单细胞凝胶电泳技术分析过氧化氢对大鼠外周血淋巴细胞DNA的损伤作用
作者：安文林 李林 朴景华 叶翠飞 李斌 何士大
单位：首都医科大学宣武医院药理研究室，北京脑老化重点实验室，北京 100053
关键词：过氧化氢；淋巴细胞；DNA；单细胞凝胶电泳；激光扫描共聚焦显微镜
中国老年学杂志000523
摘 要 目的 观察不同浓度过氧化氢(25～200 μmol/L)分别作用于正常大鼠外周血淋巴细胞不同时间(5 min和20 min)后细胞DNA的损伤情况。方法 利用快速、灵敏的检测细胞DNA损伤的单细胞凝胶电泳(SCG)技术结合激光扫描共聚焦显微镜，以“彗星样”淋巴细胞出现率(计数一定量细胞其中彗星样细胞所占的比例)、总彗星长度(“彗星”电泳方向上的最大长度，即尾长)和尾距(尾部DNA占总DNA的百分比与头尾部中心间距的乘积)来评价淋巴细胞DNA的损伤程度。结果 过氧化氢能剂量依赖性地导致大鼠外周血淋巴细胞DNA的明显断裂损伤，能使“彗星样”淋巴细胞出现率、总彗星长度和尾距显著增加，并随着时间的延长损伤加重。结论 提示活性氧或自由基增多可能是造成体内细胞DNA断裂损伤的重要原因。
, http://www.100md.com
Analysis of DNA damage in peripheral blood lymphocytes of rats induced by H2O2 with single-cell gel electrophoresis
An Wenlin,Li Lin,Piao Jinghua et al
(Department of Pharmacology,Xuanwu Hospital of Capital University of Medical Sciences,Beijing Key Laboratory for Brain Aging,Beijing 100053)
Abstract：Objective To investigate DNA damage in peripheral blood lymphocytes of rats which were incubated with various doses(25～20 μmol/L) of H2O2 for different time duration(5 min or 20 min).Methods DNA damage was measured by single-cell gel electrophoresis(SCGE) and laser scanning confocal microscopy. The degree of DNA damage was judged by the percentage of lymphocytes with comet-like tail,the tail length and tail moment of the cell.Results DNA damage was demonstrated dose dependently in the peripheral blood lymphocytes of rats when the cells were incubated with the H2O2 for certain time. The percentage of lymphocytes with comet-like tail,tail length and tail moment were aggravated significantly.Conclusions The results indicate that the increasing of reactive oxygen or free radicals may play an important role in the DNA damage.
, 百拇医药
Key words H2O2 Lymphocyte DNA Single-cell gel electrophoresis Laser scanning confocal microscopy
体内自由基代谢异常会导致细胞DNA损伤〔1〕，过氧化氢(H2O2)是自由基代谢过程中一个重要的中间产物，在引起细胞DNA损伤的过程中起着非常重要的作用。单细胞凝胶电泳(SCGE)技术是一种检测细胞DNA损伤的快速、灵敏的方法。本文的目的是要通过SCG与LSCM相结合来研究过氧化氢对外周血淋巴细胞DNA损伤的影响，为进一步探讨老年哺乳动物细胞DNA损伤的机理提供直接证据，并为寻找能拮抗自由基或过氧化氢致细胞DNA损伤的药物提供一种准确而有效的方法。
1 材料和方法
1.1 试剂和仪器 正常熔点琼脂糖(Agarose，中国科学院上海药物研究所实验药厂)；低熔点琼脂糖(Agarose LMP，Promega公司，美国)；RPMI1640(GIBCO BRL公司，美国)；淋巴细胞分离液(中国医学科学院血液研究所)；二甲基亚砜(DMSO)，月桂酰基氨酸钠(N-lauroyl sarcosine sodium)，TritonX-100，碘化丙啶(propidium iodide，PI)(Sigma公司，美国)。
, 百拇医药
