抑制性底物杂交(SSH)技术研究BXSB小鼠的差异表达基因
作者:李 莹 韩文玲 杨高云 宋朱声 张颖妹 狄春辉 邓鸿业 马大龙
单位:北京医科大学免疫学系,北京100083
关键词:系统性红斑狼疮;抑制性底物杂交;BXSB小鼠
中国免疫学杂志991101 中国图书分类号 R392.11
摘 要 目的:利用抑制性底物杂交技术(Suppression subtractive hybridization,SSH),以BXSB狼疮小鼠为模型,研究系统性红斑狼疮(SLE)发病相关基因。方法:分离BXSB和C57-BL-6小鼠骨髓细胞,提取mRNA,反转录构建cDNA文库,利用SSH技术研究BXSB小鼠差异表达基因。结果:获得了12个阳性克隆,其中有3个克隆编码TCR、MHC Ⅱ类分子及逆转录病毒基因表达产物,均在BXSB狼疮小鼠高表达,表明其与系统性红斑狼疮发病有关;1个在BXSB狼疮小鼠高表达的基因可能为新的cDNA片段,已被GenBank收录,登记号码为AF093453。结论:TCR、MHC Ⅱ类分子及逆转录病毒基因表达产物与系统性红斑狼疮发病有关。
, 百拇医药
Isolation of the differentially expressed genes in the BXSB mouse model of systemic lupus erythematosus by SSH(Suppression subtractive hybridization)technique
LI Ying,HAN Wen-Ling,YANG Gao-Yun et al
Department of Immunology,Beijing Medical University,Beijing 100083
Abstract Objective:To isolate the differentially expressed genes in BXSB mouse.Methods:Separated bone marrow cells from the BXSB and C57-BL-6 mice,extracted the polyA+RNA,synthesized the dscDNA by reverse transcription,and identified the differentially expressed genes by SSH technique.Results:Twelve positive genes were isolated,three of them have been reported to be related to SLE,including TCR,MHC Ⅱ and retrovirus gene products.In addition, found one novel gene similar to the TCR gene,submitted it to GenBank,and accepted an accession number AF093453.Conclusion:TCR,MHC Ⅱ molecule and retrovirus gene products may play important role in the development of SLE.At the same time,other molecules may also be related to SLE.
, 百拇医药
Key words Systemic lupus erythematosus Suppression subtractive hybridization BXSB mouse
系统性红斑狼疮(Systemic lupus erythematosus,SLE)是一种侵犯多系统、多器官的自身免疫病。它的发病与遗传、病毒感染、环境等多种因素有关,遗传因素起更重要的作用,但目前对其发病相关基因的研究还比较少。小鼠SLE模型的出现,大大促进了对其发病机理的研究。BXSB小鼠是狼疮小鼠的一种,雄鼠发病早,与人类SLE有相似的免疫学异常和病理表现[1]。过继转移实验表明,BXSB小鼠发病的细胞学基础在于骨髓或脾脏中的造血干细胞,与细胞发育的微环境和体内的激素水平没有关系[2]。细胞转移及Y染色体转移实验表明:BXSB雄鼠Y染色体上的突变基因Yaa基因(Y chromosome-linked autoimmune accelerator)能够加速自身免疫病的发生。但Yaa基因本身并不能使遗传背景正常的小鼠发病,必须依赖于有自身免疫病发病倾向的小鼠体基因发生异常,即系统性红斑狼疮是一种多基因异常所致的遗传病[3]。我们以BXSB小鼠骨髓细胞为Tester,以 C57-BL-6小鼠骨髓细胞为Driver,利用抑制性底物杂交(Suppression subtractive hybridization,SSH)技术[4],探讨SLE发病相关基因。
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1 材料与方法
1.1 动物 BXSB雄鼠购自美国Jackson实验室,由免疫系动物室饲养。C57-BL-6雄鼠,由北京医科大学实验动物部提供。
1.2 细胞制备 取4周龄BXSB和C57-BL-6雄鼠,同时断颈处死,分别无菌取其骨髓,用pH7.2 Tris.NH4Cl溶解红细胞,制备骨髓细胞悬液,计数细胞,调整Tester、Driver细胞数一致,达到1×107ml-1。
