动员人外周造血祖细胞定向诱导树突状细胞
作者：韩少荣 汪森明 张积仁 张健 曹漫明 李晓平
单位：韩少荣(第一军医大学 珠江医院肿瘤中心，广东 广州 510282)；汪森明(第一军医大学 珠江医院肿瘤中心，广东 广州 510282)；张积仁(第一军医大学 珠江医院肿瘤中心，广东 广州 510282)；张健(第一军医大学 珠江医院肿瘤中心，广东 广州 510282)；曹漫明(第一军医大学 珠江医院肿瘤中心，广东 广州 510282)；李晓平(南方医院肝胆外科，广东 广州 510515)
关键词：树突状细胞；抗原呈递细胞；造血祖细胞
第一军医大学学报000413 摘要：目的 探讨由动员人外周造血祖细胞体外培养扩增获得的树突状细胞(DC)的生物学特性, 为临床应用肿瘤树突状细胞疫苗建立制备方法。方法 用CS-3000血细胞分离机分离预经干细胞动员的患者外周血单个核细胞(PBMC)，去除淋巴细胞和单核细胞，阴性选择得到外周造血祖细胞，加入rhGM-CSF和rhIL-4培养10～14 d成为树突状细胞，然后进行形态学检测、细胞表型和T细胞刺激能力分析。结果 由外周造血祖细胞来源的树突状细胞可以达到(0.5～1.0)×108数量级；高倍镜和电镜照片显示典型的树突状细胞形态和超微结构；流式细胞仪分析显示细胞高表达HLA-Ⅰ、Ⅱ类抗原和共刺激分子CD80、CD86；同种混合淋巴细胞反应显示细胞具有高效的刺激静止T淋巴细胞活化增殖的能力。结论 用血细胞分离机分离动员外周造血祖细胞体外定向诱导制备树突状细胞可以作为制备肿瘤疫苗的新途径。
, http://www.100md.com
中图分类号：R392.12; R730.5 文献标识码：A
文章编号：1000-2588(2000)04-0353-03
Generating dendritic cells by mobilizing human peripheral hematopoietic precursor cells
HAN Shao-rong, WANG Sen-ming, ZHANG Ji-ren, ZHANG Jian, CAO Man-ming
(Department of Oncology, Zhujiang Hospital, First Military Medical University, Guangzhou 510282, China)
, http://www.100md.com
LI Xiao-ping
(Department of Hepatobiliary Surgery, Nanfang Hospital, First Military Medical University, Guangzhou 510515, China)Abstract : Objective To obtain dendritic cells(DCs)from peripheral blood stem cells and hematopoietic precursor cells in vitro, and assess the feasibility of clinical application of tumor vaccine. Methods Patients were pretreated for stem cell mobilization, and their blood samples were taken to isolate peripheral blood mononuclear cells by Blood Corpuscle Separator CS-3000. The stem cells and hematopoietic precursor cells were isolated after removal of T lymphocytes by E-rosetting and monocytes depleted by adhesion. The obtained cells were cultured in rhGM-CSF and rhIL-4 for 2 weeks to generate DCs, which were identified by morphological features and underwent tests of surface antigen expression and T cell stimulatory ability. Results Large amount of DCs could be obtained by the culture in presence of rhGM-CSF and rhIL-4. DCs displayed typical morphology with large, delicate processes or veils when viewed by phase-contrast microscopy, and the processes appeared long and thin when observed under an electron microscope. DCs expressed high level surface antigen of HLA-ABC, HLA-DR, CD80 and CD86, and potently stimulated the proliferation of allo-T cells. Conclusion Large amount of mature DCs could be generated from human peripheral blood stem and hematopoietic precursor cells, and this method is feasible for clinical application.