电泳仪(美国Bio-Rad公司，Power PAC200型)，激光扫描共聚焦显微镜(LSCM，美国Bio-Rad公司，MRC-1024型)，SL-1数控层析冷柜(军事医学科学院实验仪器厂)，荧光倒置显微镜(日本Nikon公司，TE-300型)。
1.2 淋巴细胞分离与保存 参照Tice等〔2〕的方法略加改进。取大鼠全血1 ml，以1∶2用RPMI1640稀释，轻轻加入盛有1.5 ml淋巴细胞分离液的试管中，2 000 g离心20 min，吸取淋巴细胞层，再以2倍体积的RPMI1640洗一次，弃上清，然后用淋巴细胞冻存液(含80%RPMI1640，10%胎牛血清和10%DMSO)重悬，将细胞密度调至1×106/ml，-70℃冻存。
1.3 单细胞凝胶电泳 参照Singh等的方法略加改进〔3〕。取150 μl 0.5%(w/v)正常熔点琼脂糖(55±2℃)加在磨毛的载玻片上，用盖玻片压平胶面，4℃放置10 min，然后轻轻将盖玻片移开制成底层胶。取50 μl 1%低熔点琼脂糖(37℃)与等体积的淋巴细胞悬液混匀，迅速铺于底层胶上，用盖玻片压平，4℃放置10 min，移去盖玻片。再将制成的胶板放置在大平皿中，倒入裂解液(2.5 mol/L NaCl，100 mmol/L Na2EDTA*2H2O，1%月桂酰基氨酸钠，10 mmol/L三羟甲基氨基甲烷，1% TritonX-100，10% DMSO，pH10)，4℃裂解60 min。取出胶板，水平放入电泳槽中，倒入电泳缓冲液(1 mmol/L Na2EDTA*2H2O，300 mmol/L NaOH)，4℃放置20 min，在25 V，300 mA条件下电泳20 min。将胶板取出置于盛有中和液(0.4 mol/L Tris-HCl，pH7.5)的大平皿中，中和2次，每次15 min(4℃)。再用5 μg/ml的PI在暗处染色15 min，然后将胶板在蒸馏水中漂洗10 min，用荧光封片液(0.5 mol/L碳酸盐缓冲液与甘油等体积混合，pH9.5)封片。
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1.4 激光扫描共聚焦图像的采集和分析 用Nikon公司TE-300型荧光倒置显微镜和Bio-Rad公司MRC-1024型激光共聚焦显微系统对电泳后的淋巴细胞图像进行采集分析。放大200倍后采集的图像用于计数淋巴细胞的“彗尾”出现率，放大400倍的图像用于测量分析。评价NDA损伤的指标采用彗尾样细胞出现率、总彗星长度〔4〕和尾距〔5〕。
2 结 果
大鼠的外周血淋巴细胞经不同浓度过氧化氢损伤一定时间，在碱性环境下电泳后，经LSCM采集得到荧光图像：图1A为正常大鼠外周血淋巴细胞在碱性环境下电泳的荧光图像，图中几乎看不到彗星样淋巴细胞出现；图1B为淋巴细胞与25 μmol/L过氧化氢作用5 min后经电泳得到的荧光图像，图中已发现有少量淋巴细胞出现很短的“拖尾”现象；随着过氧化氢的浓度加大至50和100 μmol/L，出现的“彗星样”淋巴细胞数增多，尾长增长(图1C，图1D)。
, 百拇医药
淋巴细胞与不同浓度的过氧化氢处理5 min，电
泳后经激光扫描共聚焦显微镜采集得到淋巴细胞
DNA的图像
A：正常的淋巴细胞DNA的图像，B：25 μmol/L H2O2处理后的淋巴细胞DNA，C：50 μmol/L H2O2处理后，淋巴细胞DNA出现彗尾现象，D：200 μmol/LH2O2处理后，淋巴细胞DNA彗尾长度增加更明显
图1 过氧化氢对大鼠外周血淋巴细胞DNA的影响
表1 H2O2对彗星样淋巴细胞出现率、尾长和尾距的影响 H2O2
, 百拇医药
(μmol/L)
彗星样淋巴细胞
出现百分率(%)
尾长(μm)
尾距
H2O2 5 min
0
46.7±0.94
25.67±1.42
3.13±0.71
25
36.70±6.072)
, 百拇医药
31.39±1.161)
7.29±0.601)
50
51.83±2.792)
30.90±1.121)
7.37±0.662)
100
84.25±2.442)
43.42±2.582)
12.95±1.172)
, 百拇医药
200
88.85±1.712)
72.85±3.882)
26.78±2.022)
H2O2 20 min
0
11.48±1.77
25.50±1.60
2.84±0.89
25
72.24±2.472)
, 百拇医药
48.24±1.692)
14.96±0.992)
50
84.26±1.312)
57.40±2.682)
19.82±1.472)
100
89.93±3.202)
62.51±2.552)
21.94±1.332)
, 百拇医药
200
93.79±1.462)
63.32±3.632)
21.90±1.752)
结果表示为：均数±标准误；与对照组相比，1)P<0.05，2)P<0.01
图2示正常大鼠外周血淋巴细胞经25～200 μmol/L过氧化氢处理5 min和20 min后，彗星样细胞出现率随过氧化氢浓度的增加和作用时间的延长而增多(图2，表1第1列)。