1.3 细胞RNA的提取
1.3.1 总RNA的提取 采用GIBCO BRL公司的TRIzolTM 试剂,所用操作按试剂说明书进行。提取的总RNA溶于无RNase的水中,分光光度计(Backmen 640)定量后,用于点杂交。
, 百拇医药
1.3.2 细胞mRNA的提取 采用Pharmacia公司的Quick Prep Micro mRNA Purification kit,操作按试剂盒说明进行。提取的mRNA用于合成双链cDNA。
1.4 合成双链cDNA 采用Clontech公司的PCR-SelectTM cDNA Subtraction kit中的试剂和酶,按说明书操作。模板为上述Driver和Tester的mRNA。
1.5 SSH差异筛选 采用Clontech公司的PCR-SelectTM cDNA Subtraction kit。原理详见参考文献[4]。操作按说明书进行。将扩增产物经处理后连接到pGEM-T Easy载体中,转化XLI-Blue菌,筛选阳性克隆,用PEG沉淀的方法纯化质粒DNA,由皓嘉国际公司代为测序。
1.6 在GenBank中进行序列比较并登记新基因 将测序所得到的序列通过E-mail或http:∥www.ncbi.nlm.nih.gov进行同源性比较,通过GenBank中的www.ncbi.nlm.nih.gov的Bankit功能进行新基因登记。
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1.7 mRNA斑点杂交 将序列分析后显示可能与系统性红斑狼疮有关的基因的cDNA制成标记探针(采用Dupont NEN NEL 803试剂盒);用Tester和Driver的总RNA进行点杂交分析,尼龙膜为Dupont产品,具体方法参照说明书和分子克隆[5]。
2 结果
2.1 SSH结果 如图1所示:可见随着杂交过程的进行,Tester和Driver中共同条带大部分消失,部分条带加强,这些可能是Tester特异表达或高表达的基因。
图1 利用SSH技术研究BXSB小鼠差异表达基因片段的电泳结果
Fig.1 Electrophoretic analysis of result of study on differential expressed gene fragments of BXSB mouse using SSH technique
, 百拇医药
Note:1.DNA molecular weight marker;2.PCR amplification products after cDNA of BXSB mouse was ligated with adapter-1 and adapter-2;3.PCR amplification products after SSH hybridization
2.2 测序和同源性比较结果 将所得序列通过E-mail或www.ncbi.nlm.nih.gov进行同源性分析,结果如表1。
表1 利用SSH技术研究BXSB小鼠差异表达基因
Tab.1 Differential expressed genes of BXSB mouse studied by SSH method Clone
Length of
, http://www.100md.com
DNA
fragment
Homogenecity
(%)
Homogeneous sequence
Result of
hybridization
B1
262
97
Mouse protein with transformation activity
, 百拇医药
NH
SB21)
590
94(408/452)
Mouse T cell receptor α
H
B3
465
99
Mouse T cell receptor β
H
B4
, http://www.100md.com
295
97
Mouse MT transferon
ND
B5
same as B4
ND
B6
296
98
Mouse derma-derived cDNA
ND
, http://www.100md.com
B7
336
99
Mouse KIF protein
NH
B8
260
97
Mouse capsid-protein of reversetranscript virus
H
B9
269
, http://www.100md.com
98
Mouse tyrosine protein kinase
NH
B10
396
98
Mouse MHC IA-α chain
H
B11
321
99
cDNA 3' terminus of mouse DPC blastocyst
, 百拇医药
ND
B12
203
96
Gene of mouse IgG V section
NH
Note:1)new gene;H,high expression;NH,non-high expression;ND,no detection
图2 SB2核酸序列
Fig.2 DNA sequence of SB2
, 百拇医药
图3 狭缝杂交方法分析差异基因克隆B2、B3、B8和B10
Fig.3 Analysis of differential expressed genes B2,B3,B8 and B10 by slot hybridization