, http://www.100md.com
Key words: dendritic cells; antigen-presenting cells; peripheral hematopoietic precursor cells
以树突状细胞(DC)为基础的新型肿瘤疫苗正在临床试验中，而树突状细胞的来源广泛，主要由骨髓、脐带血、脾脏、外周血等部位的CD34+造血干细胞、单核细胞诱导分化或直接分离 [1] 。目前的多种制备方法中，用有的方法制备的细胞均质性好但数量少难以培养，而用有的方法制备的细胞虽然数量多但存在异质性，抗原摄取与T细胞活化能力参差不齐。本研究另辟蹊径以动员人外周造血祖细胞为主要细胞来源，用CS-3000血细胞分离机分离、体外培养扩增制备树突状细胞，探讨其生物学特性，为建立临床适用的树突状细胞瘤苗制备技术提供依据。
1 材料与方法
1.1 主要试剂与仪器
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RPMI-1640培养液；新生小牛血清购自Hyclone公司; 淋巴细胞分离液(Ficoll-paque, 1.077 g/ml)为Pharmacia产品; 神经氨酸酶(neuraminidase, Clostridium perfringens来源, 0.5～6 U/mg)购自Sigma公司；新鲜绵羊血红细胞(SRBC)采自南方医院实验动物研究所；重组人GM-CSF(比活性0.555×106 IU/50 mg)购自Schering-Plough公司; 重组人IL-4(比活性≥2×106 IU/mg，纯度>98%)购自Pepro Tech EC Ltd.; FITC标记的鼠抗人HLA-I、HLA-DR、CD80、CD86 单克隆抗体与FITC标记的鼠IgG2a、IgG2b、IgG1、IgM均为美国Pharmingen公司产品；丝裂霉素C为日本 Kyowa Hakko公司产品；6孔细胞培养板(丹麦Nunclon公司)；血细胞分离机CS-3000 Plus(美国百特公司)；流式检测在本校科技楼流式细胞仪室进行。
, 百拇医药
1.2 外周血干/祖细胞分离
结肠癌患者5例，常规方案化疗加皮下注射造血生长因子GM-CSF和G-CSF进行干细胞动员，用血细胞分离机分离外周血单个核细胞(PBMC)，再经淋巴细胞分离液梯度离心纯化，Petri培养皿吸附法分出单核细胞和部分B淋巴细胞。另行培养成为单核细胞来源的DC(MoDC)作对照研究。所收集非贴壁细胞为富含干/祖细胞成分。
1.3 T淋巴细胞的分离(E-玫瑰花结形成法)
绵羊红细胞预先用神经氨酸酶(1 U/ml)处理。将富含干/祖细胞成分按文献[4]所述方法分离出与SRBC结合形成花结的T细胞，得到进一步纯化的干/祖细胞成分。
1.4 体外定向诱导分化培养
分离获得的干/祖细胞(2.5×106 /ml)加入24孔板，全培(10% FCS的RPMI 1640)中加入细胞因子rhGM-CSF 终浓度为100 ng/ml，rhIL-4 终浓度为10 ng/ml。37 ℃、5%CO2孵箱培养，隔天半量换液并保持细胞因子浓度不变。第10～14天可收获DC(又称SDC)。DC的得率按下列公式计算：DC得率=(第12天收获的DC细胞数/第1天孵育的单个核细胞总数)×100%。
, 百拇医药
1.5 DCs形态学观察
相差显微镜在高倍镜下观察并摄片。扫描电镜标本制作：DC悬液用PBS洗2次，4%戊二醛4 ℃固定24～48 h后，PBS洗1次，制成悬液滴片，1%锇酸固定1.5 h，PBS冲洗数次，梯度酒精脱水(70% 12 h，80%、90%、100%各3 min)，镀金后上镜观察摄片。
1.6 流式细胞术分析
DC悬液1×106/ml用PBS洗2次，加入FITC标记的单抗HLA-ABC、HLA-DR、CD80、CD86，37 ℃避光孵育30 min后检测。
1.7 同种混合淋巴细胞反应
刺激细胞(SDC、MoDC、PBMC)分别用完全培养液悬浮，调整密度为5×106/ml，加入终浓度25 μg/ml的丝裂霉素C，37 ℃孵育45 min，Hanks液洗4次，用完全培养液悬浮。调整密度后，分别以空白/孔、1×103/孔、3×103/孔、1×104/孔加入96孔圆底培养板，每组设3个复孔，每孔再加入1×105同种T细胞，终体积为200 μl，37 ℃、5% CO2孵箱培养96 h，MTT显色法于波长570 nm处检测A570值。结果用3孔均值表示，刺激指数SI=加刺激细胞孔的A570值/不加刺激细胞孔的A570值。
, 百拇医药
2 结果
2.1 DCs的得率与形态学检测