对出现彗尾的淋巴细胞，用激光扫描共聚焦显微镜的图像处理分析功能测量总彗星长度，即彗星电泳方向的最大长度，通过总彗星长度(即尾长)来评价DNA的损伤程度，拖尾越长表示损伤越严重。图3示过氧化氢对大鼠外周血淋巴细胞彗尾长度的影响，表明过氧化氢的浓度越大，损伤时间越长，其彗星样淋巴细胞的尾长则越大(图3，表1第2列)。利用LSCM的图像处理功能对每组大鼠样本测量，并计算20个彗星样淋巴细胞的尾距(即尾部DNA占总DNA的百分比与头尾部中心间距的乘积)，尾距越大表示DNA损伤越严重。从图4和表1第3列数据中可看到过氧化氢对大鼠外周血淋巴细胞DNA的损伤程度有明显的剂量依赖性关系。
, 百拇医药
图2 过氧化氢对大鼠外周血彗星样
淋巴细胞出现率的影响
横坐标示沿电泳方向彗星的尾长，纵坐标为相应
尾长的淋巴细胞数；每组测20个细胞
图3 过氧化氢对大鼠外周血彗星样
淋巴细胞尾长的影响
图4 过氧化氢对大鼠外周血彗星样
淋巴细胞尾距的影响
3 讨 论
, 百拇医药
自由基的代谢异常是衰老的一个非常重要的危险因素〔6〕。体内自由基产生的增多和清除能力的降低造成体内自由基随增龄而堆积。这极易造成细胞内DNA链的断裂和碱基的氧化等改变，从而导致细胞结构和功能的异常，又加重了衰老的进程，因此在老年动物细胞内以变性形式存在的DNA增多。我们曾利用SCG技术对不同年龄组大鼠外周血淋巴细胞内的DNA损伤情况进行了观察，发现老年动物外周血单个淋巴细胞中DNA的损伤程度与年龄有密切关系，以直接的证据从单细胞的水平证实了老年动物细胞内断裂的DNA碎片增多这一观点。推测其原因可能是衰老大鼠体内自由基及其代谢产物蓄积过多所致。在本实验中用单细胞电泳和激光扫描共聚焦显微镜直接研究了作为自由基代谢过程一个非常重要的中间产物过氧化氢对淋巴细胞DNA的损伤作用。
SCG分析，又称彗星分析，是利用断裂的DNA碎片在强碱的条件下，从DNA的超螺旋结构中释放出来，在电泳时移向阳极的特点，并在荧光染色后可在显微镜下观察到尾部朝向阳极的彗星样影像来对损伤的DNA进行检测。LSCM因其独特的设计而具有更高的横向和纵向分辩率，并能对细胞进行断层扫描(又称细胞CT)，它是目前世界上进行细胞学研究的最先进的仪器之一。细胞电泳后经LSCM采集图像、分析处理，更增加了SCG的灵敏度、结果的准确性和可靠性。
, 百拇医药
细胞悬液经琼脂糖凝胶电泳后，通过LSCM采集图像，根据细胞荧光图像是否象彗星一样头尾分明，将其分为彗星样细胞和非彗星样细胞，计数一定量细胞中彗星样细胞所占的比例，可估计该样品中细胞DNA的损伤程度，但该指标只能反映细胞DNA大致的损伤情况。利用LCSM的图像处理测量功能，可对彗星样淋巴细胞的总彗星长度进行测量，以此来评价单个淋巴细胞DNA的损伤。不过，通过测量彗星长度这种距离指标尚不能全面的反映DNA的损伤情况。实验证明损伤因素作用剂量增大时，DNA的损伤程度增加而尾长基本不变〔7〕。为了更全面地反映DNA的损伤程度，故采用尾距作为指标，即尾部DNA占总DNA的百分比与头尾部中心间距的乘积。
本次实验发现过氧化氢能剂量依赖性地对大鼠外周血淋巴细胞DNA直接造成断裂损伤，使断裂的DNA片断在碱性环境中电泳时迁移速度加快，脱离未断裂的双链DNA，形成明显的“拖尾”现象，使彗星样淋巴细胞百分率、总彗星长度(尾长)和尾距都明显增加。在老年动物体内淋巴细胞DNA断裂损伤增多很可能与体内过氧化氢的积聚增多，从而直接对细胞内DNA造成损伤所致。提示活性氧或氧自由基的增高可能是造成体内细胞DNA断裂损伤的重要原因。SCG技术在氧化应激和老年学中作为一个较好的研究工具，它可以相对定量地反映氧化应激和衰老过程中单个细胞内DNA损伤的情况，并且可以用于观察药物干预对细胞内DNA的影响。鉴于此，可将简洁、快速、灵敏的SCG技术用于寻找具有细胞DNA保护作用的药物筛选。
, 百拇医药
北京市科委资助北京市重点科技项目(项目号：952601800)和北京市重点科技实验室项目(项目号：951890600)，国家人事部资助优秀留学回国人员科研项目(项目号：1998)
作者简介：安文林，男，28岁，助研，硕士，研究方向：老年性痴呆的防治的中药研究
参考文献
1，Dix TA,Hess KM,Medina MA et al.Mechanism of site-selective DNA nicking by the hydrodioxyl(perhydroxyl) radical.Biochemistry，1996；35：4578
2，Tice RR,Strauss GH,Peters WP.High-dose combination alkylating agents with autologous bone-marrow support in patients with breast cancer:preliminary assessment of DNA damage in individual peripheral blood lymphocytes using the single cell gel electrophoresis assay.Mutat Res，1992；271：101
, http://www.100md.com
3，Singh NP,Mccoy MT,Tice PR et al.A simple cell research for quantitation of low levels of DNA damage in individual.Exp Cell Res，1988；175：184
