冻干辐照人脐动脉移植的实验研究
作者：王晓谭 翁品光 黄志勇 张丽华 施国琳
单位：南京大学医学院附属鼓楼医院，210008 心胸外科 病理科
关键词：冻干辐照人脐动脉；移植
心肺血管病杂志000318
摘要 采用冷冻干燥结合辐照新技术处理人脐动脉(简称LIHUA)做为小动脉旁路移植新材料。通过7条犬建立颈动脉间置移植实验模型(左颈动脉内衬间皮细胞，右侧对照)。应用动脉造影、光镜和扫描电镜等方法来观察新移植物在体内的组织修复过程及其内衬效果，以了解其组织适应性。有许多滋养血管穿过外膜向内延伸，术后6周血管内皮细胞再生良好，总通畅率为71%。虽然内衬间皮细胞的数量和活性细胞的比例尚高，但存留率较低，内衬结果不满意，2组间的组织修复和通畅率无显著差异。血管内皮细胞的再生属于“同步再生”的模式，所以内衬间皮细胞技术不适用于LIHUA。说明冻干辐照人脐动脉的组织适应性良好，符合同(或异)种小口径动脉移植新材料的基本要求。
, 百拇医药
Lyophilize-Irradiated Human Umbilical Artery (LIHUA)
for Microvascular Grafting Prothesis-An Experimemtal Study
Wang Xiaotan,Weng Pinguang,Huang Zhiyong,et al.
(Division of Thoracic Cardiovascular Surgery,Gu Lou Hospital Affiliated to Nanjing University,School of Medicine，210008)
Abstract Lyophilize-Irradiated Human Umbilical Artery (LIHUA) is able as a new prosthesis for small caliber artery bypass grafting.Its histocompatibility and the effect of mesotheliel cell suspension on the patency of LIHUA were carried out in 7 dogs.A carotid artery model was established.Each dog was divided into two groups and received arterial interposition for one seeded (left) and another nonseeded (right) or controlled LIHUA.The prosthesis was explanted at 2,4,6,7,8,9 and 10 weeks after replacement.It were assessed by angiography,light and scanning electron microscopy.A lot of vasa vasorum could be found on this evidence that pass through adventitia into media.Six weeks postoperatively,endothelial cells were well developed that was approved by scanning electron microscope.The total patency rate of the grafts was 71%.Although the number of harvested mesothelial cell and percentage of viable cell were rather high,yet the seeding density and its retaining rate were low.It is therefore,the seeding procedure was unsuccessfully.There was no significant effect of seeded group on patency and histological change.It is suggested that the spontaneous endothelization was established with a model of “simultaneous regeneration”.New endothelium may be regenerated at the same time both on the graft and anastomotic site.Therefore,cell-seeding procrdure would not be considered in this situation.In our study,the healing peocess of the patent prosthesis,LIHUA,was satisfied,and its good histocompatibility was also approved.