分离纯化获得的干/祖细胞经GM-CSF和IL-4培养扩增，最终可获得(0.5～1.0)×108 DC，得率为1 000%～2 000%，即初始干/祖细胞数量的10～20倍。培养3 d开始分裂增殖。培养10 d细胞进入对数增殖期，形成大量细胞集落，胞核呈不规则形态，集落中细胞体积逐渐增大(图1A)，到第12～14 天时集落分散，细胞增殖速度减慢，大部分为悬浮细胞，少量为贴壁细胞，胞核呈毛刺状、树根状，大小为成熟单核细胞的1～1.5倍(图1B)。扫描电镜照片见培养7 d细胞膜表面出现突起，14 d表面突起明显伸展、延长(图2)。
图1 培养树突状细胞的光镜形态(10×40)
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Fig.1 DCs under light microscope (LM 10×40)
A. DC colony on day 10; B. Mature DC on day 14
图2 培养树突状细胞扫描电镜形态(×10 000)
Fig.2 DCs under scanning electron microscope on day14
(EM×10 000)
2.2 DC细胞表型流式细胞术结果
结果显示，培养1周的SDC高表达CD86和HLA-ABC，低表达HLA-DR和CD80；培养2周的SDC上述4种分子表达均明显提高，尤其是HLA-DR和HLA-ABC，阳性率提高了2～3倍以上(表1)。
, 百拇医药
表1 SDC表面共刺激分子和抗原呈递分子表达水平(%)
Tab.1 Molecular expression on the surface of SDC(%)
Surface antigens of SDC
Day 8
Day 14
HLA-DR
8.2
21.5
HLA-ABC
30.5
92.6
, 百拇医药
CD80
3.0
9.7
CD86
51.6
64.0
2.3 T细胞刺激功能试验
同种混合淋巴细胞反应结果见图3。DC与MoDC在不同浓度下的刺激指数均比PBMC高4～5倍，但二者之间比较无明显差异。刺激指数与DC∶T比值呈正相关，随DC∶T比值的增大而增大。
图3 DC对同种淋巴细胞的刺激能力(MTT显色法)
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Fig.3 Mixed lymphocyte reaction stimulating capacity of DC (MTT test)
3 讨论
抗原呈递细胞(APC)有职业性和非职业性两类，树突状细胞属于职业性APC。血液中树突细胞可以来自全身各部位，因此呈现异质性。异质性的DC细胞形态多样， MHC分子和共刺激分子表达量相差很大。因此T细胞刺激能力受到影响，特别是细胞大小、MHC分子和共刺激分子表达情况影响最大。本实验所用动员外周造血祖细胞诱生的DC虽然细胞形态呈现多样性，有典型星状、树根状，也有毛刺状等，但是细胞大小比较均一，MHC-I、II分子和B7分子的表达水平比较一致。流式细胞术表现为FS-SS散射光散点图上细胞分布比较密集，FL1-H荧光曲线图呈峰值高尖的单峰，且荧光强度高。说明本法分离培养的DC比单核细胞衍生的MoDC均质性要好。
最能反映DC免疫功能情况的是DC表面HLA和B7分子的表达水平，它们是DC识别、摄取抗原性物质或识别肿瘤细胞及免疫细胞间信号传递的必须条件。文献[7]报道大肠癌患者外周血DC表面上述分子的表达明显低于正常人水平(HLA-DR为8.6±1.3，B7为7.9±1.1)，可能是肿瘤免疫逃逸的机制之一。我们从结肠癌患者的造血祖细胞诱生DC则正常表达上述分子，而且HLA-DR表达比正常高出一倍，B7-2阳性率也高，若制备成疫苗有望解除患者的免疫逃逸状态。
, 百拇医药
单核细胞是巨噬细胞和树突状细胞的共同前体，在体外发育成树突状细胞只需不到1周时间，但因无法扩增，细胞得率很低，抽取100 ml患者外周血平均得到(1.2～2)×107 DC[2、5]，临床应用受到限制。造血祖细胞需培养2周才能成为DC，但可以克隆扩增，细胞得率明显提高，可行性好，不失为制备树突状细胞的理想材料。此外，本法采用的造血祖细胞均为经- 196 ℃液氮冻存一段时间以后复苏取用的，加入造血生长因子可以分化扩增产生大量细胞集落，仍具有较强的活力，说明冻存造血细胞对其细胞活力不会产生很大影响。临床上可以应用本法对初治的化疗患者采集外周造血祖细胞低温冻存，需要时进行复苏培养制备树突状细胞疫苗。
作者简介：韩少荣(1971-)，男，福建漳州人，1994年毕业于第一军医大学，97级硕士研究生，医师，电话：85143484
参考文献：
1，Banchereau J, Steinman RM. Dendritic cells and the control of immunity [J]. Nature, 1998, 392(19):245-52.
