粪便中戊型肝炎病毒散发株的核酸序列分析
作者：魏绍静 Peter Walsh 唐漾波 董惠卿 蔡晓莉
单位：510060 广州市传染病医院(魏绍静、唐漾波、董惠卿、蔡晓莉)；香港理工大学(Petet Walsh)
关键词：戊型肝炎病毒RNA；核酸序列分析
中华传染病杂980208 【摘要】 目的 了解粪便中戊型肝炎病毒(HEV)散发株的核酸序列变异情况。方法 用逆转录-套式-聚合酶链反应(RT-Nested-PCR)检测了8例广州地区散发性戊型肝炎患者粪便中的HEV RNA，3例阳性。对阳性PCR产物的238个碱基进行了基因克隆和核酸序列分析，并与已报道的HEV序列进行比较。结果 本地区3株HEV与缅甸株(B)、巴基斯坦株(P)、墨西哥株(M)、中国新疆株(Ch1.1)和广州血清株(G-9)的核苷酸和氨基酸的同源性均值分别为80.67%和88.60(B)、81.25%和89.20%(P)、77.45%和84.81%(M)、81.25%和89.20%(C)、97.85%和96.20%(G)。结论 本组3株HEV有一定程度的变异。
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Nucleic acid sequence analysis of the sporadic hepatitis E virus strains isolated from stool samples
Wei Shaojing, Peter Walsh, Tang Yangbo, et al. Institute of Infectious Diseases, Guangzhou Infectious Diseases Hospital, Guangzhou 510060
【Abstract】 Objective In order to investigate the genomutation of sporadic HEV strains we analyzed the nucleotide sequence of sporadic HEV strains in Guangzhou.Methods RT-Nested PCR was used to determinate HEV RNA in stool samples from 8 patients with sporadic hepatitis E. Results 3 stool samples were positive for HEV RNA, which were then hybridized、 recombinanted and sequenced. The homology of nucleic acid and amino acid sequences of 3 HEV strains in Guangzhou comparing with the Burmese、Pakistani、Mexican、Chinese Ch1.1 and G-9 strains were 80.67% and 88.60(B)、81.25% and 89.20%(P)、77.45% and 84.81%(M)、81.25% and 89.20%(C)、97.85% and 96.20%(G) respectively.Conclusion The results suggested that 3 strains of HEV in Guangzhou had genomutation to a certain extent.
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【Key words】 HEV RNA Nucleotide sequences
曾有学者报道缅甸戊型肝炎病毒(HEV)的流行株和散发株有一定的差异[1]。近来有学者发现了HEV的变异株[2]。为了解广州地区HEV株的变异程度，对本地区散发性HEV株进行了核酸序列分析，现将结果报告如下。
材料和方法
一、标本
8份粪便标本取自1993年3～7月间我院收治的急性黄疸性肝炎发病5～10天患者。8例患者血清中的HEV-IgM和HEV-IgG均于发病第2周阳转(分别用美国B & L和Genelabs EIA诊断试剂盒检测)，血清学上排除了甲、乙、丙、丁型肝炎，诊断符合1995年(北京)第五次全国传染病与寄生虫学术会议制定的诊断标准。
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二、试剂和仪器
