系统性红斑狼疮患者肿瘤坏死因子与HLA-DR基因关联的研究
作者：彭学标 费虹明 徐文严
单位：第一军医大学南方医院皮肤科，广州 510515
关键词：系统性红斑狼疮(SLE)；肿瘤坏死因子(TNF)；HLA-DR
中国免疫学杂志990313 中国图书分类号 R593.24
摘 要 目的：探讨系统性红斑狼疮(SLE)的发病机理和遗传基础。方法：用聚合酶链反应结合顺序特异的寡核苷酸(PCR/SSO)探针杂交方法对71例汉族SLE患者和69例正常对照组HLA-DR亚区作DNA分型，同时用双抗体夹心ELISA法检测血清中TNFα水平。结果：发现汉族SLE患者中DR2频率显著高于正常对照组，而DR4频率则明显低于正常对照组，活动期SLE患者血清TNFα水平明显高于非活动期SLE患者和正常对照组，而非活动期SLE患者和正常对照组血清TNFα水平无明显差异。DR2阳性的SLE患者TNFα水平低，而DR4阳性的SLE患者TNFα水平则较高。结论：TNFα可能通过HLA-Ⅱ类基因或其单倍型在SLE的发病中起重要作用。
, http://www.100md.com
Study on the association between HLA-DR and Tumor Necrosis Factor genes in the patients with Systemic Lupus Erythematosus
PENG Xue-Biao,FEI Hong-Ming,XU Wen-Yan.
Department of Dermatology,Nanfang Hospital,The First Military University,Guangzhou 510515
Abstract Objective：Study the pathogenesis and the genetic background of Systemic Lupus Erythematosus(SLE).Methods：To use polymerase chain reaction and sequence specific oligoncleotide(PCR/SSO) probe hybridization for typing HLA-DR subregion in 71 cases of patients with SLE of Han nationality and 69 cases of matched controls.At the same time,used ELISA of sandwich with two antibodies to examine Tumor Necrosis Factor-α(TNFα)in sera.Results:DR2 gene occured more frequent in patients than that of in controls,whereas DR4 gene occured less frequent in patients,compared with that of controls.TNFα level was much higher in the serum of SLE patients in the active stage than that of the patients and of that in the inactive stage and controls,but there was no difference between the latter.The level of TNFα was low in the patients with DR2 gene,but high in the with DR4 gene.Conclusion:Certain association of HLA-DR and TNF genes might be related in the pathogenesis of SLE.
, 百拇医药
Key words Systemic Lupus Erythematosus(SLE) Tumor Necrosis Factor(TNF) HLA-DR
肿瘤坏死因子(TNF)是体内具有多种生物活性的细胞因子，有抗肿瘤、抗病毒感染及免疫调节作用。在体外，TNFα可以诱导胰腺β细胞异常表达高密度MHC Ⅱ类分子，提示TNFα可能参与诱发自身免疫反应。系统性红斑狼疮(SLE)是原因不明的自身免疫性疾病，研究表明SLE的易感基因可能位于或靠近HLA-DR位点[1]。我们从分子遗传学角度探讨SLE患者TNFα的产生与HLA-DR基因的关联。
1 材料与方法
1.1 研究对象 江苏籍汉族SLE患者71例，均符合美国风湿病学会1982 年修订的诊断标准。71例患者按Chubidx标准划分为活动期与非活动期[2]，其中活动期40例，非活动期31例。正常对照组为同一地区的健康随机人群，共69例，年龄性别相当。
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1.2 TNFα的检测 用ELISA双抗体夹心法，军事医学科学院生产的TNFα检测试剂盒，按说明操作。
1.3 DNA的制备 采患者和对照组外周血5～10 ml，分离白细胞，改良盐析法抽提基因组DNA[3]。
1.4 PCR扩增 扩增引物由第11届国际组织相容性抗原会议(IHWC)提供，序列为DRB AMPA:CCCC-
ACAGCACGTTTCTTG，AMP-B:CCGCTGCACTGTGAAG-
CTCT，它们引导扩增HLA-DR基因的第二外显子长度为274 bp的核苷酸序列，在DNA自动热循环仪(Perkin Elmer)上进行35个循环，扩增条件参考第11届IHWC的DNA component。
1.5 斑点杂交 3 μl扩增产物点到尼龙膜(Hybond Amersham,英国)上，经变性后烘干，SSO探针的核苷酸序列集中在HLA-DR基因的3个超变区，计有22个， 探针用r-32P-dATP末端标记法进行标记。杂交及洗膜条件均参考第11届IHWC的DNA component。放射自显影1 h至过夜。
, 百拇医药
1.6 统计学分析 用χ2检验或Fisher精确法分析患者组和对照组DR的基因频率，P值均用Bonferroni法进行矫正，得矫正P值(Pc)，即P值乘以实验系统所检出的基因数，相对危险度(RR)用Woolf法计算。用配对资料的t检验分析患者组和对照组TNFα含量，显著性检验水平为0.05。
2 结果
2.1 SLE患者与正常对照组血清TNFα水平比较 活动期SLE患者血清TNFα水平(482.33±125.36)明显高于非活动期SLE患者(303.07±98.25)和正常对照组(258.13±94.04)，P<0.01，而非活动期SLE患者和正常对照组血清TNFα水平无明显差异，P>0.05。