, http://www.100md.com
2，Romani N, Reider D, Heuer M, et al. Generation of mature dendritic cells from human blood. An improved method with special regard to clinical applicability [J]. J Immunol Methods, 1996, 196(2):137-51.
3，Bender A, Sapp M, Schuler G, et al. Improved methods for the generation of dendritic cells from nonproliferating progenitors in human blood [J]. J Immunol Methods, 1996, 196(2):121-35.
4，汪 谦. 现代医学实验方法[M]. 北京：人民卫生出版社，1997. 689-701.
5，朱学军, 曹雪涛, 于益芝，等. 人外周血树突状细胞的体外扩增及鉴定[J]. 中国肿瘤生物治疗杂志, 1997, 4(4):302-6.
6，裴雪涛, 王立生, 徐 黎，等. CD34+造血祖细胞的定向诱导分化研究[J]. 中华血液学杂志, 1998, 19(6):289-93.
7，李明松，袁爱力，张万岱，等. 大肠癌患者外周血树突状细胞免疫功能研究[J]. 世界华人消化杂志, 1999, 7(5):429-32.
收稿日期：1999-12-27, http://www.100md.com
单位：韩少荣(第一军医大学 珠江医院肿瘤中心，广东 广州 510282)；汪森明(第一军医大学 珠江医院肿瘤中心，广东 广州 510282)；张积仁(第一军医大学 珠江医院肿瘤中心，广东 广州 510282)；张健(第一军医大学 珠江医院肿瘤中心，广东 广州 510282)；曹漫明(第一军医大学 珠江医院肿瘤中心，广东 广州 510282)；李晓平(南方医院肝胆外科，广东 广州 510515)
关键词：树突状细胞；抗原呈递细胞；造血祖细胞
第一军医大学学报000413 摘要：目的 探讨由动员人外周造血祖细胞体外培养扩增获得的树突状细胞(DC)的生物学特性, 为临床应用肿瘤树突状细胞疫苗建立制备方法。方法 用CS-3000血细胞分离机分离预经干细胞动员的患者外周血单个核细胞(PBMC)，去除淋巴细胞和单核细胞，阴性选择得到外周造血祖细胞，加入rhGM-CSF和rhIL-4培养10～14 d成为树突状细胞，然后进行形态学检测、细胞表型和T细胞刺激能力分析。结果 由外周造血祖细胞来源的树突状细胞可以达到(0.5～1.0)×108数量级；高倍镜和电镜照片显示典型的树突状细胞形态和超微结构；流式细胞仪分析显示细胞高表达HLA-Ⅰ、Ⅱ类抗原和共刺激分子CD80、CD86；同种混合淋巴细胞反应显示细胞具有高效的刺激静止T淋巴细胞活化增殖的能力。结论 用血细胞分离机分离动员外周造血祖细胞体外定向诱导制备树突状细胞可以作为制备肿瘤疫苗的新途径。
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中图分类号：R392.12; R730.5 文献标识码：A
文章编号：1000-2588(2000)04-0353-03
Generating dendritic cells by mobilizing human peripheral hematopoietic precursor cells
HAN Shao-rong, WANG Sen-ming, ZHANG Ji-ren, ZHANG Jian, CAO Man-ming
(Department of Oncology, Zhujiang Hospital, First Military Medical University, Guangzhou 510282, China)
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LI Xiao-ping