4，Rojas E,Valverde M,Sordo M et al.DNA damage in exfoliated buccal cells of smokers assessed by the single cell gel electrophoresis assay.Mutat Res，1996；370：115
5，Lu YQ,Takeshita T,Morimoto K.Single-cell gel electrophoresis(SCGE)——a review and discusion.Environ Health & Preventive Med，1997；2：53
, 百拇医药
6，Perez CR,Lopez TM,Cadenas S et al.The rate of free radical production as a determination of the rate of aging:evidence from the comparative approach.J Comp Physiol(B)，1998；168：149
7，Kent CR,Eady JJ,Ross GM et al.The comet moment as a measure of DNA damage in the comet assay.Int J Radiat Biol，1995；67：655
收稿日期：1999-09-17
修回日期：1999-10-26, 百拇医药
单位：首都医科大学宣武医院药理研究室，北京脑老化重点实验室，北京 100053
关键词：过氧化氢；淋巴细胞；DNA；单细胞凝胶电泳；激光扫描共聚焦显微镜
中国老年学杂志000523
摘 要 目的 观察不同浓度过氧化氢(25～200 μmol/L)分别作用于正常大鼠外周血淋巴细胞不同时间(5 min和20 min)后细胞DNA的损伤情况。方法 利用快速、灵敏的检测细胞DNA损伤的单细胞凝胶电泳(SCG)技术结合激光扫描共聚焦显微镜，以“彗星样”淋巴细胞出现率(计数一定量细胞其中彗星样细胞所占的比例)、总彗星长度(“彗星”电泳方向上的最大长度，即尾长)和尾距(尾部DNA占总DNA的百分比与头尾部中心间距的乘积)来评价淋巴细胞DNA的损伤程度。结果 过氧化氢能剂量依赖性地导致大鼠外周血淋巴细胞DNA的明显断裂损伤，能使“彗星样”淋巴细胞出现率、总彗星长度和尾距显著增加，并随着时间的延长损伤加重。结论 提示活性氧或自由基增多可能是造成体内细胞DNA断裂损伤的重要原因。
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Analysis of DNA damage in peripheral blood lymphocytes of rats induced by H2O2 with single-cell gel electrophoresis
An Wenlin,Li Lin,Piao Jinghua et al
(Department of Pharmacology,Xuanwu Hospital of Capital University of Medical Sciences,Beijing Key Laboratory for Brain Aging,Beijing 100053)
Abstract：Objective To investigate DNA damage in peripheral blood lymphocytes of rats which were incubated with various doses(25～20 μmol/L) of H2O2 for different time duration(5 min or 20 min).Methods DNA damage was measured by single-cell gel electrophoresis(SCGE) and laser scanning confocal microscopy. The degree of DNA damage was judged by the percentage of lymphocytes with comet-like tail,the tail length and tail moment of the cell.Results DNA damage was demonstrated dose dependently in the peripheral blood lymphocytes of rats when the cells were incubated with the H2O2 for certain time. The percentage of lymphocytes with comet-like tail,tail length and tail moment were aggravated significantly.Conclusions The results indicate that the increasing of reactive oxygen or free radicals may play an important role in the DNA damage.