, 百拇医药
Key words：Lyophlize-Irridiated Human Umbilical Artery (LIHUA);Graft
当未找到合适的自体血管或冠状动脉旁路移植再次手术时，积极探索应用经过制备的同(或异)种异体血管移植物是开拓冠状血管外科新途径。然而，这类移植物必须具备3个条件：1.低抗原性；2.生物物理性能优越；3.组织适应性良好。1993年，我们采用冷冻干燥结合高能射线辐照方法[1]，成功地制备人脐动脉(Lyophilize-Irradiated Human Umbilical Artery,简称LIHUA)。过去我们已证实它的抗原性低而且生物物理特性优越[2，3]。本文应用LIHUA进行颈动脉间置移植动物实验，以评价它的组织适应性。
有人认为在血管移植之前，应用大网膜微血管的内皮细胞内衬小口径涤纶血管，细胞迅速复盖移植物的腔内并改善其血管通畅率[4]。因此，我们设计颈动脉实验模型，每条狗移植内衬和未内衬的LIHUA各1根，以观察其组织修复过程和内衬间皮细胞的效果。
, 百拇医药
方 法
1.LIHUA的制备 无菌条件下取新鲜人胎儿脐动脉，肝素生理盐水反复冲洗，冷冻到-70℃，尽快干燥，真空封装，小剂量钴60辐照，备用。
2.间皮细胞混悬液的获取和内衬 上腹部切口取实验犬的大网膜一小块，用磷酸盐缓冲液(PBS)反复冲洗，剪成小片，置于0.25%胰蛋白酶37℃水浴25min，用该犬血浆中和，离心5 min，弃上清液。细胞团经PBS洗涤2次，悬浮于该犬血浆1 ml中形成间皮细胞混悬液(MCS)，吸入空针备用，内衬之前，做细胞计数、活性细胞检测和水流冲刷试验。
内衬宜在移植之前应用。首先从真空封装中取出LIHUA，在温生理盐水中复水30 min。然后注入MCS，37℃孵育45 min，每隔5 min，转动LIHUA 90°，使间皮细胞均匀内衬。
3.动物实验 7只健康杂种犬，体重8～20 kg，戊巴妥麻醉(30 mg/kg)。颈部斜切口，暴露两侧颈动脉。肝素化(100 u/kg)。左颈动脉间置3～5 cm长的内衬有间皮细胞LIHUA(n=7，内衬组)；右颈动脉间置相当长度的未内衬LIHUA(n=7，未内衬组)。以7-0无损伤线做LIHUA与颈动脉的近、远端分别行端端吻合。术中补液，术后每天口服阿斯匹林300 mg和潘生丁50 mg，共1周。
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实验犬分别于术后第2、4、6、7、8、9和10周取材。取前行动脉造影，然后连同吻合口两端的颈动脉取下。大体观察后，切片、HE染色、光镜观察。此外，另用扫描电镜(S-360)观察内膜状态。
4.统计 数据以
±S表示，内衬组与非内衬组的通畅率差异用X2检验。
结 果
1.间皮细胞获取和内衬效果 MCS平均浓度为(3.56±1.11)×106细胞数/ml，其中活性细胞占91%±6%，悬液浓度及活性细胞比例虽均达到内衬要求[4]，但内衬后，间皮细胞内衬密度为(4.56±1.33)×104细胞数/cm2，血管壁的大部分并无间皮细胞复盖。经水流冲刷试验，压力为13.0±1.2kPa，间皮细胞内衬密度降到(2.24±0.58)×104细胞数/cm2，其存留率仅有49.2%±5.4%。因此，内衬效果并不理想。
, 百拇医药
2.通畅率 内衬组通畅6根(6/7)，非内衬组通畅4根(4/7)，2组间通畅率差异不显著(P=0.059)。总通畅率为71%(10/14)(表1)。血管通畅者均经动脉造影证实。4根闭塞血管中有3例因吻合口渗血用力压迫所致。
表1 动物取材时间和吻合通畅情况 动物编号
取材时间
通畅情况
左(内衬组)
右(对照组)
1
71天
(10周+)
+
, 百拇医药
+
2
64天
(9周+)
+
-
3
42天
(6周)
+
+
4
49天
(7周)
, 百拇医药
-
-
5
55天
(8周-)
+
+
6
30天
(4周+)
+
-
7
15天
, 百拇医药
(2周+)
+
+
注：+通畅，-闭塞
3.组织学观察
大体观察 移植段通畅者，搏动明显，柔软，有弹性。术后2周，吻合无狭窄，腔面光滑，呈灰白色，与邻近颈动脉相似。术后6周以上，整个管腔有光泽。
