典型醛类污染物单独及联合作用对小鼠脾淋巴细胞DNA损伤的离体实验研究
作者：杨丹凤 袭著革 张华山 李官贤 梁增辉
单位：杨丹凤(军事医学科学院卫生学环境医学研究所，天津 300050)；袭著革(军事医学科学院卫生学环境医学研究所，天津 300050)；张华山(军事医学科学院卫生学环境医学研究所，天津 300050)；李官贤(军事医学科学院卫生学环境医学研究所，天津 300050)；梁增辉(军事医学科学院卫生学环境医学研究所，天津 300050)
关键词：甲醛；乙醛；丙烯醛；DNA损伤
卫生研究000111 摘要：应用单细胞凝胶电泳技术(彗星实验)检测了3种典型醛类污染物对小鼠脾淋巴细胞DNA损伤情况。结果发现3种化合物都引起了小鼠脾淋巴细胞产生彗星现象，并且存在一定的剂量-效应关系。表明此3种醛类化合物均可引起细胞DNA发生断裂。
中图分类号：X 512.031 R 730 231.1 文献标识码：A
, http://www.100md.com
文章编号：1000-8020(2000)01-0030-03
Effect of typical aldehyde pollutants on the DNA
damage of spleen lymphocytes of mice
Yang Danfeng,Xi Zhuge,Zhang Huashan,Li Guanxian，et al.
(Institute of Environmental Medicine,Academy of Military Medical Sciences,Tianjin 300050,China)
Abstract：The DNA damage of spleen lymphocytes induced by three typical aldehyde pollutants was studied in vitro with microgel single cell electrophoresis assay (comet assay).It showed that the comet cells induced by the three chemicals were observed,and the dose-dependent relations were existed.It suggested that the three aldehydes could induce DNA strand breakage.
, 百拇医药
Key words：formaldehyde,acetaldehyde,acrolein,DNA damage
当前室内空气污染对人类健康的危害是环境与健康科学研究的热点，其中作为挥发性有机化合物之一的醛类化合物由于与人们的生产生活关系非常密切而受到研究者的关注。甲醛、乙醛和丙烯醛不仅来源广泛，而且还具有潜在的致癌性，是最具环境意义的典型醛类污染物。国际癌症研究中心(IARC)已经将甲醛列于2A组，乙醛列于2B组[1]。目前对于甲醛、乙醛和丙烯醛的致癌机制尚不明了，主要集中于对DNA的损伤研究[1，2]。本文主要探讨甲醛、乙醛和丙烯醛对遗传物质DNA的断裂损伤作用，以及三者对DNA的联合损伤作用，以便进一步解释它们的致突致癌机制，并为筛选对接触醛类化合物较为理想的效应生物标志物提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 主要试剂和仪器
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甲醛(36%～38%水溶液)、乙醛(40%水溶液)、丙烯醛均为分析纯；溴乙锭(EB)；正常熔点琼脂糖(NMA)、低熔点琼脂糖(LMA)。可调式电泳仪；电流50～500mA，电压220～1 000V(中国科学院上海生物研究所)；Microlux-11荧光显微镜(日本岛津)。
1.2 方法
1.2.1 细胞处理 选用雌性健康昆明种小鼠，体重25g左右，取小鼠脾脏，按文献制备细胞悬液并悬浮于RPMI1640培养液中至所需浓度，用台盼蓝染色，存活率为95%。将不同量的甲醛、乙醛和丙烯醛与一定量的细胞悬液混匀于总反应体积为5ml的RPMI1640培养液中(细胞数1×105)，置于37℃培养箱孵育30min，取出后测定细胞存活率>95%。