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Key words H2O2 Lymphocyte DNA Single-cell gel electrophoresis Laser scanning confocal microscopy
体内自由基代谢异常会导致细胞DNA损伤〔1〕，过氧化氢(H2O2)是自由基代谢过程中一个重要的中间产物，在引起细胞DNA损伤的过程中起着非常重要的作用。单细胞凝胶电泳(SCGE)技术是一种检测细胞DNA损伤的快速、灵敏的方法。本文的目的是要通过SCG与LSCM相结合来研究过氧化氢对外周血淋巴细胞DNA损伤的影响，为进一步探讨老年哺乳动物细胞DNA损伤的机理提供直接证据，并为寻找能拮抗自由基或过氧化氢致细胞DNA损伤的药物提供一种准确而有效的方法。
1 材料和方法
1.1 试剂和仪器 正常熔点琼脂糖(Agarose，中国科学院上海药物研究所实验药厂)；低熔点琼脂糖(Agarose LMP，Promega公司，美国)；RPMI1640(GIBCO BRL公司，美国)；淋巴细胞分离液(中国医学科学院血液研究所)；二甲基亚砜(DMSO)，月桂酰基氨酸钠(N-lauroyl sarcosine sodium)，TritonX-100，碘化丙啶(propidium iodide，PI)(Sigma公司，美国)。
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电泳仪(美国Bio-Rad公司，Power PAC200型)，激光扫描共聚焦显微镜(LSCM，美国Bio-Rad公司，MRC-1024型)，SL-1数控层析冷柜(军事医学科学院实验仪器厂)，荧光倒置显微镜(日本Nikon公司，TE-300型)。
1.2 淋巴细胞分离与保存 参照Tice等〔2〕的方法略加改进。取大鼠全血1 ml，以1∶2用RPMI1640稀释，轻轻加入盛有1.5 ml淋巴细胞分离液的试管中，2 000 g离心20 min，吸取淋巴细胞层，再以2倍体积的RPMI1640洗一次，弃上清，然后用淋巴细胞冻存液(含80%RPMI1640，10%胎牛血清和10%DMSO)重悬，将细胞密度调至1×106/ml，-70℃冻存。
1.3 单细胞凝胶电泳 参照Singh等的方法略加改进〔3〕。取150 μl 0.5%(w/v)正常熔点琼脂糖(55±2℃)加在磨毛的载玻片上，用盖玻片压平胶面，4℃放置10 min，然后轻轻将盖玻片移开制成底层胶。取50 μl 1%低熔点琼脂糖(37℃)与等体积的淋巴细胞悬液混匀，迅速铺于底层胶上，用盖玻片压平，4℃放置10 min，移去盖玻片。再将制成的胶板放置在大平皿中，倒入裂解液(2.5 mol/L NaCl，100 mmol/L Na2EDTA*2H2O，1%月桂酰基氨酸钠，10 mmol/L三羟甲基氨基甲烷，1% TritonX-100，10% DMSO，pH10)，4℃裂解60 min。取出胶板，水平放入电泳槽中，倒入电泳缓冲液(1 mmol/L Na2EDTA*2H2O，300 mmol/L NaOH)，4℃放置20 min，在25 V，300 mA条件下电泳20 min。将胶板取出置于盛有中和液(0.4 mol/L Tris-HCl，pH7.5)的大平皿中，中和2次，每次15 min(4℃)。再用5 μg/ml的PI在暗处染色15 min，然后将胶板在蒸馏水中漂洗10 min，用荧光封片液(0.5 mol/L碳酸盐缓冲液与甘油等体积混合，pH9.5)封片。
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1.4 激光扫描共聚焦图像的采集和分析 用Nikon公司TE-300型荧光倒置显微镜和Bio-Rad公司MRC-1024型激光共聚焦显微系统对电泳后的淋巴细胞图像进行采集分析。放大200倍后采集的图像用于计数淋巴细胞的“彗尾”出现率，放大400倍的图像用于测量分析。评价NDA损伤的指标采用彗尾样细胞出现率、总彗星长度〔4〕和尾距〔5〕。
2 结 果
大鼠的外周血淋巴细胞经不同浓度过氧化氢损伤一定时间，在碱性环境下电泳后，经LSCM采集得到荧光图像：图1A为正常大鼠外周血淋巴细胞在碱性环境下电泳的荧光图像，图中几乎看不到彗星样淋巴细胞出现；图1B为淋巴细胞与25 μmol/L过氧化氢作用5 min后经电泳得到的荧光图像，图中已发现有少量淋巴细胞出现很短的“拖尾”现象；随着过氧化氢的浓度加大至50和100 μmol/L，出现的“彗星样”淋巴细胞数增多，尾长增长(图1C，图1D)。
