激活又很快失活的外向电流部分逐渐消失(图1B)，剩余有缓慢激活、持续时间较 长的外向电流。
Fig.1 Complex outward current contained I A and effect of 4-Ap on IA
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(A):Complex outward current contained IA;(B):IA was blocked by 4-Ap
从上述图1A的图形特点及ⅠA特异性阻断剂4-Ap削减了快速激活又很快失活的外向 电流部分，初步推断外向电流中含有ⅠA。
2.5 延迟整流性钾电流(Ⅰk)
当细胞外液加入4-Ap(16 mmol/L)后，钳制电位在-70 mV，阶跃由电位-50 mV至+40 mV，脉 冲保持时间为400 ms，在8个毛细胞侧膜上，可记录到缓慢激活的外向电流，在400 ms内无 失活(图2A)。向细胞外液中灌注TEA(四乙基氯化铵，Sigma公司)，使溶液中TEA浓度为20 mm ol/L,2 min后，外向电流幅度减少了53.3%±6.0%(n=8,P<0.01,图2B)。用正常细 胞外液冲洗5 min后，减少的外向电流大部分恢复(图2C)。根据记录电流的特点表明，外向 电流中除了含有ⅠA外，还含有延迟整流性钾电流，这种钾电流对4-Ap不敏感而对TEA敏感 [7]。
Fig.2 Effect of TEA on the rectifier potassium currents and the I-V relationship
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3 讨论
由于前庭器官小，结构复杂，毛细胞数量又少，在分离毛细胞时，纤毛易受损，毛细胞的成 活率极低，所以， 在前庭毛细胞离子通道的研究过程中，良好的单个离体的毛细胞数量和存 活时间是至关重要的。目前，毛细胞的分离方法主要是酶消化后辅以机械分离法。酶消化主 要用胶原酶，其次有胰蛋白酶、木瓜蛋白酶等。不同年龄的动物，细胞间的结合力不同，细 胞分离时所需的酶浓度也不同，本实验为了避免年龄对细胞间结合力的影响，动物均选用成 年豚鼠。我们在实验中发现，胶原酶浓度过低(低于0.2 mg/ml)时，分离的毛细胞数较少。 细胞膜表面清洁度也差，不易封接和破膜。当酶浓度过高(超过0.5 mg/ml)，消化时间过 长(超过60 min)，酶消化温度过高(超过37℃)时，易损伤膜表面的蛋白质，分离的毛细胞数 量较少，存活率也降低，且分离的毛细胞在封接、破膜时，成功率也较低。相比之下，当酶 浓度为0.35 mg/ml时，分离出毛细胞的数量最多，细胞的成活率最高，封接和破膜的成功 率也最高。
, 百拇医药
近十余年来，随着膜片钳技术的发展，前庭毛细胞功能的研究在细胞和分子水平上有了很大 的突破。迄今已发现毛细胞上存在多种离子通道，以完成机电换能和进行感觉编码的作用 [8]。我们曾用全细胞膜片钳技术记录出牛蛙球囊毛细胞侧膜上存在有A型钾通道(K A)。除KA外，细胞膜上还含有其它类型的钾通道，但性质未定。