cDNA试剂盒、RNA抽提试剂盒、PCR试剂、DNA分子标志(Phix174/Hae Ⅲ)、PUC19质粒、JM109大肠杆菌、BamHI和EcoRI限制性内切酶、ALF荧光DNA测序仪及其配套的Autocycle Sequencing试剂盒等均为美国Pharmacia公司产品，使用时按说明书操作。HEV418bp生物素探针含HEV基因4458～4876nts序列由北京军事医学科学院提供。HEV引物参照文献[3]用Beckman Qligo 1 000 DNA引物合成仪及其配套试剂盒合成。外正链5′-GCTATTATGGAGGAGTGTGG-3′，外负链5′-CGTGGATCTTGCAGGCC-3′(4458～4876nts)，内正链5′-CGTGGATCTTGCAGGCC-3′，内负链5′-TTCAACTTCAAGCCACAGCC-3′(4521～4760nts)，合成后用配套试剂纯化、干燥，-70℃保存，使用时用去离子水溶解成0.2μm/μl。
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三、逆转录-套式-聚合酶链反应(RT-Nested-PCR)
粪便标本去渣后用8%PEG(MW 6000)沉淀，4℃过夜。次日6 000r/min离心30分钟，沉淀用RNA抽提试剂盒提取RNA，乙醇沉淀后用cDNA合成试剂盒和戊肝外引物合成cDNA，再用两对戊肝引物进行套式PCR扩增。PCR产物为238bp带。
四、分子探针杂交试验
将电泳凝胶上的PCR阳性产物转印到硝酸纤维素膜上，用HEV探针进行分子杂交，酶标亲和素显示DNA带。
五、PCR产物核酸序列分析
将3例阳性PCR产物插入到PUC19质粒中，重组质粒转化到大肠杆菌JM109后，接种到LB培养基上培养，筛选阳性白斑进行培养，提取质粒DNA，用BamHI和EcoRI双酶切观察克隆DNA，并用核苷酸测序试剂和测序仪进行序列分析。
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结果
用RT-Nested-PCR检测8例戊型肝炎患者粪便，有3例HEV RNA阳性，阳性产物为238bp。3例阳性产物用HEV探针杂交后均为阳性。对3例阳性PCR产物G1、G2、G3进行核酸序列分析，3株之间比较核苷酸和氨基酸序列的同源性分别达95%和96%以上。3株HEV与已报道的缅甸株(B)、巴基斯坦株(P)、墨西哥株(M)、中国新疆株(Ch1.1)和广州地区血清株(G-9)比较，核苷酸和氨基酸的同源性平均数分别为80.67%和88.60%(B)、81.25%和89.20%(P)、77.45%和84.81%(M)、81.25%和89.20%(C)97.85%和96.20%(G)(见附图)。
附图 广州地区HEV散发株G1、G2、G3与缅甸株(B)、中国新疆株(ch1.1)、墨西哥株(M)、广州血清株(G-9)比较核甘酸序列
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讨论
本组中3例戊肝患者粪便中的HEV RNA均是在发病一周内检出。5例未检出HEV RNA的粪便除1例是发病一周内标本，另外4例是发病8～10天的标本。结果提示，戊型肝炎发病早期，粪便中HEV RNA检出率较高，随着发病时间的增加，粪便排毒减少，HEV RNA检出率降低。与文献报道一致[4，5]。
迄今，已先后报道了缅甸、巴基斯坦、墨西哥、中国新疆等地的HEV流行株核酸序列[6～10]。普遍认为HEV至少分为两种亚型，B株代表亚洲型，M株代表美洲型。同一亚型核酸序列同源性较高，达90%以上，不同亚型差异较大，同源性约75%左右。有学者发现缅甸HEV流行株和散发株的核酸序列有一定的差异，中国新疆流行株(Ch1.1)以及我国一些地区的散发株均与缅甸HEV流行株相近，核酸序列同源性达95%左右。但是近年来有人发现广州戊肝患者血清中的HEV(G-9)株变异较大，与B、P、M、Ch1.1以及北京散发株的核酸序列同源性均低于75%，而广州地区散发性戊型肝炎患者粪便中的HEV株核酸序列未见报道。为进一步证实广州地区散发株的变异情况，本文作者对本地区散发性戊型肝炎患者粪便中HEV RNA稳定区基因片段进行了扩增、分子杂交、基因克隆和核酸序列分析。结果显示，本组的G1、G2、G3株与报道的G-9株核苷酸和氨基酸序列的同源性最高(97.85%和96.20%)，可能属同一亚型。与已报道的其他株差异较大，可能属不同亚型。要确定G1、G2、G3株是否为HEV株的新的基因型(一般要求变异率20%)或新的亚型(一般要求变异率5%)，还需作别的区段序列比较才能得出结论。这种变异株是否普遍存在亦有待于进一步研究。目前，国家卫生部没有确定效果满意的戊型肝炎诊断试剂盒，即使用美国Genelabs公司的EIA HEV-IgG检测试剂盒也常出现与临床不相符的结果，其中原因除与试剂盒质量有关外，是否与HEV变异导致血清抗体对检测试剂中的抗原反应性改变有关，作者认为有必要做进一步研究。
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本课题为香港政府34-Chroucher基金与广州市科委联合资助项目
参考文献
1 Aye TT.Sequence comparison of the capsid region of hepatitis E viruses isolated from Myanman and China. Microbiol Immunol, 1992,39:615.