其中2号克隆590 bp中452与GenBank中鼠T细胞受体α基因部分区域有较高同源性,但并非完全等同,并且在EST数据库中无高同源性的序列,可认为是新的EST片段。该基因被命名为SB2,在GenBank中申请的登录号为AF093453,序列见图2。
2.3 RNA点杂交结果 通过点杂交的方法检测了8个片段在BXSB和C57-BL-6小鼠骨髓细胞mRNA的表达水平,其中4个为高表达或特异性表达,结果如图3所示。
3 讨论
, 百拇医药
SSH技术是建立在抑制性PCR技术上的一种新的减数杂交方法,能快速得到表达差异基因,对研究自身免疫有重要用途[4],考虑到BXSB小鼠的发病与造血细胞有关,我们以小鼠骨髓细胞为材料,研究了对BXSB小鼠发病可能起作用的基因。我们的结果表明,在BXSB小鼠的骨髓细胞中,有一些已知的与自身免疫病有关的基因是高表达的,如MHC Ⅱ类分子、TCR和逆转录病毒样衣壳蛋白等,同时,我们利用cDNA-RDA技术也发现逆转录病毒样衣壳蛋白在BXSB小鼠骨髓细胞中高表达(待发表资料),其可能的致病机理在于:逆转录病毒基因表达产物与自身细胞成份有相同的抗原决定簇,或者充当超抗原,引起自身免疫应答,导致自身免疫病的发生[6]。
已有实验证明,在NZBXW小鼠中,MHC Ⅱ类分子能促进自身免疫病的发生,且疾病的发生可被抗体所阻断[7]。本实验首次用SSH技术证明了MHC Ⅱ类分子在BXSB小鼠的发病中起一定的作用,影响了T细胞的分化,产生有害的自身反应性T细胞库,最终导致疾病的发生。BXSB小鼠骨髓细胞TCR β 基因表达水平增高。文献报道,NZBXW小鼠在致病性自身抗体的产生过程中需要T细胞的协助[8],在BXSB小鼠中,也存在T细胞表型及功能的异常,是MHC Ⅱ类分子影响T细胞阳性选择的结果,除已知基因外,我们发现另外一个新的与TCR有高度同源性的cDNA片段表达水平明显增加,其生理和病理意义研究是值得探讨的课题。
, 百拇医药
作者简介:李 莹,女,29岁,分子免疫学专业博士;指导教师,马大龙,男,教授,博士生导师,主要研究分子免疫学
4 参考文献
1 Theofilopoulos A N,Dixon F J.Murine models of systemic lupus erythematosus. Adv Immunol, 1985;37:269
2 Kunisuke H,Robert A.Marrow transplantation from tolerant donors to treat and prevent autoimmune diseases in BXSB mice.Proc Natl Acad Sci,1988;85:2235
3 Murphy E D,Roths J B. A Y chromosome-associated factor in strain BXSB producing accelerated autoimmunity and lymphoproliferation.Arthritis Rheum,1979;22(11):1188
, 百拇医药
4 Diatchenko L, Lau Y F,Campbell A P et al.Suppression subtractive hybridization:a method for generating differentially regulated of tissue-specific cDNA probes and libraries.Pro Natl Acad Sci USA,1996;93:6025
5 Sambrook J,Fritsch E F , Maniatis T.Molecular cloning:a laboratory manual.2nd ed.New York:Cold spring harbor laboratory press, 1989:372-373
6 Skigawal I,Ogasawara H,Kaneko H et al.Systemic lupus erythematosus (SLE) and retrovirus.Nippon Rinslho,1997;55(6):1492
, 百拇医药
7 Hirose S,Nagasawa R,Sekikawa R et al.Enhancing effect of H-2-linked NZW gene on the autoimmune traits of (NZBxNZW)F1 mice.J Exp Med,1983;158:228
8 Hirose S,Tokushige K,Nozawa S et al.Contribution of the gene linked to the T cell receptor β chain gene complex of NZW mice to the autoimmunity of(NZBxNZW)F1 mice.Eur J Immunol,1991;21:823
收稿1999-02-09 修回1999-06-21, http://www.100md.com
单位:北京医科大学免疫学系,北京100083
关键词:系统性红斑狼疮;抑制性底物杂交;BXSB小鼠
中国免疫学杂志991101 中国图书分类号 R392.11