1.2.2 单细胞凝胶电泳(SCGE) 按Singh方法[3]。在磨砂载玻片上铺0.5%正常熔点琼脂糖100μl，作为第一层，常温下凝固后去掉盖玻片，加入1%的低熔点琼脂糖100μl和等量细胞悬液的混悬液作为第二层。置4℃冰箱5min后，去掉盖玻片，铺0.5%低熔点琼脂糖100μl作为第三层。置4℃冰箱5min,去掉盖玻片，置于预冷的细胞裂解液(2.5mmol/L NaCl,100mmol/L Na2EDTA,1%Triton100，1%Sodium Sarcosinate,10% DMSO,100mmol/L Tris,pH=10)4℃中裂解1.5h，裂解后用冷的去离子水小心冲洗，以免凝胶脱落，直至手摸无滑腻感。小心将凝胶并列放入碱性电泳缓冲液(300mmol/L NaOH，1mmol/L Na2EDTA,pH=12)中的阳极端，约覆过凝胶面0.25cm左右，先浸泡40min，以便DNA在碱性条件下解螺旋和产生碱易变性区段，使DNA断链在电场中易于迁移，之后调节电流至350mA，电压为25V，电泳40min。轻轻取出凝胶载玻片，放入冷的Tris-HCl(0.4mmol/L,pH=7.4)缓冲液中，反复中和至中性。将凝胶载玻片放入无水乙醇中浸泡40min,取出后凉干。向载玻片上滴加25μg/ml溴化乙锭50μl，染色20min。用冷的蒸馏水反复冲洗15min。盖上盖玻片，在镜下随机观察计数50个细胞，DNA损伤的细胞出现拖尾现象，尤如彗星。计算彗星细胞发生率(%)：彗星细胞数/50个观察细胞。
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1.3 统计方法
剂量-效应关系用直线相关分析，组间比较用χ2检验。
2 结果
甲醛、乙醛和丙烯醛对小鼠脾淋巴细胞DNA断裂的影响分别见图1、图2和图3。
图1 不同浓度的甲醛对彗星细胞发生率的影响
图2 不同浓度的乙醛对彗星细胞发生率的影响
图3 不同浓度的丙烯醛对彗星细胞发生率的影响
, 百拇医药
由图1可见，甲醛引起小鼠脾淋巴细胞彗星细胞的发生率在低浓度时增加后呈缓慢降低的趋势，当甲醛浓度<0.01mmol/L时，彗星细胞数呈现直线上升，而后逐渐减少.
由图2可见，乙醛<1.0mmol/L时，随着乙醛剂量的增加，彗星细胞数呈线性增加，χ2=74.285，P<0.01，进行直线拟合
=0.0741+0.7312X,r=0.9954，P<0.01。
由图3可见，随着丙烯醛浓度的增加，彗星细胞出现率呈现快速增加趋势(<0.01mmol/L)，之后逐渐趋于稳定状态(>0.01mmol/L),呈典型的抛物线型曲线，χ2=104.5425，P<0.01。将剂量进行对数变换以后，进行直线拟合=0.4189lgx+1.3598，r=0.9845，P<0.05。
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3种醛类化合物联合对小鼠脾淋巴细胞DNA的损伤作用见附表。
附表 3种醛类化合物联合对小鼠脾淋巴细胞DNA的损伤作用 分组
彗星
细胞数
彗星细胞
出现率(%)
空白
5
10
0.01mmol/L甲醛
6
12
, 百拇医药
1mmol/L乙醛
8
16
0.01mmol/L丙烯醛
14
28
0.01mmol/L甲醛+0.1mmol/L乙醛
16
32
0.01mmol/L甲醛+0.01mmol/L丙烯醛
9
18
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0.01mmol/L乙醛+0.1mmol/L丙烯醛
19
38
0.01mmol/L甲醛+0.1mmol/L乙醛+0.01mmol/L丙烯醛
48
96
由附表可见甲醛和乙醛共同作用引起淋巴细胞出现彗星细胞现象存在一定的协同作用；乙醛与丙烯醛以及甲醛与丙烯醛共同作用时，小鼠脾淋巴细胞出现的彗星细胞并未见明显增加，甚至有所减少，呈现拮抗作用。而当三者共同作用时，彗星细胞出现率显著增加，几乎所有细胞均出现了彗星现象。
3 讨论
本研究应用单细胞凝胶电泳技术(彗星实验)观察了3种典型醛类化合物对小鼠脾淋巴细胞DNA的损伤作用。实验中发现，当甲醛浓度<0.01mmol/L时，彗星细胞出现率呈现直线上升，而当浓度>0.01mmol/L时彗星细胞出现率逐渐减少，分析甲醛此时对细胞DNA的损伤已可能不再以断裂为主，而主要引起细胞DNA发生交联，由于交联的作用使核DNA泳出受阻，而在核内积聚，不出现彗星现象[4]。可以认为甲醛在低剂量时是以细胞断裂损伤为主，而在高剂量时则引起DNA发生交联。表明甲醛对DNA的损伤与剂量密切相关。乙醛浓度在0.1～1.0mmol/L范围内，乙醛对细胞DNA的损伤表现为彗星细胞出现率呈现逐渐增加趋势，Singh等应用SCGE技术测定不同浓度的乙醛与人血淋巴细胞孵育1h后，当乙醛浓度达1.56mmol/L时，引起DNA单链断裂，100mmol/L时引起DAN双链断裂，当染毒乙醛的细胞孵育一定时间后，由乙醛引起的细胞DNA断裂损伤基本不能被修复[5]。Ristow等应用脉冲场凝胶电泳充分证实乙醛引起细胞染色体DNA以及离体DNA发生断裂[6]。由此表明乙醛引起细胞DNA断裂有可能是乙醛的主要遗传毒性，可以考虑
, 百拇医药
以其作为接触乙醛的效应标志物。丙烯醛对细胞DNA的损伤为诱发细胞发生DNA断裂尤为明显，分析可能与丙烯醛高度的反应活性，含有2个活泼基团，以及其在代谢过程中产生自由基[7]，共同攻击DNA超螺旋结构，引起DNA部分解螺旋而发生断裂。