2 Huang RT, Nakazono N, Ishii K, et al.Ⅱ Existing variations on the gene structure of hepatitis E virus strains from some regions of China. J Med Virol, 1995,47:303-305.
3 Reyes GR, Purdy MA, Kim J，et al.Isolation of a cDNA from the virus responsible or entericlly transmitted non-A、 non-B hepatitis. Science,1990,247:1335-1339.
, 百拇医药
4 庄辉.聚合酶链反应检测实验感染HEV猕猴胆汁中HEV RNA.中华实验和临床病毒学杂志，1992，6：111-112.
5 庄辉.我国戊型肝炎病毒结构区基因序列分析.中华实验和临床病毒学杂志，1983，7：14-22.
6 Ticehurst J,Popkin TJ, Bryan JP,et al. Association of hepatitis E virus with an outbreak of hepatitis in Pakistan:serologic responses and pattern of virus excretion. J Med Virol，1992,36:84-88.
7 Yarbough PO,Tam AW, Fry KE,et al.Hepatitis E virus:Identification of type-common epitopes. J Virol,1991,5790-5797.
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8 Tam AW,Smith MM,Guerra ME,et al.Hepatitis E virus:Molecular cloning and sequencing of the full-length viral genome. Virol,1991,185:120-121.
9 Yin S,Tsarev SA,Purcell RH,et al. Partial sequence comparison of eight new Chinese strains of hepatitis E virus suggests the genome sequence is relatively stable. J Med Virol,1993,41:230-241.
10 Bi SI,Purdy MA, Mccaustland KA, et al. The sequence of hepatitis E virus isolated directly from a single source during an outbreak in China. Virus Research,1993,28:233-241., 百拇医药
单位：510060 广州市传染病医院(魏绍静、唐漾波、董惠卿、蔡晓莉)；香港理工大学(Petet Walsh)
关键词：戊型肝炎病毒RNA；核酸序列分析
中华传染病杂980208 【摘要】 目的 了解粪便中戊型肝炎病毒(HEV)散发株的核酸序列变异情况。方法 用逆转录-套式-聚合酶链反应(RT-Nested-PCR)检测了8例广州地区散发性戊型肝炎患者粪便中的HEV RNA，3例阳性。对阳性PCR产物的238个碱基进行了基因克隆和核酸序列分析，并与已报道的HEV序列进行比较。结果 本地区3株HEV与缅甸株(B)、巴基斯坦株(P)、墨西哥株(M)、中国新疆株(Ch1.1)和广州血清株(G-9)的核苷酸和氨基酸的同源性均值分别为80.67%和88.60(B)、81.25%和89.20%(P)、77.45%和84.81%(M)、81.25%和89.20%(C)、97.85%和96.20%(G)。结论 本组3株HEV有一定程度的变异。
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Nucleic acid sequence analysis of the sporadic hepatitis E virus strains isolated from stool samples
Wei Shaojing, Peter Walsh, Tang Yangbo, et al. Institute of Infectious Diseases, Guangzhou Infectious Diseases Hospital, Guangzhou 510060
【Abstract】 Objective In order to investigate the genomutation of sporadic HEV strains we analyzed the nucleotide sequence of sporadic HEV strains in Guangzhou.Methods RT-Nested PCR was used to determinate HEV RNA in stool samples from 8 patients with sporadic hepatitis E. Results 3 stool samples were positive for HEV RNA, which were then hybridized、 recombinanted and sequenced. The homology of nucleic acid and amino acid sequences of 3 HEV strains in Guangzhou comparing with the Burmese、Pakistani、Mexican、Chinese Ch1.1 and G-9 strains were 80.67% and 88.60(B)、81.25% and 89.20%(P)、77.45% and 84.81%(M)、81.25% and 89.20%(C)、97.85% and 96.20%(G) respectively.Conclusion The results suggested that 3 strains of HEV in Guangzhou had genomutation to a certain extent.
