中国人肠上皮细胞γ射线损伤的差异表达基因
作者：崔大祥 曾桂英 闫小君 任东青 王 枫 赵 涛 田芙蓉 苏成芝
单位：崔大祥 闫小君 王枫 苏成芝 中国人民解放军第四军医大学全军基因诊断技术研究所；曾桂英 任东青 赵涛 田芙蓉 防原教研室 陕西省西安市 710033
关键词：γ射线；肠上皮细胞；mRNA；基因表达
世界华人消化杂志990930 中国图书馆分类号 R 573.1
Subject headings intestinal epithelium cell; mRNA；γ ray; gene expression
小肠是电离辐射的敏感组织. γ射线照射后小肠上皮干细胞的损伤，肠道组织形态和生理功能改变的文献报道较多[1]，但肠道辐射损伤分子机制的研究尚未见报道. 我们采用mRNA差异展示技术，分离正常的和经60Coγ射线照射的人肠上皮细胞株HIEC细胞的差异表达基因，拟从分子水平探讨电离辐射对人肠上皮细胞损伤的分子机制，为建立辐射损伤的分子诊断标准打下基础.
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1 材料和方法
1.1 材料 ①正常人肠上皮细胞株HIEC由Paterson肿瘤研究所Potten教授馈送. ②mRNA提取试剂盒、PCR产物纯化试剂盒皆购自Promega公司，丙烯酰胺、双丙烯酰胺、尿素、Tris碱、EDTA皆购自华美公司. ③α-32p dATP购自北京福瑞公司，PCR试剂系本所提供. ④差示PCR引物采用GenHunter公司1996-04提供的序列，Venderbilt大学卜昕博士提供. 5’端引物为8条，3’端引物为3条，它们的序列为：
H-AP1：5’-AAGCTTGATTGCC-3’，H-AP2：5’-AAGCTTCGACTGT-3’
H-AP3：5’-AAGCTTTGCTCAG-3’，H-AP4：5’-AAGCTTCTCAACG-3’
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H-AP5 5’-AAGCTTAGTAGGC-3’，H-AP6：5’-AAGCTTGCACCAT-3’
H-AP7 5’-AAGCTTAACGAGG-3’，H-AP8：5’-AAGCTTTTACCGC-3’
H-T11G：5’-AAGCTTTTTTTTTTTG-3’，H-T11A：5’-AAGCTTTTTTTTTTTA-3’
H-T11C：5’-AAGCTTTTTTTTTTTC-3’
1.2 方法 ①常规培养人肠上皮细胞株HIEC，取对数生长期细胞，调整浓度为1×109/ L，分照射组和对照组(不照射)，照射条件为γ射线照射剂量率0.2432C.Kg-1.min-1，培养瓶距离源中心70 cm，受照剂量为8Gy，照射后继续培养24 h. ②采用异硫氰酸胍一步法分离细胞株总RNA，用无RNase的DNase去除其中的DNA，紫外扫描定量后稀释成0.1 g/ L，于-80℃保存. ③mRNA反转录、PCR扩增、测序胶电泳、差异条带的确认、差异条带的回收及差异条带的二次扩增按文献[2]进行. ④用纯化试剂盒按说明书纯化PCR产物. ⑤采用末端标记法在PCR产物末端标记上γ-32P dATP作探针，对HIEC细胞株总RNA进行打点杂交[3]. ⑥对纯化的二次扩增产物克隆入T载体，同时进行全自动测序. ⑦对测序结果进行GenBank同源性检索，确认为新序列后，递交给GenBank.
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2 结果
2.1 照射组与对照组之间DD-PCR测序胶电泳部分结果 扫描获得差异条带共101条，31个为新表达的差异片段， 29个为高表达的差异片段，41个为要表达的差异片段；其中10个片段属于D-T11G组，59个片段属于D-T11A组，31个片段属于D-T11C组(图1).
图1 细胞株HIEC与照射后HIEC之间差示PCR部分结果.
1，3，5，7，9，11，13，15为D-TllG为锚定引物与AP1-AP4的未照射的细胞株PCR产物；2，4，6，8，10，12，14，16为D-TllG为锚定引物与AP1-AP4的照射后细胞株PCR产物.
2.2 打点杂交结果 从新表达的差异片段中挑取了5个作探针，进行RNA打点杂交，证实这些片段在照射前后的肠腺细胞株中呈差异表达(图2).
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图2 部分打点杂交结果.
上排为与照射后的细胞株总RNA杂交结果，下排为与未照射的细胞株总RNA杂交结果.
2.3 载体克隆结果 31个新表达的差异片段、29个为高表达的差异片段，41个为要表达的差异片段皆被克隆入T载体.