2.2 SLE患者与正常对照组HLA-DR基因频率比较 与正常对照组相比，患者组中DR2基因频率(0.273∶0.131，χ2=10.02，RR=3.33，Pc=0.002 4)显著升高，而DR4频率(0.049:0.159，χ2=9.04，RR=0.24，Pc=0.012 6)则明显降低。
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2.3 SLE患者中HLA-DR基因与TNFα含量的关系 将SLE患者分为DR2(+)DR4(-)，DR2(+)DR4(+)，DR2(-)DR4(+)3组，DR2(-)DR4(+)组TNFα含量(523.07±147.25，n=5)显著高于DR2(+)DR4(-)组(312.46±98.15，n=15)及正常对照组(258.13±94.04，n=69),P<0.05，而DR2(+)DR4(-)组、DR2(+)DR4(+)(398.24±110.42，n=3)与正常对照组间均无显著差异，P>0.05。
3 讨论
江苏汉族SLE患者DR2基因频率明显高于正常对照组，而DR4则明显低于正常对照组，与贺为东和孔繁华等对北方SLE患者的研究结果相似[4，5]，表明中国汉族SLE患者均与HLA-DR2相关，DR4则可能对SLE发病有一定的保护性。
TNF基因位于HLA复合体中，处于HLA-B和HLA-C2之间，由TNFA和TNFB组成，分别编码TNFα和TNFβ。TNF基因在MHC中的位置使人们推测，TNF基因在MHC连锁的疾病特别是自身免疫性疾病中起某种作用[6]。与白种人SLE相关的单倍型HLA-A1B8C4AQ0C4B1DR3中带有TNF Nco I 5.5 kb的片段[7]，具有HLA-A1B8DR3单倍型的细胞培养上清液中TNFα的活性比不带这种单倍型的要高，SLE异常扩增的T细胞亚群能检出高水平的TNFα mRNA，SLE患者血清TNF受体水平明显高于正常对照，且随病情活动而升高，二者呈正相关。在(NZB×NZW)F1代鼠，TNFα的RFLP与其低分泌量明显相关，用重组TNFα治疗可以延缓肾炎的发生，改善生存率，可见TNFα参与诱发自身免疫反应。我们的研究发现活动期SLE患者中TNFα水平明显高于非活动期SLE患者和正常对照组，且DR2阳性的SLE患者TNFα水平低，而DR4阳性的SLE患者TNFα水平则较高，表明TNFα可能通过HLA Ⅱ类基因或单倍型在SLE的发病中起重要作用。现有人提出这样的假设，SLE患者体内B细胞高度活化，可能是由于单核巨噬细胞表面MHC Ⅱ类抗原的异常表达，使自身抗原提呈异常，并释放TNFα等多种细胞因子，通过因子间的协同作用，触发对自身抗原的免疫反应，产生大量的自身抗体并形成免疫复合物，引起组织损伤。
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费虹明 上海第二医科大学生物学教研室，上海200025
徐文严 中国医学科学院皮肤病研究所，北京100730
作者简介：彭学标，男，30岁，博士，主要从事SLE的分子遗传学研究
4 参考文献
1 Doherty D G,Robin I, Demaine A G et al. Major histocompability complex genes and susceptibility to systemic lupus erythematosus in southern Chinese. Arthritis Rheum,1992；35:641
2 Chubick A. An appraisal of tests for native DNA antibodies in connective tissue disease: Clinical usefulness of Crithisia luciliate assay. Ann Intern Med,1978;89:186
, http://www.100md.com
3 Miller S A,Dykes D D,Polesky H F et al.A simple salting out procedure for extracting DNA from human nucleated cells.Nucleic Acid Research,1988；16:1215
4 贺为东,宋芳吉,杨茨颖 et al.SLE与HLA抗原.中华皮肤科杂志,1989；22(6):402
5 孔繁华,施桂英,叶根耀 et al.SLE与HLA相关研究.上海免疫学杂志,1992；12(1):50
6 杨志章.自身免疫病中肿瘤坏死因子的遗传多态性.国外医学*免疫学分册,1995；18(6):309
7 Jacob C O,McDevitt H O.Tumour necrosis factor-α in nurine autoimmune lupus nephritis.Nature,1988；331(6154):356
〔收稿1997-06-07 修回1997-10-08〕, http://www.100md.com
单位：第一军医大学南方医院皮肤科，广州 510515
关键词：系统性红斑狼疮(SLE)；肿瘤坏死因子(TNF)；HLA-DR
中国免疫学杂志990313 中国图书分类号 R593.24
摘 要 目的：探讨系统性红斑狼疮(SLE)的发病机理和遗传基础。方法：用聚合酶链反应结合顺序特异的寡核苷酸(PCR/SSO)探针杂交方法对71例汉族SLE患者和69例正常对照组HLA-DR亚区作DNA分型，同时用双抗体夹心ELISA法检测血清中TNFα水平。结果：发现汉族SLE患者中DR2频率显著高于正常对照组，而DR4频率则明显低于正常对照组，活动期SLE患者血清TNFα水平明显高于非活动期SLE患者和正常对照组，而非活动期SLE患者和正常对照组血清TNFα水平无明显差异。DR2阳性的SLE患者TNFα水平低，而DR4阳性的SLE患者TNFα水平则较高。结论：TNFα可能通过HLA-Ⅱ类基因或其单倍型在SLE的发病中起重要作用。
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Study on the association between HLA-DR and Tumor Necrosis Factor genes in the patients with Systemic Lupus Erythematosus
PENG Xue-Biao,FEI Hong-Ming,XU Wen-Yan.