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【Key words】 HEV RNA Nucleotide sequences
曾有学者报道缅甸戊型肝炎病毒(HEV)的流行株和散发株有一定的差异[1]。近来有学者发现了HEV的变异株[2]。为了解广州地区HEV株的变异程度，对本地区散发性HEV株进行了核酸序列分析，现将结果报告如下。
材料和方法
一、标本
8份粪便标本取自1993年3～7月间我院收治的急性黄疸性肝炎发病5～10天患者。8例患者血清中的HEV-IgM和HEV-IgG均于发病第2周阳转(分别用美国B & L和Genelabs EIA诊断试剂盒检测)，血清学上排除了甲、乙、丙、丁型肝炎，诊断符合1995年(北京)第五次全国传染病与寄生虫学术会议制定的诊断标准。
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二、试剂和仪器
cDNA试剂盒、RNA抽提试剂盒、PCR试剂、DNA分子标志(Phix174/Hae Ⅲ)、PUC19质粒、JM109大肠杆菌、BamHI和EcoRI限制性内切酶、ALF荧光DNA测序仪及其配套的Autocycle Sequencing试剂盒等均为美国Pharmacia公司产品，使用时按说明书操作。HEV418bp生物素探针含HEV基因4458～4876nts序列由北京军事医学科学院提供。HEV引物参照文献[3]用Beckman Qligo 1 000 DNA引物合成仪及其配套试剂盒合成。外正链5′-GCTATTATGGAGGAGTGTGG-3′，外负链5′-CGTGGATCTTGCAGGCC-3′(4458～4876nts)，内正链5′-CGTGGATCTTGCAGGCC-3′，内负链5′-TTCAACTTCAAGCCACAGCC-3′(4521～4760nts)，合成后用配套试剂纯化、干燥，-70℃保存，使用时用去离子水溶解成0.2μm/μl。
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三、逆转录-套式-聚合酶链反应(RT-Nested-PCR)
粪便标本去渣后用8%PEG(MW 6000)沉淀，4℃过夜。次日6 000r/min离心30分钟，沉淀用RNA抽提试剂盒提取RNA，乙醇沉淀后用cDNA合成试剂盒和戊肝外引物合成cDNA，再用两对戊肝引物进行套式PCR扩增。PCR产物为238bp带。
四、分子探针杂交试验
将电泳凝胶上的PCR阳性产物转印到硝酸纤维素膜上，用HEV探针进行分子杂交，酶标亲和素显示DNA带。
五、PCR产物核酸序列分析
将3例阳性PCR产物插入到PUC19质粒中，重组质粒转化到大肠杆菌JM109后，接种到LB培养基上培养，筛选阳性白斑进行培养，提取质粒DNA，用BamHI和EcoRI双酶切观察克隆DNA，并用核苷酸测序试剂和测序仪进行序列分析。
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结果
用RT-Nested-PCR检测8例戊型肝炎患者粪便，有3例HEV RNA阳性，阳性产物为238bp。3例阳性产物用HEV探针杂交后均为阳性。对3例阳性PCR产物G1、G2、G3进行核酸序列分析，3株之间比较核苷酸和氨基酸序列的同源性分别达95%和96%以上。3株HEV与已报道的缅甸株(B)、巴基斯坦株(P)、墨西哥株(M)、中国新疆株(Ch1.1)和广州地区血清株(G-9)比较，核苷酸和氨基酸的同源性平均数分别为80.67%和88.60%(B)、81.25%和89.20%(P)、77.45%和84.81%(M)、81.25%和89.20%(C)97.85%和96.20%(G)(见附图)。
附图 广州地区HEV散发株G1、G2、G3与缅甸株(B)、中国新疆株(ch1.1)、墨西哥株(M)、广州血清株(G-9)比较核甘酸序列
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讨论
本组中3例戊肝患者粪便中的HEV RNA均是在发病一周内检出。5例未检出HEV RNA的粪便除1例是发病一周内标本，另外4例是发病8～10天的标本。结果提示，戊型肝炎发病早期，粪便中HEV RNA检出率较高，随着发病时间的增加，粪便排毒减少，HEV RNA检出率降低。与文献报道一致[4，5]。