摘 要 目的:利用抑制性底物杂交技术(Suppression subtractive hybridization,SSH),以BXSB狼疮小鼠为模型,研究系统性红斑狼疮(SLE)发病相关基因。方法:分离BXSB和C57-BL-6小鼠骨髓细胞,提取mRNA,反转录构建cDNA文库,利用SSH技术研究BXSB小鼠差异表达基因。结果:获得了12个阳性克隆,其中有3个克隆编码TCR、MHC Ⅱ类分子及逆转录病毒基因表达产物,均在BXSB狼疮小鼠高表达,表明其与系统性红斑狼疮发病有关;1个在BXSB狼疮小鼠高表达的基因可能为新的cDNA片段,已被GenBank收录,登记号码为AF093453。结论:TCR、MHC Ⅱ类分子及逆转录病毒基因表达产物与系统性红斑狼疮发病有关。
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Isolation of the differentially expressed genes in the BXSB mouse model of systemic lupus erythematosus by SSH(Suppression subtractive hybridization)technique
LI Ying,HAN Wen-Ling,YANG Gao-Yun et al
Department of Immunology,Beijing Medical University,Beijing 100083
Abstract Objective:To isolate the differentially expressed genes in BXSB mouse.Methods:Separated bone marrow cells from the BXSB and C57-BL-6 mice,extracted the polyA+RNA,synthesized the dscDNA by reverse transcription,and identified the differentially expressed genes by SSH technique.Results:Twelve positive genes were isolated,three of them have been reported to be related to SLE,including TCR,MHC Ⅱ and retrovirus gene products.In addition, found one novel gene similar to the TCR gene,submitted it to GenBank,and accepted an accession number AF093453.Conclusion:TCR,MHC Ⅱ molecule and retrovirus gene products may play important role in the development of SLE.At the same time,other molecules may also be related to SLE.
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Key words Systemic lupus erythematosus Suppression subtractive hybridization BXSB mouse
系统性红斑狼疮(Systemic lupus erythematosus,SLE)是一种侵犯多系统、多器官的自身免疫病。它的发病与遗传、病毒感染、环境等多种因素有关,遗传因素起更重要的作用,但目前对其发病相关基因的研究还比较少。小鼠SLE模型的出现,大大促进了对其发病机理的研究。BXSB小鼠是狼疮小鼠的一种,雄鼠发病早,与人类SLE有相似的免疫学异常和病理表现[1]。过继转移实验表明,BXSB小鼠发病的细胞学基础在于骨髓或脾脏中的造血干细胞,与细胞发育的微环境和体内的激素水平没有关系[2]。细胞转移及Y染色体转移实验表明:BXSB雄鼠Y染色体上的突变基因Yaa基因(Y chromosome-linked autoimmune accelerator)能够加速自身免疫病的发生。但Yaa基因本身并不能使遗传背景正常的小鼠发病,必须依赖于有自身免疫病发病倾向的小鼠体基因发生异常,即系统性红斑狼疮是一种多基因异常所致的遗传病[3]。我们以BXSB小鼠骨髓细胞为Tester,以 C57-BL-6小鼠骨髓细胞为Driver,利用抑制性底物杂交(Suppression subtractive hybridization,SSH)技术[4],探讨SLE发病相关基因。
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1 材料与方法
1.1 动物 BXSB雄鼠购自美国Jackson实验室,由免疫系动物室饲养。C57-BL-6雄鼠,由北京医科大学实验动物部提供。
1.2 细胞制备 取4周龄BXSB和C57-BL-6雄鼠,同时断颈处死,分别无菌取其骨髓,用pH7.2 Tris.NH4Cl溶解红细胞,制备骨髓细胞悬液,计数细胞,调整Tester、Driver细胞数一致,达到1×107ml-1。
1.3 细胞RNA的提取
1.3.1 总RNA的提取 采用GIBCO BRL公司的TRIzolTM 试剂,所用操作按试剂说明书进行。提取的总RNA溶于无RNase的水中,分光光度计(Backmen 640)定量后,用于点杂交。