甲醛、乙醛和丙烯醛联合对小鼠脾淋巴细胞DNA的损伤作用表现为，三者共同作用时，诱导小鼠脾淋巴细胞DNA链的断裂存在一定的协同作用，与其在细胞代谢过程中均可形成自由基，特别是含氧自由基，导致DNA分子发生断裂可能有关[7]。对于丙烯醛与甲醛和丙烯醛与乙醛联合作用时，呈现拮抗效应，还有待于进一步论证。文献报道在香烟烟雾、机动车废气及烹调油烟中均可检测到甲醛、乙醛和丙烯醛[1，2]，因此对于它们的联合作用应予以足够重视。
作者简介：杨丹凤，女，硕士，助理研究员
参考文献
, 百拇医药
1，方家龙，刘玉瑛.乙醛及其毒性.国外医学卫生学分册，1996，23(2)：101—104
2，谢天培.丙烯醛对机体的毒性.国外医学军事医学分册，1989，6：334—336
3，Singh NP,Mccoy MT,Tice RR,et al.A simple technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells. Cell Reas, 1988,175：184—191
4，Shahame J,Bomstein Y,Meltzer A,et al.DNA-protein crosslinks,a biomarker of exposure to formaldehyde-in vitro and in vivo studies.Int Joccup Enviorn Health,1997,13(2):95—104
, 百拇医药
5，Singh NP,Khan A.Acetaldehyde:genotoxity and cytotoxicity in human lymphocyte.Mutat Res,1995,337(1):9—17
6，Ristow H,Seyfarth A,Lochmann ER.Chromosomal damages by ethanol and acetaldehyde in saccharomyces gel electrophoresis.Mut Res,1995,326:165—170
7，Adams JD,Klaidman LK.Acrolein-induced oxygen radical formation.Free rad Biol Med,1993,15:197—198
(1999-07-27收稿), http://www.100md.com
单位：杨丹凤(军事医学科学院卫生学环境医学研究所，天津 300050)；袭著革(军事医学科学院卫生学环境医学研究所，天津 300050)；张华山(军事医学科学院卫生学环境医学研究所，天津 300050)；李官贤(军事医学科学院卫生学环境医学研究所，天津 300050)；梁增辉(军事医学科学院卫生学环境医学研究所，天津 300050)
关键词：甲醛；乙醛；丙烯醛；DNA损伤
卫生研究000111 摘要：应用单细胞凝胶电泳技术(彗星实验)检测了3种典型醛类污染物对小鼠脾淋巴细胞DNA损伤情况。结果发现3种化合物都引起了小鼠脾淋巴细胞产生彗星现象，并且存在一定的剂量-效应关系。表明此3种醛类化合物均可引起细胞DNA发生断裂。
中图分类号：X 512.031 R 730 231.1 文献标识码：A
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文章编号：1000-8020(2000)01-0030-03
Effect of typical aldehyde pollutants on the DNA
damage of spleen lymphocytes of mice
Yang Danfeng,Xi Zhuge,Zhang Huashan,Li Guanxian，et al.
(Institute of Environmental Medicine,Academy of Military Medical Sciences,Tianjin 300050,China)
Abstract：The DNA damage of spleen lymphocytes induced by three typical aldehyde pollutants was studied in vitro with microgel single cell electrophoresis assay (comet assay).It showed that the comet cells induced by the three chemicals were observed,and the dose-dependent relations were existed.It suggested that the three aldehydes could induce DNA strand breakage.
