银染法与放射自显影法检测醛糖还原酶基因多态性的比较
作者：刘健 韩学尧 纪立农
单位：刘健(四川省泸州医学院肾内科)；韩学尧 纪立农(北京大学人民医院内分泌科，北京 100044)
关键词：醛糖还原酶基因；DNA，卫星；银染色法；放射自显影术；限制性片段长度多态性
北京医科大学学报000625 [摘 要]目的：探讨银染法检测醛糖还原酶(aldose reductase,AR)基因5′端微卫星多态性的可靠性。方法：用银染法和放射自显影法分别检测相同样本DNA的AR基因微卫星多态性，比较二者结果。结果：两种方法均能清楚判读基因型且结果一致。结论：银染法可以代替放射自显影方法检测AR基因的微卫星多态性。
[中图分类号]Q754 [文献标识码]A
[文章编号]1000-1530(2000)06-0567-02
, 百拇医药
Comparison of methods for detecting polymorphism of aldose reductase gene between autoradiograph and silver stain
LIU Jian，HAN Xue-Yao，JI Li-Nong
(Department of Endocrinology,Peking University People's Hospital,Beijing 100044,China)
ABSTRACT Objective：To explore the reliability of silver stain determination of the microsatellite polymorphism at 5′ end of aldose reductase(AR) gene.Methods:The microsatellite polymorphism of AR gene was detected by autoradiogram and silver stain.Results:Two methods could distinguish genotypes clearly and the results were the same.Conclusion:The method of silver stain can replace that of autoradiogram to determine the microsatellite polymorphism of AR gene.
, 百拇医药
KEY WORDS Aldose reductase gene;DNA,satellite;Silver staining;Autoradiography;Restriction fragment length polymorphisms
微卫星DNA作为一种新的遗传标记,在遗传缺陷的产前诊断、亲子鉴定及群体研究等方面得到了广泛应用[1]。目前，一般都采用核素或荧光标记引物，PCR后，将产物在测序胶上电泳分离扩增片段的方法进行微卫星多态性检测[2，3]。前者操作繁琐，可造成对实验者和环境的污染；后者虽克服了核素的缺点且可使实验自动化，但因仪器昂贵无法推广。而我们用银染法和放射自显影方法对醛糖还原酶(aldose reductase,AR)基因5′端微卫星多态性进行检测，证明银染法是一种快捷、可靠的微卫星多态性检测方法。
1 材料与方法
, http://www.100md.com 1.1 材料
常规方法从外周血白细胞中提取基因组DNA.。引物设计同文献[4]：上游引物:5′-GAATCTTAACATGCTCTGA-
ACC-3′,下游引物 ：5′-GCCCA-GCCCTATACCTAGT-3′。由中国科学院微生物研究所合成。扩增片段为AR基因转录区上游2.1 kb处的(CA)n重复序列。扩增片段分离用Bio-Rad公司的DNA测序电泳装置。
1.2 方法
1.2.1 PCR扩增 (1)银染法的扩增：反应体系为25 μl，含dNTP200 μmol.L-1，引物各20 pmol，TaqDNA聚合酶1.5 u,基因组DNA 30～100 ng。扩增条件：94 ℃预变性5 min，之后94 ℃ 1 min，62 ℃ 1 min，72 ℃ 50 s，共30个循环。(2)放射自显影法扩增：先将上游引物行核素标记，标记体系为0.45 μl,含T4多核苷酸激酶0.7 u,上游引物20 pmol,γ-32P-ATP 74 kBq。水浴37 ℃ 60 min。扩增反应体系为7.5 μl,含TaqDNA聚合酶0.5 u，余组成及反应体系同上。
, 百拇医药
1.2.2 电泳 采用含7 mol.L-1尿素变性聚丙烯酰胺凝胶电泳系统(acrymide/bis=39/1)。银染法时，将长玻璃板反硅化。电泳缓冲液为0.6×TBE,PCR扩增产物3 μl与0.3 μl 10×变性上样缓冲液混合后,90 ℃热变性5 min后置冰上骤冷至少5 min后上样。上样前预电泳至凝胶温度达42～45 ℃。电泳过程采用恒温模式，设定温度45 ℃，电泳70 min。
1.2.3 硝酸银染色 将附着凝胶的长玻璃板在10%(体积分数)乙酸溶液中固定30 min，蒸馏水清洗3次每次2 min，转入含1 g.L-1硝酸银及1.5‰(体积分数)甲醛的溶液中染色30 min，蒸馏水清洗3～5 s后,迅速转入预冷至4℃的含30 g.L-1碳酸钠、1.5‰(体积分数)甲醛及0.2 g.L-1硫代硫酸钠的显影液中终止反应取出玻璃板自然干燥，读取基因型。
, 百拇医药
1.2.4 放射自显影 用滤纸吸附玻璃板上的凝胶并在其表面覆以保鲜膜,在干胶仪上80 ℃干胶1 h后,置于压片盒与X光胶片接触,室温曝光24 h,洗片。
2 结果