显微镜观察 经冻干辐照处理的人脐动脉，虽然内皮和平滑肌细胞均消失但纤维框架完整(图1)。术后2周，移植物腔内复盖纤维素[5]，外膜和中膜有散在纤维母细胞，越靠近管腔细胞越少，说明纤维母细胞是从外膜向中膜延伸，外膜有少量白细胞浸润(图2)。术后6周以上，内膜再内皮化基本完成，扫描电镜下见血管内膜表面已有完整的内皮细胞层，细胞排列紧密整齐，其长轴与血流方向一致(图3)。光镜下见内膜表面出现单层扁平上皮层而无内膜增生(图4)；中膜出现平滑肌细胞，成环形排列但不如颈动脉那样紧密、规律(图5)；外膜有许多滋养血管逐渐伸入中膜，整个血管层次清楚，无坏死、钙化或炎性浸润(图6)。内衬组与非内衬组在各时段上其组织学表现相似。
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图1 经冻干辐照处理的脐动脉，细胞成分消失，纤维结构完整 HE×400
图2A 术后2周，腔面覆盖一层纤维素，管壁结构完整，细胞成分少，外膜有少量炎性细胞浸润 HE×400
图2B 同一标本，外膜已有一些纤维母细胞，越靠近管腔越少 HE×400
图3 术后8周内衬侧，腔面已被内皮细胞覆盖，内皮细胞排列方向与血流方向一致 HE×140
, http://www.100md.com 图4 术后6周，腔面已有内皮细胞存在，其下为一层薄基膜。中膜平滑肌较松散 HE×400
图5 术后9周，中膜有胶原纤维，有大量纤维母细胞和平滑肌细胞，成环形排列 HE×400
图6 术后10周，管壁层次清楚，无钙化，坏死。外膜中膜均有滋养血管存在 HE×400
讨 论
1.组织修复过程 LIHUA植入狗颈动脉后，机体利用LIHUA的纤维框架进行修复和重建血管[6]。它的组织修复过程有3个特征：其一，最早期见到纤维母细胞从外膜向中膜延伸；其二，许多滋养血管从外膜向中膜延伸，中膜出现新生平滑肌细胞，在动脉搏动的刺激下，呈环形排列，还有同向排列的胶原纤维；其三，移植物在整个组织修复过程中自发性再内皮化作用很完善，它足以在防止血栓形成起着重要作用，内皮细胞可以来自纤维母细胞、平滑肌细胞、邻近颈动脉内皮细胞和未分化的间充质细胞。
, 百拇医药
再内皮化作用的主要机制：一是纤维母细胞长入管壁，不仅能够形成胶原纤维，而且在一定条件下向平滑肌细胞和内皮细胞转化[7]；二是滋养血管的出现，不仅为外、中膜提供营养，而且在滋养血管的周围，有许多间充质细胞，随滋养血管伸入管壁，参与内皮细胞的再生。
2.间皮细胞内衬效果 本文尝试采用间皮细胞内衬于LIHUA，但效果不好，可能有两个原因：一是LIHUA的内腔面光滑，不利于间皮细胞粘附或接触；二是内衬之后，其内衬细胞的密度、总量和存留率均低。
我们认为：1.整个移植血管的自发性内皮再生是属于“同步再生”的模式，新生的内皮细胞可以在同期内完成。因此，“内皮或间皮细胞内衬”的方法在这种的新移植物不宜采用。2.通过冻干辐照人脐动脉作为新移植材料的组织修复过程观察，再生内皮细胞是满意的，所以它的组织相容性也已证实是良好的。
本文于1997年4月在重庆第四届血管外科国际会议上宣读
, http://www.100md.com
参考文献
1，张培华，蒋米尔，陆民，等.同种异体小口径血管移植的实验研究.中华实验外科杂志，1993，10：24.
2，翁品光，钱涛，余正，等.冻干辐照人脐动脉的基础研究.江苏医药，1996，22：639.
3，钱涛，翁品光，余正，等.冻干辐照处理脐动脉血管物理性能的实验研究.生物医学工程学杂志，1996，13：62.
4，Pasic M,Muller G W,Von S L K,et al.Superior Late Patency of Small-Diameter Dacron Grafts Seeded With Omental Microvascular Cells:An Experimental Study.Ann Thorac Surg,1994,58:677.
, http://www.100md.com
5，Lei B,Wildevuur C R H,Dijk F,et al.Sequential Studies of Arterial Wall Regeneration Microporous,Compliant,Biodegradurable Small-Caliber Vascular Grafts in Rats.J Thoracic Cardiovasc Surg,1987,93:695.
6，Yeh H S,Keller J T,Brachett K A,et al.Humen Umbilical Artery for Microvascular Grafting.J Neurosurg,1984,61:737.