(Department of Hepatobiliary Surgery, Nanfang Hospital, First Military Medical University, Guangzhou 510515, China)Abstract : Objective To obtain dendritic cells(DCs)from peripheral blood stem cells and hematopoietic precursor cells in vitro, and assess the feasibility of clinical application of tumor vaccine. Methods Patients were pretreated for stem cell mobilization, and their blood samples were taken to isolate peripheral blood mononuclear cells by Blood Corpuscle Separator CS-3000. The stem cells and hematopoietic precursor cells were isolated after removal of T lymphocytes by E-rosetting and monocytes depleted by adhesion. The obtained cells were cultured in rhGM-CSF and rhIL-4 for 2 weeks to generate DCs, which were identified by morphological features and underwent tests of surface antigen expression and T cell stimulatory ability. Results Large amount of DCs could be obtained by the culture in presence of rhGM-CSF and rhIL-4. DCs displayed typical morphology with large, delicate processes or veils when viewed by phase-contrast microscopy, and the processes appeared long and thin when observed under an electron microscope. DCs expressed high level surface antigen of HLA-ABC, HLA-DR, CD80 and CD86, and potently stimulated the proliferation of allo-T cells. Conclusion Large amount of mature DCs could be generated from human peripheral blood stem and hematopoietic precursor cells, and this method is feasible for clinical application.
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Key words: dendritic cells; antigen-presenting cells; peripheral hematopoietic precursor cells
以树突状细胞(DC)为基础的新型肿瘤疫苗正在临床试验中，而树突状细胞的来源广泛，主要由骨髓、脐带血、脾脏、外周血等部位的CD34+造血干细胞、单核细胞诱导分化或直接分离 [1] 。目前的多种制备方法中，用有的方法制备的细胞均质性好但数量少难以培养，而用有的方法制备的细胞虽然数量多但存在异质性，抗原摄取与T细胞活化能力参差不齐。本研究另辟蹊径以动员人外周造血祖细胞为主要细胞来源，用CS-3000血细胞分离机分离、体外培养扩增制备树突状细胞，探讨其生物学特性，为建立临床适用的树突状细胞瘤苗制备技术提供依据。
1 材料与方法
1.1 主要试剂与仪器
, http://www.100md.com
RPMI-1640培养液；新生小牛血清购自Hyclone公司; 淋巴细胞分离液(Ficoll-paque, 1.077 g/ml)为Pharmacia产品; 神经氨酸酶(neuraminidase, Clostridium perfringens来源, 0.5～6 U/mg)购自Sigma公司；新鲜绵羊血红细胞(SRBC)采自南方医院实验动物研究所；重组人GM-CSF(比活性0.555×106 IU/50 mg)购自Schering-Plough公司; 重组人IL-4(比活性≥2×106 IU/mg，纯度>98%)购自Pepro Tech EC Ltd.; FITC标记的鼠抗人HLA-I、HLA-DR、CD80、CD86 单克隆抗体与FITC标记的鼠IgG2a、IgG2b、IgG1、IgM均为美国Pharmingen公司产品；丝裂霉素C为日本 Kyowa Hakko公司产品；6孔细胞培养板(丹麦Nunclon公司)；血细胞分离机CS-3000 Plus(美国百特公司)；流式检测在本校科技楼流式细胞仪室进行。