选取15个基因组DNA标本，检测上述点的微卫星多态性，银染法结果(图1)和放射自显影结果(图2)均能清楚判度基因型，二者符合率为100%。图1及图2中相同标本号为同一DNA标本。图1从左至右基因型依次为Z/Z-2、Z+2/Z+4、Z+2/Z-2、Z/Z、Z-4/Z-2、Z/Z-4、Z-2/Z-2、Z-2/Z-2、Z+2/Z-8、Z/Z-2、Z/Z-4、Z/Z-2、Z-2/Z-4、Z/Z-2、Z/Z+6。
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图1 放射性自显影结果(左)
Figure 1 Results of autoradiogram(left)
图2 银染法结果(右)
Figure 2 Results of silver stain (right)
3 结论
在分子遗传学研究中，微卫星多态性已成为常用的遗传标记，特别在群体遗传学研究中得到广泛的运用。单侧引物标记行放射自显影的结果，因影子带少而易于判读基因型，但因核素污染而难以在普通实验室进行，且繁琐耗时。本文用相同的DNA标本，分别用两种方法检测醛糖还原酶5′端的微卫星多态性，证明银染法具有分辨率高、省时(银染过程仅需1 h)方便且无环境污染之虞，可推广应用。
, 百拇医药
在实验中我们发现，银染结果显示，伴随每条等位基因片段常出现1～3条影子带，但并不影响等位基因的判读。因为，只要PCR扩增产物量多且非特异少，影子带的带型是固定的，且主产物带总是最强的带。通过增加PCR产物量，控制显色时间(显色液的预冷有利于控制显色时间)，可降低本底，提高分辨率。
参考文献
1，赵振铭，褚嘉佑，郭 仁.微卫星DNA及其在医学遗传学研究中的应用[J].中华医学遗传学杂志，1997，14：40-43
2，Micheal D,Susan LD,Annabel B,et al.Genetic mapping of the B1BABABA receptor gene to human chromosome 4 using a tetranucleotide repeat polymorphism[J].Am J Hum Genet,1991,49:621-626
, 百拇医药
3，Schwartz LS,Jack T,Bradley P.Fluorescent multiplex linkage analysis and carrier detection for Duchenne/Becker muscular dystrophy[J].Am J Hum Genet,1992,51:721-729
4，Ben C,Karen SL,Nelson MS,et al.An(A-C)n dinucleotide repeat polymorphic marker at the 5′ end of the aldose reductase gene is associated with early-onset diabetic retinopathy in NIDDM patients[J].Diabetes,1995,44:727-732
收稿日期：1999-04-05, http://www.100md.com
单位：刘健(四川省泸州医学院肾内科)；韩学尧 纪立农(北京大学人民医院内分泌科，北京 100044)
关键词：醛糖还原酶基因；DNA，卫星；银染色法；放射自显影术；限制性片段长度多态性
北京医科大学学报000625 [摘 要]目的：探讨银染法检测醛糖还原酶(aldose reductase,AR)基因5′端微卫星多态性的可靠性。方法：用银染法和放射自显影法分别检测相同样本DNA的AR基因微卫星多态性，比较二者结果。结果：两种方法均能清楚判读基因型且结果一致。结论：银染法可以代替放射自显影方法检测AR基因的微卫星多态性。
[中图分类号]Q754 [文献标识码]A
[文章编号]1000-1530(2000)06-0567-02
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Comparison of methods for detecting polymorphism of aldose reductase gene between autoradiograph and silver stain
LIU Jian，HAN Xue-Yao，JI Li-Nong
(Department of Endocrinology,Peking University People's Hospital,Beijing 100044,China)
ABSTRACT Objective：To explore the reliability of silver stain determination of the microsatellite polymorphism at 5′ end of aldose reductase(AR) gene.Methods:The microsatellite polymorphism of AR gene was detected by autoradiogram and silver stain.Results:Two methods could distinguish genotypes clearly and the results were the same.Conclusion:The method of silver stain can replace that of autoradiogram to determine the microsatellite polymorphism of AR gene.