本实验用全细胞式膜片钳技术，记录出在豚鼠球囊Ⅱ型毛细胞侧膜上也存在有外向电流，这 些外向电流在钳制电位下，随着膜的去极化而增加，并能被钾通道阻断剂4-Ap、TEA阻断， 推断这些外向电流主要是电压依赖性钾电流。由于实验中细胞外液加入了异搏定，电极内 液中应用了EGTA，则钙依赖性钾通道电流(Ⅰk(ca))较小。ⅠA是一种电压门控性 钾 电流，它的激活电压为-45～60 mV，并在几十至几百ms内快速失活，4-Ap是ⅠA的特异 性 阻断剂。本实验记录的外向K+电流中，一种快K+电流成分的动力学特征符合ⅠA的 特 点，所以，外向电流中含有ⅠA。在毛细胞中ⅠA的作用并不十分清楚，据报道，ⅠA 是豚鼠壶腹嵴中外向电流的一部分[9]。Art等[10]提出，机械活化性Ⅰ A激活，伴随有毛细胞的神经冲动发放，即机械活化性ⅠA可能参与毛细胞的机械电换能过 程及其调节。本实验记录到毛细胞侧膜上含有电压依赖性ⅠA，然而这种ⅠA的活动在机 械电换能机制中的作用还需进一步探讨。本实验进一步观察到，毛细胞膜中还含有起始延迟 、电流稳定没有衰减的钾电流，并且这种电流对4-Ap不敏感，而对TEA敏感，根据以上特点 ，判定此电流为Ⅰk。Ⅰk是动作电位复极化的主要外向电流，与机械电换能后的复极化 有关。本实验所建立的模型将对前庭器官的生理、药理和病理学研究起到重要作用。
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本工作得到白求恩医科大学钟国赣教授和张文杰老师的全力支持和热心指导，特 此致谢。
作者简介：沙建慧(1961-)，女(回族)，吉林省敦化市人，讲师，硕士 研究生，从事前庭功能研究。
参考文献
[1] 莫玲燕，苏鸿禧，刘 铤.豚鼠壶腹嵴毛细胞分离法[J].中华耳鼻咽喉科 杂志，1993，28(3)：131-133.
[2] 苏振伦，姜泗长，顾 瑞，等.豚鼠耳蜗毛细胞分离法[J].中华耳鼻咽喉科杂志 ，1992，27(3)：133-135.
[3] Ashmore J F,Meech R W.Ionic basis of membrane potential in outer hair cells of guinea pig cochlea[J].Nature,1986,322:368-371.
, 百拇医药
[4] Hudspeth A J，Lewis R S.Kinetic analysis of voltage and iondependent cond uctances in saccular hair cells of the bullfrog[J].Rana catesbeiana.J Physio l,1988,400:237-274.
[5] 苏振伦，姜泗长，顾 瑞，等.牛蛙球囊毛细胞的钾离子通道[J].中华耳鼻咽喉 科杂志，1993，28(5)：260-262.
[6]苏振伦，姜泗长，顾 瑞，等.牛蛙球囊毛细胞的钙离子通道[J].中华耳鼻咽喉科杂志，1995，30(2)：70-73.
[7] Russo G,Masetto S,Prigoni I.Isolation of A-type K+ current in hai r cells of the frog crista ampullaris[J].Neuroreport,1995,6(3):425-428.
, 百拇医药
[8] Hudspeth A J.The ionic channels of a vestebrate hair cell[J].Hear Res ,1986,22:21-27.
[9] Rennie K J,Ashmore J F.Ionic currents in isolated vestibular hair cells f rom the guinea-pig crista ampullaris[J].Hear Res，1991,51:279-292.
[10] Art J J,Fettipla R,Fuchs P A.Synaptic hyperpolarization and inhibition o f turtie cochlear hair cell[J].Physiology,1984,356:525-550.