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1.3.2 细胞mRNA的提取 采用Pharmacia公司的Quick Prep Micro mRNA Purification kit,操作按试剂盒说明进行。提取的mRNA用于合成双链cDNA。
1.4 合成双链cDNA 采用Clontech公司的PCR-SelectTM cDNA Subtraction kit中的试剂和酶,按说明书操作。模板为上述Driver和Tester的mRNA。
1.5 SSH差异筛选 采用Clontech公司的PCR-SelectTM cDNA Subtraction kit。原理详见参考文献[4]。操作按说明书进行。将扩增产物经处理后连接到pGEM-T Easy载体中,转化XLI-Blue菌,筛选阳性克隆,用PEG沉淀的方法纯化质粒DNA,由皓嘉国际公司代为测序。
1.6 在GenBank中进行序列比较并登记新基因 将测序所得到的序列通过E-mail或http:∥www.ncbi.nlm.nih.gov进行同源性比较,通过GenBank中的www.ncbi.nlm.nih.gov的Bankit功能进行新基因登记。
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1.7 mRNA斑点杂交 将序列分析后显示可能与系统性红斑狼疮有关的基因的cDNA制成标记探针(采用Dupont NEN NEL 803试剂盒);用Tester和Driver的总RNA进行点杂交分析,尼龙膜为Dupont产品,具体方法参照说明书和分子克隆[5]。
2 结果
2.1 SSH结果 如图1所示:可见随着杂交过程的进行,Tester和Driver中共同条带大部分消失,部分条带加强,这些可能是Tester特异表达或高表达的基因。
图1 利用SSH技术研究BXSB小鼠差异表达基因片段的电泳结果
Fig.1 Electrophoretic analysis of result of study on differential expressed gene fragments of BXSB mouse using SSH technique
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Note:1.DNA molecular weight marker;2.PCR amplification products after cDNA of BXSB mouse was ligated with adapter-1 and adapter-2;3.PCR amplification products after SSH hybridization
2.2 测序和同源性比较结果 将所得序列通过E-mail或www.ncbi.nlm.nih.gov进行同源性分析,结果如表1。
表1 利用SSH技术研究BXSB小鼠差异表达基因
Tab.1 Differential expressed genes of BXSB mouse studied by SSH method Clone
Length of
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DNA
fragment
Homogenecity
(%)
Homogeneous sequence
Result of
hybridization
B1
262
97
Mouse protein with transformation activity
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NH
SB21)
590
94(408/452)
Mouse T cell receptor α
H
B3
465
99
Mouse T cell receptor β
H
B4
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295
97
Mouse MT transferon
ND
B5
same as B4
ND
B6
296
98
Mouse derma-derived cDNA
ND
, http://www.100md.com
B7
336
99
Mouse KIF protein
NH
B8
260
97
Mouse capsid-protein of reversetranscript virus
H
B9
269
, http://www.100md.com
98
Mouse tyrosine protein kinase
NH
B10
396
98
Mouse MHC IA-α chain
H
B11
321
99
cDNA 3' terminus of mouse DPC blastocyst
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ND
B12
203
96
Gene of mouse IgG V section
NH
Note:1)new gene;H,high expression;NH,non-high expression;ND,no detection
图2 SB2核酸序列
Fig.2 DNA sequence of SB2