2.4 部分片段测序结果 已完成30个片段的序列分析，其中12个是新序列，编号为NCO1～NCO12.
3 讨论
消化道是电离辐射敏感组织，其中尤以小肠最为敏感. 多年来，国内外对电离辐射照射后肠上皮干细胞的损伤，肠道的组织形态和消化吸收功能的改变作了较多的研究[1，4]，但是怎样促进损伤肠上皮的恢复，至今尚无有效措施，对肠道辐射损伤的治疗仍停留于对症综合治疗. 因此，若从分子水平阐明肠道辐射损伤的机制，就可能会给肠道辐射损伤的治疗带来新的突破.
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本实验以人正常人肠上皮HIEC细胞株为研究对象，采用DDRT-PCR技术，分离出与辐射损伤相关的差异表达条带共101条，31个为新表达的差异片段，29个为高表达的差异片段，41个为要表达的差异片段；其中10个片段属于D-T11G组，59个片段属于D-T11A组，31个片段属于D-T11C组. 通过对这些基因片段的进一步分析，就可能筛选出与辐射紧密相关的特异性表达基因. 本研究结果表明：核辐射照射后出现了31个新表达基因，29个高表达基因，41个表达减弱或消失但在正常细胞表达，这些基因与辐射密切有关. 如果我们阐明这些基因结构与功能，针对这些基因变化，设计调控措施，让他们恢复到正常状态，就完全有可能把电离辐射对胃肠道的损伤减低到最小程度，减轻肿瘤放疗的并发症，提高治疗效果.
总之，本研究为进一步揭开电离辐射对胃肠细胞损伤的分子机制奠定了基础.
注：此课题获“211”工程专项重点课题经费资助 No.98X207.
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通讯作者 崔大祥
4 参考文献
1 Potten CS, Hendry JH. Radiation and Gut. Dlsevier Science B.V, 1995:1-307
2 Cui DX, Yan XJ, Su CZ. Differentially expressed genes in GC7901 or GES-1 were isolated by optimized differential display and primary clinical significance. Disi Junyi Daxue Xuebao, 1998;19:601-605
3 Cui DX, Fang QY, Yan XJ, Su CZ. Alteration of c-myc in skeletalmuscular tumors and prognostic significance. Disi Junyi Daxue Xuebao, 1997;18:310-312
收稿日期 1999-05-25 修回日期 1999-07-24, http://www.100md.com
单位：崔大祥 闫小君 王枫 苏成芝 中国人民解放军第四军医大学全军基因诊断技术研究所；曾桂英 任东青 赵涛 田芙蓉 防原教研室 陕西省西安市 710033
关键词：γ射线；肠上皮细胞；mRNA；基因表达
世界华人消化杂志990930 中国图书馆分类号 R 573.1
Subject headings intestinal epithelium cell; mRNA；γ ray; gene expression
小肠是电离辐射的敏感组织. γ射线照射后小肠上皮干细胞的损伤，肠道组织形态和生理功能改变的文献报道较多[1]，但肠道辐射损伤分子机制的研究尚未见报道. 我们采用mRNA差异展示技术，分离正常的和经60Coγ射线照射的人肠上皮细胞株HIEC细胞的差异表达基因，拟从分子水平探讨电离辐射对人肠上皮细胞损伤的分子机制，为建立辐射损伤的分子诊断标准打下基础.
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1 材料和方法
1.1 材料 ①正常人肠上皮细胞株HIEC由Paterson肿瘤研究所Potten教授馈送. ②mRNA提取试剂盒、PCR产物纯化试剂盒皆购自Promega公司，丙烯酰胺、双丙烯酰胺、尿素、Tris碱、EDTA皆购自华美公司. ③α-32p dATP购自北京福瑞公司，PCR试剂系本所提供. ④差示PCR引物采用GenHunter公司1996-04提供的序列，Venderbilt大学卜昕博士提供. 5’端引物为8条，3’端引物为3条，它们的序列为：
H-AP1：5’-AAGCTTGATTGCC-3’，H-AP2：5’-AAGCTTCGACTGT-3’
H-AP3：5’-AAGCTTTGCTCAG-3’，H-AP4：5’-AAGCTTCTCAACG-3’
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H-AP5 5’-AAGCTTAGTAGGC-3’，H-AP6：5’-AAGCTTGCACCAT-3’
H-AP7 5’-AAGCTTAACGAGG-3’，H-AP8：5’-AAGCTTTTACCGC-3’
H-T11G：5’-AAGCTTTTTTTTTTTG-3’，H-T11A：5’-AAGCTTTTTTTTTTTA-3’
H-T11C：5’-AAGCTTTTTTTTTTTC-3’
1.2 方法 ①常规培养人肠上皮细胞株HIEC，取对数生长期细胞，调整浓度为1×109/ L，分照射组和对照组(不照射)，照射条件为γ射线照射剂量率0.2432C.Kg-1.min-1，培养瓶距离源中心70 cm，受照剂量为8Gy，照射后继续培养24 h. ②采用异硫氰酸胍一步法分离细胞株总RNA，用无RNase的DNase去除其中的DNA，紫外扫描定量后稀释成0.1 g/ L，于-80℃保存. ③mRNA反转录、PCR扩增、测序胶电泳、差异条带的确认、差异条带的回收及差异条带的二次扩增按文献[2]进行. ④用纯化试剂盒按说明书纯化PCR产物. ⑤采用末端标记法在PCR产物末端标记上γ-32P dATP作探针，对HIEC细胞株总RNA进行打点杂交[3]. ⑥对纯化的二次扩增产物克隆入T载体，同时进行全自动测序. ⑦对测序结果进行GenBank同源性检索，确认为新序列后，递交给GenBank.