收稿日期：1999-10-14；修回日期：2000-02-12, 百拇医药
单位：第四军医大学吉林军医学院生理教研室，吉林市 132013
关键词：球囊；毛细胞；K+电流；膜片钳技术
中国应用生理学杂志000323摘要 目的：研究前庭毛细胞的细胞活性及膜上钾通道的类型。方法：用酶 消化后机械法分离豚鼠球囊毛细胞，并用全细胞膜片钳技术观察豚鼠球囊Ⅱ型毛细胞侧膜上 的钾通道电流。结果：①胶原酶Ⅳ浓度为0.35 mg/ml时，分离的毛细胞数量最 多，存活时间最长；②当钳制电位为-100 mV，以10 mV的步距，从-70 mV至+20 mV阶跃，随 着 膜电位的去极化，可记录到一系列快速、瞬时的以A型钾通道为主的外向电流，4-Ap对其有 特异性阻断作用。激活电压为-60～-50 mV；③当钳制电位为-70 mV，以10 mV的步距阶跃去 极化(-50 mV～+40 mV)，可产生一系列延迟整流性钾离子流，TEA能使该电流幅度下降53.3 %±6.0%。结论：分离豚鼠球囊毛细胞酶的最佳浓度为0.35 mg/ml,Ⅱ型毛细 胞膜上有A型钾通道和延迟整流性钾通道。
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中图分类号： Q2；Q437文献标识码：A 文章编号 ：1000-6834(2000)03-0279-04
THE STUDIES OF CELL ISOLATION AND POTASSIUM CURRENTS IN GUINEA-PIG SACCULAR HAIR CELLS
SHA Jian-hui,Li yun-yi, LI Yun-ge, LIU Huan-zhu, WANG Qing
(Department of Physiology,Fourth Military Medical University,College of Medicine at Jilin,Jilin City, 132013)
ABSTRACT
Aim:To study the cell viability in the guinea-pig's saccular hair cells and the type of potassium channels on their membrane.Methods:En zymatic and mechanical dissociation were used to separate guinea-pig's saccular hair cells and whole cell patch-clamp technique was used to observe potassium current on guinea-pig's saccular Ⅱ type hair cells membrane. Results:①When the concentration of collagenase Ⅳ was 0.35 mg/ml,single living hair cells were the most numerous and the longest in survial.②A series of rapid and instant outward currents of which were A-type of potassium channel mainly could be recorded when the holding potential was at -100mV and the depolarized poten tials from -70 mV to +20 mV were in 10 mV increments.They could be blocked by 4 -Ap especially.The activated membrane potential was (-60～-50)mV.③When the hol din g potential was at -70 mV and the depolarized potentials from -50 mV to +40 mV w ere in 10 mV increments,depolariztion could produce a series of delayed rectifie r potassium currents .TEA could decrease it by 53.3±6.0%.Conclusion: The enzymatic concentration of 0.35 mg/ml could achieve the best result in iso lating saccular hair cells of guinea-pig.There are A-type and delaged rectifie r potassium channel on guinea-pig's saccular Ⅱ type hair cells' membrane.