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图3 狭缝杂交方法分析差异基因克隆B2、B3、B8和B10
Fig.3 Analysis of differential expressed genes B2,B3,B8 and B10 by slot hybridization
其中2号克隆590 bp中452与GenBank中鼠T细胞受体α基因部分区域有较高同源性,但并非完全等同,并且在EST数据库中无高同源性的序列,可认为是新的EST片段。该基因被命名为SB2,在GenBank中申请的登录号为AF093453,序列见图2。
2.3 RNA点杂交结果 通过点杂交的方法检测了8个片段在BXSB和C57-BL-6小鼠骨髓细胞mRNA的表达水平,其中4个为高表达或特异性表达,结果如图3所示。
3 讨论
, 百拇医药
SSH技术是建立在抑制性PCR技术上的一种新的减数杂交方法,能快速得到表达差异基因,对研究自身免疫有重要用途[4],考虑到BXSB小鼠的发病与造血细胞有关,我们以小鼠骨髓细胞为材料,研究了对BXSB小鼠发病可能起作用的基因。我们的结果表明,在BXSB小鼠的骨髓细胞中,有一些已知的与自身免疫病有关的基因是高表达的,如MHC Ⅱ类分子、TCR和逆转录病毒样衣壳蛋白等,同时,我们利用cDNA-RDA技术也发现逆转录病毒样衣壳蛋白在BXSB小鼠骨髓细胞中高表达(待发表资料),其可能的致病机理在于:逆转录病毒基因表达产物与自身细胞成份有相同的抗原决定簇,或者充当超抗原,引起自身免疫应答,导致自身免疫病的发生[6]。
已有实验证明,在NZBXW小鼠中,MHC Ⅱ类分子能促进自身免疫病的发生,且疾病的发生可被抗体所阻断[7]。本实验首次用SSH技术证明了MHC Ⅱ类分子在BXSB小鼠的发病中起一定的作用,影响了T细胞的分化,产生有害的自身反应性T细胞库,最终导致疾病的发生。BXSB小鼠骨髓细胞TCR β 基因表达水平增高。文献报道,NZBXW小鼠在致病性自身抗体的产生过程中需要T细胞的协助[8],在BXSB小鼠中,也存在T细胞表型及功能的异常,是MHC Ⅱ类分子影响T细胞阳性选择的结果,除已知基因外,我们发现另外一个新的与TCR有高度同源性的cDNA片段表达水平明显增加,其生理和病理意义研究是值得探讨的课题。
, 百拇医药
作者简介:李 莹,女,29岁,分子免疫学专业博士;指导教师,马大龙,男,教授,博士生导师,主要研究分子免疫学
4 参考文献
1 Theofilopoulos A N,Dixon F J.Murine models of systemic lupus erythematosus. Adv Immunol, 1985;37:269
2 Kunisuke H,Robert A.Marrow transplantation from tolerant donors to treat and prevent autoimmune diseases in BXSB mice.Proc Natl Acad Sci,1988;85:2235
3 Murphy E D,Roths J B. A Y chromosome-associated factor in strain BXSB producing accelerated autoimmunity and lymphoproliferation.Arthritis Rheum,1979;22(11):1188
, 百拇医药
4 Diatchenko L, Lau Y F,Campbell A P et al.Suppression subtractive hybridization:a method for generating differentially regulated of tissue-specific cDNA probes and libraries.Pro Natl Acad Sci USA,1996;93:6025
5 Sambrook J,Fritsch E F , Maniatis T.Molecular cloning:a laboratory manual.2nd ed.New York:Cold spring harbor laboratory press, 1989:372-373
6 Skigawal I,Ogasawara H,Kaneko H et al.Systemic lupus erythematosus (SLE) and retrovirus.Nippon Rinslho,1997;55(6):1492
, 百拇医药
7 Hirose S,Nagasawa R,Sekikawa R et al.Enhancing effect of H-2-linked NZW gene on the autoimmune traits of (NZBxNZW)F1 mice.J Exp Med,1983;158:228
8 Hirose S,Tokushige K,Nozawa S et al.Contribution of the gene linked to the T cell receptor β chain gene complex of NZW mice to the autoimmunity of(NZBxNZW)F1 mice.Eur J Immunol,1991;21:823
收稿1999-02-09 修回1999-06-21, http://www.100md.com