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1.2 外周血干/祖细胞分离
结肠癌患者5例，常规方案化疗加皮下注射造血生长因子GM-CSF和G-CSF进行干细胞动员，用血细胞分离机分离外周血单个核细胞(PBMC)，再经淋巴细胞分离液梯度离心纯化，Petri培养皿吸附法分出单核细胞和部分B淋巴细胞。另行培养成为单核细胞来源的DC(MoDC)作对照研究。所收集非贴壁细胞为富含干/祖细胞成分。
1.3 T淋巴细胞的分离(E-玫瑰花结形成法)
绵羊红细胞预先用神经氨酸酶(1 U/ml)处理。将富含干/祖细胞成分按文献[4]所述方法分离出与SRBC结合形成花结的T细胞，得到进一步纯化的干/祖细胞成分。
1.4 体外定向诱导分化培养
分离获得的干/祖细胞(2.5×106 /ml)加入24孔板，全培(10% FCS的RPMI 1640)中加入细胞因子rhGM-CSF 终浓度为100 ng/ml，rhIL-4 终浓度为10 ng/ml。37 ℃、5%CO2孵箱培养，隔天半量换液并保持细胞因子浓度不变。第10～14天可收获DC(又称SDC)。DC的得率按下列公式计算：DC得率=(第12天收获的DC细胞数/第1天孵育的单个核细胞总数)×100%。
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1.5 DCs形态学观察
相差显微镜在高倍镜下观察并摄片。扫描电镜标本制作：DC悬液用PBS洗2次，4%戊二醛4 ℃固定24～48 h后，PBS洗1次，制成悬液滴片，1%锇酸固定1.5 h，PBS冲洗数次，梯度酒精脱水(70% 12 h，80%、90%、100%各3 min)，镀金后上镜观察摄片。
1.6 流式细胞术分析
DC悬液1×106/ml用PBS洗2次，加入FITC标记的单抗HLA-ABC、HLA-DR、CD80、CD86，37 ℃避光孵育30 min后检测。
1.7 同种混合淋巴细胞反应
刺激细胞(SDC、MoDC、PBMC)分别用完全培养液悬浮，调整密度为5×106/ml，加入终浓度25 μg/ml的丝裂霉素C，37 ℃孵育45 min，Hanks液洗4次，用完全培养液悬浮。调整密度后，分别以空白/孔、1×103/孔、3×103/孔、1×104/孔加入96孔圆底培养板，每组设3个复孔，每孔再加入1×105同种T细胞，终体积为200 μl，37 ℃、5% CO2孵箱培养96 h，MTT显色法于波长570 nm处检测A570值。结果用3孔均值表示，刺激指数SI=加刺激细胞孔的A570值/不加刺激细胞孔的A570值。
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2 结果
2.1 DCs的得率与形态学检测
分离纯化获得的干/祖细胞经GM-CSF和IL-4培养扩增，最终可获得(0.5～1.0)×108 DC，得率为1 000%～2 000%，即初始干/祖细胞数量的10～20倍。培养3 d开始分裂增殖。培养10 d细胞进入对数增殖期，形成大量细胞集落，胞核呈不规则形态，集落中细胞体积逐渐增大(图1A)，到第12～14 天时集落分散，细胞增殖速度减慢，大部分为悬浮细胞，少量为贴壁细胞，胞核呈毛刺状、树根状，大小为成熟单核细胞的1～1.5倍(图1B)。扫描电镜照片见培养7 d细胞膜表面出现突起，14 d表面突起明显伸展、延长(图2)。
图1 培养树突状细胞的光镜形态(10×40)
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Fig.1 DCs under light microscope (LM 10×40)
A. DC colony on day 10; B. Mature DC on day 14
图2 培养树突状细胞扫描电镜形态(×10 000)
Fig.2 DCs under scanning electron microscope on day14
(EM×10 000)
2.2 DC细胞表型流式细胞术结果
结果显示，培养1周的SDC高表达CD86和HLA-ABC，低表达HLA-DR和CD80；培养2周的SDC上述4种分子表达均明显提高，尤其是HLA-DR和HLA-ABC，阳性率提高了2～3倍以上(表1)。
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表1 SDC表面共刺激分子和抗原呈递分子表达水平(%)
Tab.1 Molecular expression on the surface of SDC(%)
Surface antigens of SDC
Day 8
Day 14
HLA-DR
8.2
21.5
HLA-ABC
30.5
92.6
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CD80