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Key words：formaldehyde,acetaldehyde,acrolein,DNA damage
当前室内空气污染对人类健康的危害是环境与健康科学研究的热点，其中作为挥发性有机化合物之一的醛类化合物由于与人们的生产生活关系非常密切而受到研究者的关注。甲醛、乙醛和丙烯醛不仅来源广泛，而且还具有潜在的致癌性，是最具环境意义的典型醛类污染物。国际癌症研究中心(IARC)已经将甲醛列于2A组，乙醛列于2B组[1]。目前对于甲醛、乙醛和丙烯醛的致癌机制尚不明了，主要集中于对DNA的损伤研究[1，2]。本文主要探讨甲醛、乙醛和丙烯醛对遗传物质DNA的断裂损伤作用，以及三者对DNA的联合损伤作用，以便进一步解释它们的致突致癌机制，并为筛选对接触醛类化合物较为理想的效应生物标志物提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 主要试剂和仪器
, http://www.100md.com
甲醛(36%～38%水溶液)、乙醛(40%水溶液)、丙烯醛均为分析纯；溴乙锭(EB)；正常熔点琼脂糖(NMA)、低熔点琼脂糖(LMA)。可调式电泳仪；电流50～500mA，电压220～1 000V(中国科学院上海生物研究所)；Microlux-11荧光显微镜(日本岛津)。
1.2 方法
1.2.1 细胞处理 选用雌性健康昆明种小鼠，体重25g左右，取小鼠脾脏，按文献制备细胞悬液并悬浮于RPMI1640培养液中至所需浓度，用台盼蓝染色，存活率为95%。将不同量的甲醛、乙醛和丙烯醛与一定量的细胞悬液混匀于总反应体积为5ml的RPMI1640培养液中(细胞数1×105)，置于37℃培养箱孵育30min，取出后测定细胞存活率>95%。
1.2.2 单细胞凝胶电泳(SCGE) 按Singh方法[3]。在磨砂载玻片上铺0.5%正常熔点琼脂糖100μl，作为第一层，常温下凝固后去掉盖玻片，加入1%的低熔点琼脂糖100μl和等量细胞悬液的混悬液作为第二层。置4℃冰箱5min后，去掉盖玻片，铺0.5%低熔点琼脂糖100μl作为第三层。置4℃冰箱5min,去掉盖玻片，置于预冷的细胞裂解液(2.5mmol/L NaCl,100mmol/L Na2EDTA,1%Triton100，1%Sodium Sarcosinate,10% DMSO,100mmol/L Tris,pH=10)4℃中裂解1.5h，裂解后用冷的去离子水小心冲洗，以免凝胶脱落，直至手摸无滑腻感。小心将凝胶并列放入碱性电泳缓冲液(300mmol/L NaOH，1mmol/L Na2EDTA,pH=12)中的阳极端，约覆过凝胶面0.25cm左右，先浸泡40min，以便DNA在碱性条件下解螺旋和产生碱易变性区段，使DNA断链在电场中易于迁移，之后调节电流至350mA，电压为25V，电泳40min。轻轻取出凝胶载玻片，放入冷的Tris-HCl(0.4mmol/L,pH=7.4)缓冲液中，反复中和至中性。将凝胶载玻片放入无水乙醇中浸泡40min,取出后凉干。向载玻片上滴加25μg/ml溴化乙锭50μl，染色20min。用冷的蒸馏水反复冲洗15min。盖上盖玻片，在镜下随机观察计数50个细胞，DNA损伤的细胞出现拖尾现象，尤如彗星。计算彗星细胞发生率(%)：彗星细胞数/50个观察细胞。
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1.3 统计方法
剂量-效应关系用直线相关分析，组间比较用χ2检验。
2 结果
甲醛、乙醛和丙烯醛对小鼠脾淋巴细胞DNA断裂的影响分别见图1、图2和图3。
图1 不同浓度的甲醛对彗星细胞发生率的影响
图2 不同浓度的乙醛对彗星细胞发生率的影响
图3 不同浓度的丙烯醛对彗星细胞发生率的影响
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由图1可见，甲醛引起小鼠脾淋巴细胞彗星细胞的发生率在低浓度时增加后呈缓慢降低的趋势，当甲醛浓度<0.01mmol/L时，彗星细胞数呈现直线上升，而后逐渐减少.