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淋巴细胞与不同浓度的过氧化氢处理5 min，电
泳后经激光扫描共聚焦显微镜采集得到淋巴细胞
DNA的图像
A：正常的淋巴细胞DNA的图像，B：25 μmol/L H2O2处理后的淋巴细胞DNA，C：50 μmol/L H2O2处理后，淋巴细胞DNA出现彗尾现象，D：200 μmol/LH2O2处理后，淋巴细胞DNA彗尾长度增加更明显
图1 过氧化氢对大鼠外周血淋巴细胞DNA的影响
表1 H2O2对彗星样淋巴细胞出现率、尾长和尾距的影响 H2O2
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(μmol/L)
彗星样淋巴细胞
出现百分率(%)
尾长(μm)
尾距
H2O2 5 min
0
46.7±0.94
25.67±1.42
3.13±0.71
25
36.70±6.072)
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31.39±1.161)
7.29±0.601)
50
51.83±2.792)
30.90±1.121)
7.37±0.662)
100
84.25±2.442)
43.42±2.582)
12.95±1.172)
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200
88.85±1.712)
72.85±3.882)
26.78±2.022)
H2O2 20 min
0
11.48±1.77
25.50±1.60
2.84±0.89
25
72.24±2.472)
, 百拇医药
48.24±1.692)
14.96±0.992)
50
84.26±1.312)
57.40±2.682)
19.82±1.472)
100
89.93±3.202)
62.51±2.552)
21.94±1.332)
, 百拇医药
200
93.79±1.462)
63.32±3.632)
21.90±1.752)
结果表示为：均数±标准误；与对照组相比，1)P<0.05，2)P<0.01
图2示正常大鼠外周血淋巴细胞经25～200 μmol/L过氧化氢处理5 min和20 min后，彗星样细胞出现率随过氧化氢浓度的增加和作用时间的延长而增多(图2，表1第1列)。
对出现彗尾的淋巴细胞，用激光扫描共聚焦显微镜的图像处理分析功能测量总彗星长度，即彗星电泳方向的最大长度，通过总彗星长度(即尾长)来评价DNA的损伤程度，拖尾越长表示损伤越严重。图3示过氧化氢对大鼠外周血淋巴细胞彗尾长度的影响，表明过氧化氢的浓度越大，损伤时间越长，其彗星样淋巴细胞的尾长则越大(图3，表1第2列)。利用LSCM的图像处理功能对每组大鼠样本测量，并计算20个彗星样淋巴细胞的尾距(即尾部DNA占总DNA的百分比与头尾部中心间距的乘积)，尾距越大表示DNA损伤越严重。从图4和表1第3列数据中可看到过氧化氢对大鼠外周血淋巴细胞DNA的损伤程度有明显的剂量依赖性关系。
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图2 过氧化氢对大鼠外周血彗星样
淋巴细胞出现率的影响
横坐标示沿电泳方向彗星的尾长，纵坐标为相应
尾长的淋巴细胞数；每组测20个细胞
图3 过氧化氢对大鼠外周血彗星样
淋巴细胞尾长的影响
图4 过氧化氢对大鼠外周血彗星样
淋巴细胞尾距的影响
3 讨 论
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自由基的代谢异常是衰老的一个非常重要的危险因素〔6〕。体内自由基产生的增多和清除能力的降低造成体内自由基随增龄而堆积。这极易造成细胞内DNA链的断裂和碱基的氧化等改变，从而导致细胞结构和功能的异常，又加重了衰老的进程，因此在老年动物细胞内以变性形式存在的DNA增多。我们曾利用SCG技术对不同年龄组大鼠外周血淋巴细胞内的DNA损伤情况进行了观察，发现老年动物外周血单个淋巴细胞中DNA的损伤程度与年龄有密切关系，以直接的证据从单细胞的水平证实了老年动物细胞内断裂的DNA碎片增多这一观点。推测其原因可能是衰老大鼠体内自由基及其代谢产物蓄积过多所致。在本实验中用单细胞电泳和激光扫描共聚焦显微镜直接研究了作为自由基代谢过程一个非常重要的中间产物过氧化氢对淋巴细胞DNA的损伤作用。