7，Bengtsson L,Ragnarson B,Hagerstrand A,et al.Living of Viable and Nonviable Allogeneic and Xenogeneic Cardiovascular Tissue with Cultured Adult Human Venous Endothelium.J Thorac Cardiovasc Surg,1993,106:434.
1999-07-19收稿，2000-04-23修回, http://www.100md.com
单位：南京大学医学院附属鼓楼医院，210008 心胸外科 病理科
关键词：冻干辐照人脐动脉；移植
心肺血管病杂志000318
摘要 采用冷冻干燥结合辐照新技术处理人脐动脉(简称LIHUA)做为小动脉旁路移植新材料。通过7条犬建立颈动脉间置移植实验模型(左颈动脉内衬间皮细胞，右侧对照)。应用动脉造影、光镜和扫描电镜等方法来观察新移植物在体内的组织修复过程及其内衬效果，以了解其组织适应性。有许多滋养血管穿过外膜向内延伸，术后6周血管内皮细胞再生良好，总通畅率为71%。虽然内衬间皮细胞的数量和活性细胞的比例尚高，但存留率较低，内衬结果不满意，2组间的组织修复和通畅率无显著差异。血管内皮细胞的再生属于“同步再生”的模式，所以内衬间皮细胞技术不适用于LIHUA。说明冻干辐照人脐动脉的组织适应性良好，符合同(或异)种小口径动脉移植新材料的基本要求。
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Lyophilize-Irradiated Human Umbilical Artery (LIHUA)
for Microvascular Grafting Prothesis-An Experimemtal Study
Wang Xiaotan,Weng Pinguang,Huang Zhiyong,et al.
(Division of Thoracic Cardiovascular Surgery,Gu Lou Hospital Affiliated to Nanjing University,School of Medicine，210008)
Abstract Lyophilize-Irradiated Human Umbilical Artery (LIHUA) is able as a new prosthesis for small caliber artery bypass grafting.Its histocompatibility and the effect of mesotheliel cell suspension on the patency of LIHUA were carried out in 7 dogs.A carotid artery model was established.Each dog was divided into two groups and received arterial interposition for one seeded (left) and another nonseeded (right) or controlled LIHUA.The prosthesis was explanted at 2,4,6,7,8,9 and 10 weeks after replacement.It were assessed by angiography,light and scanning electron microscopy.A lot of vasa vasorum could be found on this evidence that pass through adventitia into media.Six weeks postoperatively,endothelial cells were well developed that was approved by scanning electron microscope.The total patency rate of the grafts was 71%.Although the number of harvested mesothelial cell and percentage of viable cell were rather high,yet the seeding density and its retaining rate were low.It is therefore,the seeding procedure was unsuccessfully.There was no significant effect of seeded group on patency and histological change.It is suggested that the spontaneous endothelization was established with a model of “simultaneous regeneration”.New endothelium may be regenerated at the same time both on the graft and anastomotic site.Therefore,cell-seeding procrdure would not be considered in this situation.In our study,the healing peocess of the patent prosthesis,LIHUA,was satisfied,and its good histocompatibility was also approved.