3.0
9.7
CD86
51.6
64.0
2.3 T细胞刺激功能试验
同种混合淋巴细胞反应结果见图3。DC与MoDC在不同浓度下的刺激指数均比PBMC高4～5倍，但二者之间比较无明显差异。刺激指数与DC∶T比值呈正相关，随DC∶T比值的增大而增大。
图3 DC对同种淋巴细胞的刺激能力(MTT显色法)
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Fig.3 Mixed lymphocyte reaction stimulating capacity of DC (MTT test)
3 讨论
抗原呈递细胞(APC)有职业性和非职业性两类，树突状细胞属于职业性APC。血液中树突细胞可以来自全身各部位，因此呈现异质性。异质性的DC细胞形态多样， MHC分子和共刺激分子表达量相差很大。因此T细胞刺激能力受到影响，特别是细胞大小、MHC分子和共刺激分子表达情况影响最大。本实验所用动员外周造血祖细胞诱生的DC虽然细胞形态呈现多样性，有典型星状、树根状，也有毛刺状等，但是细胞大小比较均一，MHC-I、II分子和B7分子的表达水平比较一致。流式细胞术表现为FS-SS散射光散点图上细胞分布比较密集，FL1-H荧光曲线图呈峰值高尖的单峰，且荧光强度高。说明本法分离培养的DC比单核细胞衍生的MoDC均质性要好。
最能反映DC免疫功能情况的是DC表面HLA和B7分子的表达水平，它们是DC识别、摄取抗原性物质或识别肿瘤细胞及免疫细胞间信号传递的必须条件。文献[7]报道大肠癌患者外周血DC表面上述分子的表达明显低于正常人水平(HLA-DR为8.6±1.3，B7为7.9±1.1)，可能是肿瘤免疫逃逸的机制之一。我们从结肠癌患者的造血祖细胞诱生DC则正常表达上述分子，而且HLA-DR表达比正常高出一倍，B7-2阳性率也高，若制备成疫苗有望解除患者的免疫逃逸状态。
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单核细胞是巨噬细胞和树突状细胞的共同前体，在体外发育成树突状细胞只需不到1周时间，但因无法扩增，细胞得率很低，抽取100 ml患者外周血平均得到(1.2～2)×107 DC[2、5]，临床应用受到限制。造血祖细胞需培养2周才能成为DC，但可以克隆扩增，细胞得率明显提高，可行性好，不失为制备树突状细胞的理想材料。此外，本法采用的造血祖细胞均为经- 196 ℃液氮冻存一段时间以后复苏取用的，加入造血生长因子可以分化扩增产生大量细胞集落，仍具有较强的活力，说明冻存造血细胞对其细胞活力不会产生很大影响。临床上可以应用本法对初治的化疗患者采集外周造血祖细胞低温冻存，需要时进行复苏培养制备树突状细胞疫苗。
作者简介：韩少荣(1971-)，男，福建漳州人，1994年毕业于第一军医大学，97级硕士研究生，医师，电话：85143484
参考文献：
1，Banchereau J, Steinman RM. Dendritic cells and the control of immunity [J]. Nature, 1998, 392(19):245-52.
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2，Romani N, Reider D, Heuer M, et al. Generation of mature dendritic cells from human blood. An improved method with special regard to clinical applicability [J]. J Immunol Methods, 1996, 196(2):137-51.
3，Bender A, Sapp M, Schuler G, et al. Improved methods for the generation of dendritic cells from nonproliferating progenitors in human blood [J]. J Immunol Methods, 1996, 196(2):121-35.
4，汪 谦. 现代医学实验方法[M]. 北京：人民卫生出版社，1997. 689-701.
5，朱学军, 曹雪涛, 于益芝，等. 人外周血树突状细胞的体外扩增及鉴定[J]. 中国肿瘤生物治疗杂志, 1997, 4(4):302-6.
6，裴雪涛, 王立生, 徐 黎，等. CD34+造血祖细胞的定向诱导分化研究[J]. 中华血液学杂志, 1998, 19(6):289-93.
7，李明松，袁爱力，张万岱，等. 大肠癌患者外周血树突状细胞免疫功能研究[J]. 世界华人消化杂志, 1999, 7(5):429-32.
收稿日期：1999-12-27, http://www.100md.com