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KEY WORDS: saccule; hair cells; K+currents; patc h clamp
为了从细胞水平上探讨前庭的生理机能和前庭系统疾病的致病机理，前庭毛细胞的分离技术 及离子通道的研究十分重要。目前，关于毛细胞的分离技术，国内曾有报道[1，2] ， 但选用消化酶的种类及浓度各不相同。近十余年来，相关离子通道研究的迅速发展，深入揭 示了毛细胞进行机械电换能的分子机制[3，4]，即静纤毛的换能通道产生感受器电 位、侧膜离子通道的调节作用及突触释放递质这样三个互相关联的过程。通过膜片钳技术研 究前庭毛细胞离子通道的机能活动，国内仅报道了应用单通道膜片钳技术对牛蛙球囊钾通道 和钙通道的研究[5，6]。记录到钙依赖性钾通道(Kca)，但对豚鼠球囊毛细 胞钾通道的研究尚未见报道，为了获得较多具有活性的单个前庭毛细胞，进一步揭示哺乳动 物前庭毛细胞中钾离子通道的类型，以便为机械电换能机制的研究提供实验依据，我们采用 酶消化辅以机械法分离豚鼠球囊毛细胞，并用全细胞膜片钳技术观察了豚鼠球囊毛细胞的钾 离子通道电流。
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1 材料和方法
1.1 毛细胞的分离
选用耳廓反射正常的成年花色豚鼠42只，雌雄不拘，体重250～300 g。培养液为Hank＇s液( mmol/L):NaCl 137.0、KCl 5.4、CaCl2 1.3、MgSO4 0.8、Na2HPO4 0.4、KH2HPO 4 0.4、Glucose 5.0,HEPES 5.0，用1 mol/L NaOH调节pH至7.4，然后用4 mol/L NaCl将 渗透压调节为300 mOsm。含酶液由无钙、镁的Hank＇s液加胶原酶Ⅳ(Sigma公司)配制而成， 酶浓度分别为0.2、0.35、0.5 mg/ml。动物断头后取出两侧听泡，剪开前庭骨质，置于H ank＇s液中，在解剖显微镜下取出球囊斑，分别置于不同浓度的酶溶液中，35～37℃下孵育 50～60 min，间断给氧后用微量吸管反复机械吹打，直至组织块离散，将此细胞悬液移至含 有盖玻片的培养皿中，盖玻片预先涂有刀豆球蛋白，静止20～25min,待细胞贴附后，用Hank ＇s液清洗三次，去酶后在倒置显微镜下，观察毛细胞的形态、分类，再 于孵育后2、3、5、7 h分别观察不同酶浓度下毛细胞成活率及变性情况。选择活性良好的Ⅱ 型毛细胞进行离子通道实验。
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1.2 离子通道电流的记录
记录用的微电极由软质玻璃经玻璃微电极拉制仪(Narishige PB-7,Japan)制成，其尖端内径 约1 μm,电极阻抗3～5 MΩ，电极内液(mmol/L):KCl 140,MnCl2 2,CaCl2 1,EGTA 11,H EPES 10,用 KOH将pH值调至7.4，渗透压调至300 mOsm，电极充灌前液体经0.22 μm的滤器过滤，在微 操纵器(MO-202，Japan)控制下，逐步推进电极至尖端接触细胞侧膜，稍加负压，获得1～5 GΩ以上的封接电阻，给电极内增加负压，电极尖端膜片破裂，形成了全细胞式记录方式。 补偿电容电流及电极串联阻抗，信号经Ag/AgCl电极引导，由膜片钳放大器(ECZ 2300)放大 ，滤波为1 kHz。为了防止细胞外液中钙产生的内向电流的影响，细胞外液中加入79 μmol/ L异搏定(江苏连云港制药厂生产)。
1.3 数据分析
, 百拇医药
实验过程由pClamp6.01(Axon Instrument,INC)控制，通过放大器及A/D、D/A转换控制刺激 的连续发放、信号采集和数据分析，并将信号存贮于486计算机硬盘中进行分析。统计数据 以均数±标准差(
±s)表示。2 结果
2.1 正常球囊毛细胞的形态特点