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KEY WORDS Aldose reductase gene;DNA,satellite;Silver staining;Autoradiography;Restriction fragment length polymorphisms
微卫星DNA作为一种新的遗传标记,在遗传缺陷的产前诊断、亲子鉴定及群体研究等方面得到了广泛应用[1]。目前，一般都采用核素或荧光标记引物，PCR后，将产物在测序胶上电泳分离扩增片段的方法进行微卫星多态性检测[2，3]。前者操作繁琐，可造成对实验者和环境的污染；后者虽克服了核素的缺点且可使实验自动化，但因仪器昂贵无法推广。而我们用银染法和放射自显影方法对醛糖还原酶(aldose reductase,AR)基因5′端微卫星多态性进行检测，证明银染法是一种快捷、可靠的微卫星多态性检测方法。
1 材料与方法
, http://www.100md.com 1.1 材料
常规方法从外周血白细胞中提取基因组DNA.。引物设计同文献[4]：上游引物:5′-GAATCTTAACATGCTCTGA-
ACC-3′,下游引物 ：5′-GCCCA-GCCCTATACCTAGT-3′。由中国科学院微生物研究所合成。扩增片段为AR基因转录区上游2.1 kb处的(CA)n重复序列。扩增片段分离用Bio-Rad公司的DNA测序电泳装置。
1.2 方法
1.2.1 PCR扩增 (1)银染法的扩增：反应体系为25 μl，含dNTP200 μmol.L-1，引物各20 pmol，TaqDNA聚合酶1.5 u,基因组DNA 30～100 ng。扩增条件：94 ℃预变性5 min，之后94 ℃ 1 min，62 ℃ 1 min，72 ℃ 50 s，共30个循环。(2)放射自显影法扩增：先将上游引物行核素标记，标记体系为0.45 μl,含T4多核苷酸激酶0.7 u,上游引物20 pmol,γ-32P-ATP 74 kBq。水浴37 ℃ 60 min。扩增反应体系为7.5 μl,含TaqDNA聚合酶0.5 u，余组成及反应体系同上。
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1.2.2 电泳 采用含7 mol.L-1尿素变性聚丙烯酰胺凝胶电泳系统(acrymide/bis=39/1)。银染法时，将长玻璃板反硅化。电泳缓冲液为0.6×TBE,PCR扩增产物3 μl与0.3 μl 10×变性上样缓冲液混合后,90 ℃热变性5 min后置冰上骤冷至少5 min后上样。上样前预电泳至凝胶温度达42～45 ℃。电泳过程采用恒温模式，设定温度45 ℃，电泳70 min。
1.2.3 硝酸银染色 将附着凝胶的长玻璃板在10%(体积分数)乙酸溶液中固定30 min，蒸馏水清洗3次每次2 min，转入含1 g.L-1硝酸银及1.5‰(体积分数)甲醛的溶液中染色30 min，蒸馏水清洗3～5 s后,迅速转入预冷至4℃的含30 g.L-1碳酸钠、1.5‰(体积分数)甲醛及0.2 g.L-1硫代硫酸钠的显影液中终止反应取出玻璃板自然干燥，读取基因型。
, 百拇医药
1.2.4 放射自显影 用滤纸吸附玻璃板上的凝胶并在其表面覆以保鲜膜,在干胶仪上80 ℃干胶1 h后,置于压片盒与X光胶片接触,室温曝光24 h,洗片。
2 结果
选取15个基因组DNA标本，检测上述点的微卫星多态性，银染法结果(图1)和放射自显影结果(图2)均能清楚判度基因型，二者符合率为100%。图1及图2中相同标本号为同一DNA标本。图1从左至右基因型依次为Z/Z-2、Z+2/Z+4、Z+2/Z-2、Z/Z、Z-4/Z-2、Z/Z-4、Z-2/Z-2、Z-2/Z-2、Z+2/Z-8、Z/Z-2、Z/Z-4、Z/Z-2、Z-2/Z-4、Z/Z-2、Z/Z+6。
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图1 放射性自显影结果(左)
Figure 1 Results of autoradiogram(left)
图2 银染法结果(右)
Figure 2 Results of silver stain (right)
3 结论
在分子遗传学研究中，微卫星多态性已成为常用的遗传标记，特别在群体遗传学研究中得到广泛的运用。单侧引物标记行放射自显影的结果，因影子带少而易于判读基因型，但因核素污染而难以在普通实验室进行，且繁琐耗时。本文用相同的DNA标本，分别用两种方法检测醛糖还原酶5′端的微卫星多态性，证明银染法具有分辨率高、省时(银染过程仅需1 h)方便且无环境污染之虞，可推广应用。
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在实验中我们发现，银染结果显示，伴随每条等位基因片段常出现1～3条影子带，但并不影响等位基因的判读。因为，只要PCR扩增产物量多且非特异少，影子带的带型是固定的，且主产物带总是最强的带。通过增加PCR产物量，控制显色时间(显色液的预冷有利于控制显色时间)，可降低本底，提高分辨率。
参考文献
1，赵振铭，褚嘉佑，郭 仁.微卫星DNA及其在医学遗传学研究中的应用[J].中华医学遗传学杂志，1997，14：40-43
2，Micheal D,Susan LD,Annabel B,et al.Genetic mapping of the B1BABABA receptor gene to human chromosome 4 using a tetranucleotide repeat polymorphism[J].Am J Hum Genet,1991,49:621-626
, 百拇医药
3，Schwartz LS,Jack T,Bradley P.Fluorescent multiplex linkage analysis and carrier detection for Duchenne/Becker muscular dystrophy[J].Am J Hum Genet,1992,51:721-729
4，Ben C,Karen SL,Nelson MS,et al.An(A-C)n dinucleotide repeat polymorphic marker at the 5′ end of the aldose reductase gene is associated with early-onset diabetic retinopathy in NIDDM patients[J].Diabetes,1995,44:727-732
收稿日期：1999-04-05, http://www.100md.com