SCG分析，又称彗星分析，是利用断裂的DNA碎片在强碱的条件下，从DNA的超螺旋结构中释放出来，在电泳时移向阳极的特点，并在荧光染色后可在显微镜下观察到尾部朝向阳极的彗星样影像来对损伤的DNA进行检测。LSCM因其独特的设计而具有更高的横向和纵向分辩率，并能对细胞进行断层扫描(又称细胞CT)，它是目前世界上进行细胞学研究的最先进的仪器之一。细胞电泳后经LSCM采集图像、分析处理，更增加了SCG的灵敏度、结果的准确性和可靠性。
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细胞悬液经琼脂糖凝胶电泳后，通过LSCM采集图像，根据细胞荧光图像是否象彗星一样头尾分明，将其分为彗星样细胞和非彗星样细胞，计数一定量细胞中彗星样细胞所占的比例，可估计该样品中细胞DNA的损伤程度，但该指标只能反映细胞DNA大致的损伤情况。利用LCSM的图像处理测量功能，可对彗星样淋巴细胞的总彗星长度进行测量，以此来评价单个淋巴细胞DNA的损伤。不过，通过测量彗星长度这种距离指标尚不能全面的反映DNA的损伤情况。实验证明损伤因素作用剂量增大时，DNA的损伤程度增加而尾长基本不变〔7〕。为了更全面地反映DNA的损伤程度，故采用尾距作为指标，即尾部DNA占总DNA的百分比与头尾部中心间距的乘积。
本次实验发现过氧化氢能剂量依赖性地对大鼠外周血淋巴细胞DNA直接造成断裂损伤，使断裂的DNA片断在碱性环境中电泳时迁移速度加快，脱离未断裂的双链DNA，形成明显的“拖尾”现象，使彗星样淋巴细胞百分率、总彗星长度(尾长)和尾距都明显增加。在老年动物体内淋巴细胞DNA断裂损伤增多很可能与体内过氧化氢的积聚增多，从而直接对细胞内DNA造成损伤所致。提示活性氧或氧自由基的增高可能是造成体内细胞DNA断裂损伤的重要原因。SCG技术在氧化应激和老年学中作为一个较好的研究工具，它可以相对定量地反映氧化应激和衰老过程中单个细胞内DNA损伤的情况，并且可以用于观察药物干预对细胞内DNA的影响。鉴于此，可将简洁、快速、灵敏的SCG技术用于寻找具有细胞DNA保护作用的药物筛选。
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北京市科委资助北京市重点科技项目(项目号：952601800)和北京市重点科技实验室项目(项目号：951890600)，国家人事部资助优秀留学回国人员科研项目(项目号：1998)
作者简介：安文林，男，28岁，助研，硕士，研究方向：老年性痴呆的防治的中药研究
参考文献
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2，Tice RR,Strauss GH,Peters WP.High-dose combination alkylating agents with autologous bone-marrow support in patients with breast cancer:preliminary assessment of DNA damage in individual peripheral blood lymphocytes using the single cell gel electrophoresis assay.Mutat Res，1992；271：101
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3，Singh NP,Mccoy MT,Tice PR et al.A simple cell research for quantitation of low levels of DNA damage in individual.Exp Cell Res，1988；175：184
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7，Kent CR,Eady JJ,Ross GM et al.The comet moment as a measure of DNA damage in the comet assay.Int J Radiat Biol，1995；67：655
收稿日期：1999-09-17
修回日期：1999-10-26, 百拇医药