豚鼠球囊毛细胞膜光滑，胞浆透明，细胞分为两型：Ⅰ型细胞呈烧瓶状，核位于基底部，细 胞中部有明显的颈，颈顶端有皮板和一束纤毛，颈和纤毛长度各异，细胞底部到皮板的长度 为(19.32±1.57) μm(n=29);Ⅱ型细胞体呈椭圆或圆形，比Ⅰ型细胞小，核位于中央，也 有皮板及纤毛，胞体长度为(14.11±2.69) μm(n=14)，细胞器主要位于皮板处，纤毛 从动毛向静毛侧按长短顺序排列。Ⅰ、Ⅱ型细胞的比例是65∶35(n=8)。
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2.2 球囊毛细胞的变性表现
失活的毛细胞早期变化是胞内出现颗粒，细胞膜不平，以后是颈部(Ⅰ型)消失或纤毛脱落， 最后是细胞水肿，胞浆外溢。
2.3 不同酶浓度下单个毛细胞数及存活时间
在室温下(22～24℃)培养期间，当酶浓度较低(0.2 mg/ml)或较高(0.5 mg/ml)时，分离的 毛细胞数均较少(分别为15±7个，n=7；19±1个,n=7)，存活时间达7 h的也较少(1 2%；2%)。当酶浓度为0.35 mg/ml时，分离的毛细胞数最多(27±2个，n=8)存活时间也 最长，存活超7 h的达21%。
2.4 A型钾离子流(IA)的分析
实验记录了14个毛细胞，钳制电位在-100 mV，阶跃由电位-70 mV开始至+20 mV，间隔10 mV，脉冲保持时间200 ms。随着膜的去极化，在毛细胞侧膜上可记录到一个电压依赖性复合 外向电流，这个外向电流以快电流为主(图1A)，最大去极化电流的峰值范围为0.9～1.4 nA 。去极化电压越靠近正值，电流激活速度越快。电压激活范围为-50～-60 mV，向细胞 外液 加入4-Ap(四氨基吡啶，Sigma公司，浓度为16 mmol/L[7])，2 min后，复合的外向 电流中快速激活又很快失活的外向电流部分逐渐消失(图1B)，剩余有缓慢激活、持续时间较 长的外向电流。
Fig.1 Complex outward current contained I A and effect of 4-Ap on IA, http://www.100md.com
(A):Complex outward current contained IA;(B):IA was blocked by 4-Ap
从上述图1A的图形特点及ⅠA特异性阻断剂4-Ap削减了快速激活又很快失活的外向 电流部分，初步推断外向电流中含有ⅠA。
2.5 延迟整流性钾电流(Ⅰk)
当细胞外液加入4-Ap(16 mmol/L)后，钳制电位在-70 mV，阶跃由电位-50 mV至+40 mV，脉 冲保持时间为400 ms，在8个毛细胞侧膜上，可记录到缓慢激活的外向电流，在400 ms内无 失活(图2A)。向细胞外液中灌注TEA(四乙基氯化铵，Sigma公司)，使溶液中TEA浓度为20 mm ol/L,2 min后，外向电流幅度减少了53.3%±6.0%(n=8,P<0.01,图2B)。用正常细 胞外液冲洗5 min后，减少的外向电流大部分恢复(图2C)。根据记录电流的特点表明，外向 电流中除了含有ⅠA外，还含有延迟整流性钾电流，这种钾电流对4-Ap不敏感而对TEA敏感 [7]。
Fig.2 Effect of TEA on the rectifier potassium currents and the I-V relationship, http://www.100md.com
3 讨论
由于前庭器官小，结构复杂，毛细胞数量又少，在分离毛细胞时，纤毛易受损，毛细胞的成 活率极低，所以， 在前庭毛细胞离子通道的研究过程中，良好的单个离体的毛细胞数量和存 活时间是至关重要的。目前，毛细胞的分离方法主要是酶消化后辅以机械分离法。酶消化主 要用胶原酶，其次有胰蛋白酶、木瓜蛋白酶等。不同年龄的动物，细胞间的结合力不同，细 胞分离时所需的酶浓度也不同，本实验为了避免年龄对细胞间结合力的影响，动物均选用成 年豚鼠。我们在实验中发现，胶原酶浓度过低(低于0.2 mg/ml)时，分离的毛细胞数较少。 细胞膜表面清洁度也差，不易封接和破膜。当酶浓度过高(超过0.5 mg/ml)，消化时间过 长(超过60 min)，酶消化温度过高(超过37℃)时，易损伤膜表面的蛋白质，分离的毛细胞数 量较少，存活率也降低，且分离的毛细胞在封接、破膜时，成功率也较低。相比之下，当酶 浓度为0.35 mg/ml时，分离出毛细胞的数量最多，细胞的成活率最高，封接和破膜的成功 率也最高。