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Key words：Lyophlize-Irridiated Human Umbilical Artery (LIHUA);Graft
当未找到合适的自体血管或冠状动脉旁路移植再次手术时，积极探索应用经过制备的同(或异)种异体血管移植物是开拓冠状血管外科新途径。然而，这类移植物必须具备3个条件：1.低抗原性；2.生物物理性能优越；3.组织适应性良好。1993年，我们采用冷冻干燥结合高能射线辐照方法[1]，成功地制备人脐动脉(Lyophilize-Irradiated Human Umbilical Artery,简称LIHUA)。过去我们已证实它的抗原性低而且生物物理特性优越[2，3]。本文应用LIHUA进行颈动脉间置移植动物实验，以评价它的组织适应性。
有人认为在血管移植之前，应用大网膜微血管的内皮细胞内衬小口径涤纶血管，细胞迅速复盖移植物的腔内并改善其血管通畅率[4]。因此，我们设计颈动脉实验模型，每条狗移植内衬和未内衬的LIHUA各1根，以观察其组织修复过程和内衬间皮细胞的效果。
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方 法
1.LIHUA的制备 无菌条件下取新鲜人胎儿脐动脉，肝素生理盐水反复冲洗，冷冻到-70℃，尽快干燥，真空封装，小剂量钴60辐照，备用。
2.间皮细胞混悬液的获取和内衬 上腹部切口取实验犬的大网膜一小块，用磷酸盐缓冲液(PBS)反复冲洗，剪成小片，置于0.25%胰蛋白酶37℃水浴25min，用该犬血浆中和，离心5 min，弃上清液。细胞团经PBS洗涤2次，悬浮于该犬血浆1 ml中形成间皮细胞混悬液(MCS)，吸入空针备用，内衬之前，做细胞计数、活性细胞检测和水流冲刷试验。
内衬宜在移植之前应用。首先从真空封装中取出LIHUA，在温生理盐水中复水30 min。然后注入MCS，37℃孵育45 min，每隔5 min，转动LIHUA 90°，使间皮细胞均匀内衬。
3.动物实验 7只健康杂种犬，体重8～20 kg，戊巴妥麻醉(30 mg/kg)。颈部斜切口，暴露两侧颈动脉。肝素化(100 u/kg)。左颈动脉间置3～5 cm长的内衬有间皮细胞LIHUA(n=7，内衬组)；右颈动脉间置相当长度的未内衬LIHUA(n=7，未内衬组)。以7-0无损伤线做LIHUA与颈动脉的近、远端分别行端端吻合。术中补液，术后每天口服阿斯匹林300 mg和潘生丁50 mg，共1周。
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实验犬分别于术后第2、4、6、7、8、9和10周取材。取前行动脉造影，然后连同吻合口两端的颈动脉取下。大体观察后，切片、HE染色、光镜观察。此外，另用扫描电镜(S-360)观察内膜状态。
4.统计 数据以
±S表示，内衬组与非内衬组的通畅率差异用X2检验。结 果
1.间皮细胞获取和内衬效果 MCS平均浓度为(3.56±1.11)×106细胞数/ml，其中活性细胞占91%±6%，悬液浓度及活性细胞比例虽均达到内衬要求[4]，但内衬后，间皮细胞内衬密度为(4.56±1.33)×104细胞数/cm2，血管壁的大部分并无间皮细胞复盖。经水流冲刷试验，压力为13.0±1.2kPa，间皮细胞内衬密度降到(2.24±0.58)×104细胞数/cm2，其存留率仅有49.2%±5.4%。因此，内衬效果并不理想。
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2.通畅率 内衬组通畅6根(6/7)，非内衬组通畅4根(4/7)，2组间通畅率差异不显著(P=0.059)。总通畅率为71%(10/14)(表1)。血管通畅者均经动脉造影证实。4根闭塞血管中有3例因吻合口渗血用力压迫所致。
表1 动物取材时间和吻合通畅情况 动物编号
取材时间
通畅情况
左(内衬组)
右(对照组)
1
71天
(10周+)
+
, 百拇医药
+
2
64天
(9周+)
+
-
3
42天
(6周)
+
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4
49天
(7周)
, 百拇医药
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55天
(8周-)
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6
30天
(4周+)
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7
15天
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(2周+)
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注：+通畅，-闭塞
3.组织学观察
大体观察 移植段通畅者，搏动明显，柔软，有弹性。术后2周，吻合无狭窄，腔面光滑，呈灰白色，与邻近颈动脉相似。术后6周以上，整个管腔有光泽。