由图2可见，乙醛<1.0mmol/L时，随着乙醛剂量的增加，彗星细胞数呈线性增加，χ2=74.285，P<0.01，进行直线拟合
=0.0741+0.7312X,r=0.9954，P<0.01。由图3可见，随着丙烯醛浓度的增加，彗星细胞出现率呈现快速增加趋势(<0.01mmol/L)，之后逐渐趋于稳定状态(>0.01mmol/L),呈典型的抛物线型曲线，χ2=104.5425，P<0.01。将剂量进行对数变换以后，进行直线拟合
=0.4189lgx+1.3598，r=0.9845，P<0.05。, http://www.100md.com
3种醛类化合物联合对小鼠脾淋巴细胞DNA的损伤作用见附表。
附表 3种醛类化合物联合对小鼠脾淋巴细胞DNA的损伤作用 分组
彗星
细胞数
彗星细胞
出现率(%)
空白
5
10
0.01mmol/L甲醛
6
12
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1mmol/L乙醛
8
16
0.01mmol/L丙烯醛
14
28
0.01mmol/L甲醛+0.1mmol/L乙醛
16
32
0.01mmol/L甲醛+0.01mmol/L丙烯醛
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18
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0.01mmol/L乙醛+0.1mmol/L丙烯醛
19
38
0.01mmol/L甲醛+0.1mmol/L乙醛+0.01mmol/L丙烯醛
48
96
由附表可见甲醛和乙醛共同作用引起淋巴细胞出现彗星细胞现象存在一定的协同作用；乙醛与丙烯醛以及甲醛与丙烯醛共同作用时，小鼠脾淋巴细胞出现的彗星细胞并未见明显增加，甚至有所减少，呈现拮抗作用。而当三者共同作用时，彗星细胞出现率显著增加，几乎所有细胞均出现了彗星现象。
3 讨论
本研究应用单细胞凝胶电泳技术(彗星实验)观察了3种典型醛类化合物对小鼠脾淋巴细胞DNA的损伤作用。实验中发现，当甲醛浓度<0.01mmol/L时，彗星细胞出现率呈现直线上升，而当浓度>0.01mmol/L时彗星细胞出现率逐渐减少，分析甲醛此时对细胞DNA的损伤已可能不再以断裂为主，而主要引起细胞DNA发生交联，由于交联的作用使核DNA泳出受阻，而在核内积聚，不出现彗星现象[4]。可以认为甲醛在低剂量时是以细胞断裂损伤为主，而在高剂量时则引起DNA发生交联。表明甲醛对DNA的损伤与剂量密切相关。乙醛浓度在0.1～1.0mmol/L范围内，乙醛对细胞DNA的损伤表现为彗星细胞出现率呈现逐渐增加趋势，Singh等应用SCGE技术测定不同浓度的乙醛与人血淋巴细胞孵育1h后，当乙醛浓度达1.56mmol/L时，引起DNA单链断裂，100mmol/L时引起DAN双链断裂，当染毒乙醛的细胞孵育一定时间后，由乙醛引起的细胞DNA断裂损伤基本不能被修复[5]。Ristow等应用脉冲场凝胶电泳充分证实乙醛引起细胞染色体DNA以及离体DNA发生断裂[6]。由此表明乙醛引起细胞DNA断裂有可能是乙醛的主要遗传毒性，可以考虑
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以其作为接触乙醛的效应标志物。丙烯醛对细胞DNA的损伤为诱发细胞发生DNA断裂尤为明显，分析可能与丙烯醛高度的反应活性，含有2个活泼基团，以及其在代谢过程中产生自由基[7]，共同攻击DNA超螺旋结构，引起DNA部分解螺旋而发生断裂。
甲醛、乙醛和丙烯醛联合对小鼠脾淋巴细胞DNA的损伤作用表现为，三者共同作用时，诱导小鼠脾淋巴细胞DNA链的断裂存在一定的协同作用，与其在细胞代谢过程中均可形成自由基，特别是含氧自由基，导致DNA分子发生断裂可能有关[7]。对于丙烯醛与甲醛和丙烯醛与乙醛联合作用时，呈现拮抗效应，还有待于进一步论证。文献报道在香烟烟雾、机动车废气及烹调油烟中均可检测到甲醛、乙醛和丙烯醛[1，2]，因此对于它们的联合作用应予以足够重视。
作者简介：杨丹凤，女，硕士，助理研究员
参考文献
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1，方家龙，刘玉瑛.乙醛及其毒性.国外医学卫生学分册，1996，23(2)：101—104
2，谢天培.丙烯醛对机体的毒性.国外医学军事医学分册，1989，6：334—336
3，Singh NP,Mccoy MT,Tice RR,et al.A simple technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells. Cell Reas, 1988,175：184—191
4，Shahame J,Bomstein Y,Meltzer A,et al.DNA-protein crosslinks,a biomarker of exposure to formaldehyde-in vitro and in vivo studies.Int Joccup Enviorn Health,1997,13(2):95—104
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5，Singh NP,Khan A.Acetaldehyde:genotoxity and cytotoxicity in human lymphocyte.Mutat Res,1995,337(1):9—17
6，Ristow H,Seyfarth A,Lochmann ER.Chromosomal damages by ethanol and acetaldehyde in saccharomyces gel electrophoresis.Mut Res,1995,326:165—170
7，Adams JD,Klaidman LK.Acrolein-induced oxygen radical formation.Free rad Biol Med,1993,15:197—198
(1999-07-27收稿), http://www.100md.com