Department of Dermatology,Nanfang Hospital,The First Military University,Guangzhou 510515
Abstract Objective：Study the pathogenesis and the genetic background of Systemic Lupus Erythematosus(SLE).Methods：To use polymerase chain reaction and sequence specific oligoncleotide(PCR/SSO) probe hybridization for typing HLA-DR subregion in 71 cases of patients with SLE of Han nationality and 69 cases of matched controls.At the same time,used ELISA of sandwich with two antibodies to examine Tumor Necrosis Factor-α(TNFα)in sera.Results:DR2 gene occured more frequent in patients than that of in controls,whereas DR4 gene occured less frequent in patients,compared with that of controls.TNFα level was much higher in the serum of SLE patients in the active stage than that of the patients and of that in the inactive stage and controls,but there was no difference between the latter.The level of TNFα was low in the patients with DR2 gene,but high in the with DR4 gene.Conclusion:Certain association of HLA-DR and TNF genes might be related in the pathogenesis of SLE.
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Key words Systemic Lupus Erythematosus(SLE) Tumor Necrosis Factor(TNF) HLA-DR
肿瘤坏死因子(TNF)是体内具有多种生物活性的细胞因子，有抗肿瘤、抗病毒感染及免疫调节作用。在体外，TNFα可以诱导胰腺β细胞异常表达高密度MHC Ⅱ类分子，提示TNFα可能参与诱发自身免疫反应。系统性红斑狼疮(SLE)是原因不明的自身免疫性疾病，研究表明SLE的易感基因可能位于或靠近HLA-DR位点[1]。我们从分子遗传学角度探讨SLE患者TNFα的产生与HLA-DR基因的关联。
1 材料与方法
1.1 研究对象 江苏籍汉族SLE患者71例，均符合美国风湿病学会1982 年修订的诊断标准。71例患者按Chubidx标准划分为活动期与非活动期[2]，其中活动期40例，非活动期31例。正常对照组为同一地区的健康随机人群，共69例，年龄性别相当。
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1.2 TNFα的检测 用ELISA双抗体夹心法，军事医学科学院生产的TNFα检测试剂盒，按说明操作。
1.3 DNA的制备 采患者和对照组外周血5～10 ml，分离白细胞，改良盐析法抽提基因组DNA[3]。
1.4 PCR扩增 扩增引物由第11届国际组织相容性抗原会议(IHWC)提供，序列为DRB AMPA:CCCC-
ACAGCACGTTTCTTG，AMP-B:CCGCTGCACTGTGAAG-
CTCT，它们引导扩增HLA-DR基因的第二外显子长度为274 bp的核苷酸序列，在DNA自动热循环仪(Perkin Elmer)上进行35个循环，扩增条件参考第11届IHWC的DNA component。
1.5 斑点杂交 3 μl扩增产物点到尼龙膜(Hybond Amersham,英国)上，经变性后烘干，SSO探针的核苷酸序列集中在HLA-DR基因的3个超变区，计有22个， 探针用r-32P-dATP末端标记法进行标记。杂交及洗膜条件均参考第11届IHWC的DNA component。放射自显影1 h至过夜。
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1.6 统计学分析 用χ2检验或Fisher精确法分析患者组和对照组DR的基因频率，P值均用Bonferroni法进行矫正，得矫正P值(Pc)，即P值乘以实验系统所检出的基因数，相对危险度(RR)用Woolf法计算。用配对资料的t检验分析患者组和对照组TNFα含量，显著性检验水平为0.05。
2 结果