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2 结果
2.1 照射组与对照组之间DD-PCR测序胶电泳部分结果 扫描获得差异条带共101条，31个为新表达的差异片段， 29个为高表达的差异片段，41个为要表达的差异片段；其中10个片段属于D-T11G组，59个片段属于D-T11A组，31个片段属于D-T11C组(图1).
图1 细胞株HIEC与照射后HIEC之间差示PCR部分结果.
1，3，5，7，9，11，13，15为D-TllG为锚定引物与AP1-AP4的未照射的细胞株PCR产物；2，4，6，8，10，12，14，16为D-TllG为锚定引物与AP1-AP4的照射后细胞株PCR产物.
2.2 打点杂交结果 从新表达的差异片段中挑取了5个作探针，进行RNA打点杂交，证实这些片段在照射前后的肠腺细胞株中呈差异表达(图2).
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图2 部分打点杂交结果.
上排为与照射后的细胞株总RNA杂交结果，下排为与未照射的细胞株总RNA杂交结果.
2.3 载体克隆结果 31个新表达的差异片段、29个为高表达的差异片段，41个为要表达的差异片段皆被克隆入T载体.
2.4 部分片段测序结果 已完成30个片段的序列分析，其中12个是新序列，编号为NCO1～NCO12.
3 讨论
消化道是电离辐射敏感组织，其中尤以小肠最为敏感. 多年来，国内外对电离辐射照射后肠上皮干细胞的损伤，肠道的组织形态和消化吸收功能的改变作了较多的研究[1，4]，但是怎样促进损伤肠上皮的恢复，至今尚无有效措施，对肠道辐射损伤的治疗仍停留于对症综合治疗. 因此，若从分子水平阐明肠道辐射损伤的机制，就可能会给肠道辐射损伤的治疗带来新的突破.
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本实验以人正常人肠上皮HIEC细胞株为研究对象，采用DDRT-PCR技术，分离出与辐射损伤相关的差异表达条带共101条，31个为新表达的差异片段，29个为高表达的差异片段，41个为要表达的差异片段；其中10个片段属于D-T11G组，59个片段属于D-T11A组，31个片段属于D-T11C组. 通过对这些基因片段的进一步分析，就可能筛选出与辐射紧密相关的特异性表达基因. 本研究结果表明：核辐射照射后出现了31个新表达基因，29个高表达基因，41个表达减弱或消失但在正常细胞表达，这些基因与辐射密切有关. 如果我们阐明这些基因结构与功能，针对这些基因变化，设计调控措施，让他们恢复到正常状态，就完全有可能把电离辐射对胃肠道的损伤减低到最小程度，减轻肿瘤放疗的并发症，提高治疗效果.
总之，本研究为进一步揭开电离辐射对胃肠细胞损伤的分子机制奠定了基础.
注：此课题获“211”工程专项重点课题经费资助 No.98X207.
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通讯作者 崔大祥
4 参考文献
1 Potten CS, Hendry JH. Radiation and Gut. Dlsevier Science B.V, 1995:1-307
2 Cui DX, Yan XJ, Su CZ. Differentially expressed genes in GC7901 or GES-1 were isolated by optimized differential display and primary clinical significance. Disi Junyi Daxue Xuebao, 1998;19:601-605
3 Cui DX, Fang QY, Yan XJ, Su CZ. Alteration of c-myc in skeletalmuscular tumors and prognostic significance. Disi Junyi Daxue Xuebao, 1997;18:310-312
收稿日期 1999-05-25 修回日期 1999-07-24, http://www.100md.com