迄今，已先后报道了缅甸、巴基斯坦、墨西哥、中国新疆等地的HEV流行株核酸序列[6～10]。普遍认为HEV至少分为两种亚型，B株代表亚洲型，M株代表美洲型。同一亚型核酸序列同源性较高，达90%以上，不同亚型差异较大，同源性约75%左右。有学者发现缅甸HEV流行株和散发株的核酸序列有一定的差异，中国新疆流行株(Ch1.1)以及我国一些地区的散发株均与缅甸HEV流行株相近，核酸序列同源性达95%左右。但是近年来有人发现广州戊肝患者血清中的HEV(G-9)株变异较大，与B、P、M、Ch1.1以及北京散发株的核酸序列同源性均低于75%，而广州地区散发性戊型肝炎患者粪便中的HEV株核酸序列未见报道。为进一步证实广州地区散发株的变异情况，本文作者对本地区散发性戊型肝炎患者粪便中HEV RNA稳定区基因片段进行了扩增、分子杂交、基因克隆和核酸序列分析。结果显示，本组的G1、G2、G3株与报道的G-9株核苷酸和氨基酸序列的同源性最高(97.85%和96.20%)，可能属同一亚型。与已报道的其他株差异较大，可能属不同亚型。要确定G1、G2、G3株是否为HEV株的新的基因型(一般要求变异率20%)或新的亚型(一般要求变异率5%)，还需作别的区段序列比较才能得出结论。这种变异株是否普遍存在亦有待于进一步研究。目前，国家卫生部没有确定效果满意的戊型肝炎诊断试剂盒，即使用美国Genelabs公司的EIA HEV-IgG检测试剂盒也常出现与临床不相符的结果，其中原因除与试剂盒质量有关外，是否与HEV变异导致血清抗体对检测试剂中的抗原反应性改变有关，作者认为有必要做进一步研究。
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本课题为香港政府34-Chroucher基金与广州市科委联合资助项目
参考文献
1 Aye TT.Sequence comparison of the capsid region of hepatitis E viruses isolated from Myanman and China. Microbiol Immunol, 1992,39:615.
2 Huang RT, Nakazono N, Ishii K, et al.Ⅱ Existing variations on the gene structure of hepatitis E virus strains from some regions of China. J Med Virol, 1995,47:303-305.
3 Reyes GR, Purdy MA, Kim J，et al.Isolation of a cDNA from the virus responsible or entericlly transmitted non-A、 non-B hepatitis. Science,1990,247:1335-1339.
, 百拇医药
4 庄辉.聚合酶链反应检测实验感染HEV猕猴胆汁中HEV RNA.中华实验和临床病毒学杂志，1992，6：111-112.
5 庄辉.我国戊型肝炎病毒结构区基因序列分析.中华实验和临床病毒学杂志，1983，7：14-22.
6 Ticehurst J,Popkin TJ, Bryan JP,et al. Association of hepatitis E virus with an outbreak of hepatitis in Pakistan:serologic responses and pattern of virus excretion. J Med Virol，1992,36:84-88.
7 Yarbough PO,Tam AW, Fry KE,et al.Hepatitis E virus:Identification of type-common epitopes. J Virol,1991,5790-5797.
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8 Tam AW,Smith MM,Guerra ME,et al.Hepatitis E virus:Molecular cloning and sequencing of the full-length viral genome. Virol,1991,185:120-121.
9 Yin S,Tsarev SA,Purcell RH,et al. Partial sequence comparison of eight new Chinese strains of hepatitis E virus suggests the genome sequence is relatively stable. J Med Virol,1993,41:230-241.
10 Bi SI,Purdy MA, Mccaustland KA, et al. The sequence of hepatitis E virus isolated directly from a single source during an outbreak in China. Virus Research,1993,28:233-241., 百拇医药