显微镜观察 经冻干辐照处理的人脐动脉，虽然内皮和平滑肌细胞均消失但纤维框架完整(图1)。术后2周，移植物腔内复盖纤维素[5]，外膜和中膜有散在纤维母细胞，越靠近管腔细胞越少，说明纤维母细胞是从外膜向中膜延伸，外膜有少量白细胞浸润(图2)。术后6周以上，内膜再内皮化基本完成，扫描电镜下见血管内膜表面已有完整的内皮细胞层，细胞排列紧密整齐，其长轴与血流方向一致(图3)。光镜下见内膜表面出现单层扁平上皮层而无内膜增生(图4)；中膜出现平滑肌细胞，成环形排列但不如颈动脉那样紧密、规律(图5)；外膜有许多滋养血管逐渐伸入中膜，整个血管层次清楚，无坏死、钙化或炎性浸润(图6)。内衬组与非内衬组在各时段上其组织学表现相似。
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图1 经冻干辐照处理的脐动脉，细胞成分消失，纤维结构完整 HE×400
图2A 术后2周，腔面覆盖一层纤维素，管壁结构完整，细胞成分少，外膜有少量炎性细胞浸润 HE×400
图2B 同一标本，外膜已有一些纤维母细胞，越靠近管腔越少 HE×400
图3 术后8周内衬侧，腔面已被内皮细胞覆盖，内皮细胞排列方向与血流方向一致 HE×140
, http://www.100md.com 图4 术后6周，腔面已有内皮细胞存在，其下为一层薄基膜。中膜平滑肌较松散 HE×400
图5 术后9周，中膜有胶原纤维，有大量纤维母细胞和平滑肌细胞，成环形排列 HE×400
图6 术后10周，管壁层次清楚，无钙化，坏死。外膜中膜均有滋养血管存在 HE×400
讨 论
1.组织修复过程 LIHUA植入狗颈动脉后，机体利用LIHUA的纤维框架进行修复和重建血管[6]。它的组织修复过程有3个特征：其一，最早期见到纤维母细胞从外膜向中膜延伸；其二，许多滋养血管从外膜向中膜延伸，中膜出现新生平滑肌细胞，在动脉搏动的刺激下，呈环形排列，还有同向排列的胶原纤维；其三，移植物在整个组织修复过程中自发性再内皮化作用很完善，它足以在防止血栓形成起着重要作用，内皮细胞可以来自纤维母细胞、平滑肌细胞、邻近颈动脉内皮细胞和未分化的间充质细胞。
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再内皮化作用的主要机制：一是纤维母细胞长入管壁，不仅能够形成胶原纤维，而且在一定条件下向平滑肌细胞和内皮细胞转化[7]；二是滋养血管的出现，不仅为外、中膜提供营养，而且在滋养血管的周围，有许多间充质细胞，随滋养血管伸入管壁，参与内皮细胞的再生。
2.间皮细胞内衬效果 本文尝试采用间皮细胞内衬于LIHUA，但效果不好，可能有两个原因：一是LIHUA的内腔面光滑，不利于间皮细胞粘附或接触；二是内衬之后，其内衬细胞的密度、总量和存留率均低。
我们认为：1.整个移植血管的自发性内皮再生是属于“同步再生”的模式，新生的内皮细胞可以在同期内完成。因此，“内皮或间皮细胞内衬”的方法在这种的新移植物不宜采用。2.通过冻干辐照人脐动脉作为新移植材料的组织修复过程观察，再生内皮细胞是满意的，所以它的组织相容性也已证实是良好的。
本文于1997年4月在重庆第四届血管外科国际会议上宣读
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参考文献
1，张培华，蒋米尔，陆民，等.同种异体小口径血管移植的实验研究.中华实验外科杂志，1993，10：24.
2，翁品光，钱涛，余正，等.冻干辐照人脐动脉的基础研究.江苏医药，1996，22：639.
3，钱涛，翁品光，余正，等.冻干辐照处理脐动脉血管物理性能的实验研究.生物医学工程学杂志，1996，13：62.
4，Pasic M,Muller G W,Von S L K,et al.Superior Late Patency of Small-Diameter Dacron Grafts Seeded With Omental Microvascular Cells:An Experimental Study.Ann Thorac Surg,1994,58:677.
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6，Yeh H S,Keller J T,Brachett K A,et al.Humen Umbilical Artery for Microvascular Grafting.J Neurosurg,1984,61:737.
7，Bengtsson L,Ragnarson B,Hagerstrand A,et al.Living of Viable and Nonviable Allogeneic and Xenogeneic Cardiovascular Tissue with Cultured Adult Human Venous Endothelium.J Thorac Cardiovasc Surg,1993,106:434.
1999-07-19收稿，2000-04-23修回, http://www.100md.com