2.1 SLE患者与正常对照组血清TNFα水平比较 活动期SLE患者血清TNFα水平(482.33±125.36)明显高于非活动期SLE患者(303.07±98.25)和正常对照组(258.13±94.04)，P<0.01，而非活动期SLE患者和正常对照组血清TNFα水平无明显差异，P>0.05。
2.2 SLE患者与正常对照组HLA-DR基因频率比较 与正常对照组相比，患者组中DR2基因频率(0.273∶0.131，χ2=10.02，RR=3.33，Pc=0.002 4)显著升高，而DR4频率(0.049:0.159，χ2=9.04，RR=0.24，Pc=0.012 6)则明显降低。
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2.3 SLE患者中HLA-DR基因与TNFα含量的关系 将SLE患者分为DR2(+)DR4(-)，DR2(+)DR4(+)，DR2(-)DR4(+)3组，DR2(-)DR4(+)组TNFα含量(523.07±147.25，n=5)显著高于DR2(+)DR4(-)组(312.46±98.15，n=15)及正常对照组(258.13±94.04，n=69),P<0.05，而DR2(+)DR4(-)组、DR2(+)DR4(+)(398.24±110.42，n=3)与正常对照组间均无显著差异，P>0.05。
3 讨论
江苏汉族SLE患者DR2基因频率明显高于正常对照组，而DR4则明显低于正常对照组，与贺为东和孔繁华等对北方SLE患者的研究结果相似[4，5]，表明中国汉族SLE患者均与HLA-DR2相关，DR4则可能对SLE发病有一定的保护性。
TNF基因位于HLA复合体中，处于HLA-B和HLA-C2之间，由TNFA和TNFB组成，分别编码TNFα和TNFβ。TNF基因在MHC中的位置使人们推测，TNF基因在MHC连锁的疾病特别是自身免疫性疾病中起某种作用[6]。与白种人SLE相关的单倍型HLA-A1B8C4AQ0C4B1DR3中带有TNF Nco I 5.5 kb的片段[7]，具有HLA-A1B8DR3单倍型的细胞培养上清液中TNFα的活性比不带这种单倍型的要高，SLE异常扩增的T细胞亚群能检出高水平的TNFα mRNA，SLE患者血清TNF受体水平明显高于正常对照，且随病情活动而升高，二者呈正相关。在(NZB×NZW)F1代鼠，TNFα的RFLP与其低分泌量明显相关，用重组TNFα治疗可以延缓肾炎的发生，改善生存率，可见TNFα参与诱发自身免疫反应。我们的研究发现活动期SLE患者中TNFα水平明显高于非活动期SLE患者和正常对照组，且DR2阳性的SLE患者TNFα水平低，而DR4阳性的SLE患者TNFα水平则较高，表明TNFα可能通过HLA Ⅱ类基因或单倍型在SLE的发病中起重要作用。现有人提出这样的假设，SLE患者体内B细胞高度活化，可能是由于单核巨噬细胞表面MHC Ⅱ类抗原的异常表达，使自身抗原提呈异常，并释放TNFα等多种细胞因子，通过因子间的协同作用，触发对自身抗原的免疫反应，产生大量的自身抗体并形成免疫复合物，引起组织损伤。
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费虹明 上海第二医科大学生物学教研室，上海200025
徐文严 中国医学科学院皮肤病研究所，北京100730
作者简介：彭学标，男，30岁，博士，主要从事SLE的分子遗传学研究
4 参考文献
1 Doherty D G,Robin I, Demaine A G et al. Major histocompability complex genes and susceptibility to systemic lupus erythematosus in southern Chinese. Arthritis Rheum,1992；35:641
2 Chubick A. An appraisal of tests for native DNA antibodies in connective tissue disease: Clinical usefulness of Crithisia luciliate assay. Ann Intern Med,1978;89:186
, http://www.100md.com
3 Miller S A,Dykes D D,Polesky H F et al.A simple salting out procedure for extracting DNA from human nucleated cells.Nucleic Acid Research,1988；16:1215
4 贺为东,宋芳吉,杨茨颖 et al.SLE与HLA抗原.中华皮肤科杂志,1989；22(6):402
5 孔繁华,施桂英,叶根耀 et al.SLE与HLA相关研究.上海免疫学杂志,1992；12(1):50
6 杨志章.自身免疫病中肿瘤坏死因子的遗传多态性.国外医学*免疫学分册,1995；18(6):309
7 Jacob C O,McDevitt H O.Tumour necrosis factor-α in nurine autoimmune lupus nephritis.Nature,1988；331(6154):356
〔收稿1997-06-07 修回1997-10-08〕, http://www.100md.com