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近十余年来，随着膜片钳技术的发展，前庭毛细胞功能的研究在细胞和分子水平上有了很大 的突破。迄今已发现毛细胞上存在多种离子通道，以完成机电换能和进行感觉编码的作用 [8]。我们曾用全细胞膜片钳技术记录出牛蛙球囊毛细胞侧膜上存在有A型钾通道(K A)。除KA外，细胞膜上还含有其它类型的钾通道，但性质未定。
本实验用全细胞式膜片钳技术，记录出在豚鼠球囊Ⅱ型毛细胞侧膜上也存在有外向电流，这 些外向电流在钳制电位下，随着膜的去极化而增加，并能被钾通道阻断剂4-Ap、TEA阻断， 推断这些外向电流主要是电压依赖性钾电流。由于实验中细胞外液加入了异搏定，电极内 液中应用了EGTA，则钙依赖性钾通道电流(Ⅰk(ca))较小。ⅠA是一种电压门控性 钾 电流，它的激活电压为-45～60 mV，并在几十至几百ms内快速失活，4-Ap是ⅠA的特异 性 阻断剂。本实验记录的外向K+电流中，一种快K+电流成分的动力学特征符合ⅠA的 特 点，所以，外向电流中含有ⅠA。在毛细胞中ⅠA的作用并不十分清楚，据报道，ⅠA 是豚鼠壶腹嵴中外向电流的一部分[9]。Art等[10]提出，机械活化性Ⅰ A激活，伴随有毛细胞的神经冲动发放，即机械活化性ⅠA可能参与毛细胞的机械电换能过 程及其调节。本实验记录到毛细胞侧膜上含有电压依赖性ⅠA，然而这种ⅠA的活动在机 械电换能机制中的作用还需进一步探讨。本实验进一步观察到，毛细胞膜中还含有起始延迟 、电流稳定没有衰减的钾电流，并且这种电流对4-Ap不敏感，而对TEA敏感，根据以上特点 ，判定此电流为Ⅰk。Ⅰk是动作电位复极化的主要外向电流，与机械电换能后的复极化 有关。本实验所建立的模型将对前庭器官的生理、药理和病理学研究起到重要作用。
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本工作得到白求恩医科大学钟国赣教授和张文杰老师的全力支持和热心指导，特 此致谢。
作者简介：沙建慧(1961-)，女(回族)，吉林省敦化市人，讲师，硕士 研究生，从事前庭功能研究。
参考文献
[1] 莫玲燕，苏鸿禧，刘 铤.豚鼠壶腹嵴毛细胞分离法[J].中华耳鼻咽喉科 杂志，1993，28(3)：131-133.
[2] 苏振伦，姜泗长，顾 瑞，等.豚鼠耳蜗毛细胞分离法[J].中华耳鼻咽喉科杂志 ，1992，27(3)：133-135.
[3] Ashmore J F,Meech R W.Ionic basis of membrane potential in outer hair cells of guinea pig cochlea[J].Nature,1986,322:368-371.
, 百拇医药
[4] Hudspeth A J，Lewis R S.Kinetic analysis of voltage and iondependent cond uctances in saccular hair cells of the bullfrog[J].Rana catesbeiana.J Physio l,1988,400:237-274.
[5] 苏振伦，姜泗长，顾 瑞，等.牛蛙球囊毛细胞的钾离子通道[J].中华耳鼻咽喉 科杂志，1993，28(5)：260-262.
[6]苏振伦，姜泗长，顾 瑞，等.牛蛙球囊毛细胞的钙离子通道[J].中华耳鼻咽喉科杂志，1995，30(2)：70-73.
[7] Russo G,Masetto S,Prigoni I.Isolation of A-type K+ current in hai r cells of the frog crista ampullaris[J].Neuroreport,1995,6(3):425-428.
, 百拇医药
[8] Hudspeth A J.The ionic channels of a vestebrate hair cell[J].Hear Res ,1986,22:21-27.
[9] Rennie K J,Ashmore J F.Ionic currents in isolated vestibular hair cells f rom the guinea-pig crista ampullaris[J].Hear Res，1991,51:279-292.
[10] Art J J,Fettipla R,Fuchs P A.Synaptic hyperpolarization and inhibition o f turtie cochlear hair cell[J].Physiology,1984,356:525-550.
收稿日期：1999-10-14；修回日期：2000-02-12, 百拇医药