成人急性白血病患者骨髓细胞NG2表达的检测
作者：陈育红 高晖 常艳 于弘 陈珊珊
单位：北京大学人民医院血液病研究所,北京 100044
关键词：白血病；骨髓细胞；透明质酸；代谢；糖蛋白NG2
北京医科大学学报000623 [摘 要]目的：检测成人急性白血病细胞中NG2的表达，了解其与临床表现、免疫表型及疗效的关系。方法：用流式细胞仪-间接免疫荧光标记法检测62例成人急性髓细胞白血病(adult acute myeloid leukemia,AML)和24例急性淋巴细胞白血病(acute lymphoblastic leukemia,ALL)患者骨髓细胞膜表面人类小鼠硫酸透明质酸糖蛋白NG2同源物的表达。结果：在19.35%的AML和4.17%的ALL中此抗原表达阳性。阳性者与对照在临床特征和血象方面无差异。但在AML中与FAB分型有一定的相关性,以M0、M1为多。NG2阳性者更易表达CD9和CD13，而CD14、CD15的阳性率较低(P<0.05)，CD34、CD38等干/祖细胞标志的表达率也较高(P=0.1)。 NG2阳性患者的缓解率较低(P=0.08)。结论：NG2多表达于早期的造血干/祖细胞，与预后似乎有一定的关系。
, 百拇医药
[中图分类号]R733.71 [文献标识码]A
[文章编号]1000-1530(2000)06-0561-03
Expression of the NG2 molecule in adult acute leukemia
CHEN Yu-Hong,GAO Hui,CHANG Yan,YU Hong,CHEN Shan-Shan
(Institute of Hematology,Peking University People's Hospital,Beijing 100044,China)
ABSTRACT Objective:To investigate the expression of NG2 molecule in adult acute leukemia and its relationship with the clinical manifestations,immunophenotype and prognosis.Methods:Monoclonal antibody 7.1,which could recognize the human homologue of the rat NG2 chondroitin sulfate proteglycan molecule was used to screen the blast cells from 62 adults with adult acute myeloid leukemia (AML) and 24 with acute lymphoblastic leukemia (ALL) by flow cytometry.Results:19.35% AML and 4.17% ALL bone marrow expressed the NG2 molecule.Blast cells expressing the NG2 occurred more frequently in FAB-M0 and M1 (P<0.05).NG2 positive AML more often expressed CD9,CD13 (P<0.05) and CD34,CD38 (P=0.1).NG2 indicated a poor outcome in both AML and ALL.Conclusion:The NG2 is likely expressed in the early hematopoietic cells and may potentially serve as a poor prognosis predictor.
, 百拇医药
KEY WORDS Leukemia;Bone marrow cells;Hyaluronic acid/metab;Glycoprotein NG2
寻求肿瘤特异性的抗原标志对于肿瘤的诊断、治疗、追踪均有重要的意义。遗憾的是白血病是由一群处于不同分化阶段的血细胞分化受阻或增殖过度引起的恶性疾病。因此目前应用于临床的基本都是一些白细胞的正常分化抗原，通过分析其在表达系列及阶段上的紊乱来对白血病进行分型。1996年Hutchinson肿瘤研究所的Smith等[1]制备了一种单抗命名为7.1,它识别的抗原是小鼠硫酸透明质酸糖蛋白的人类同源物NG2。此种抗原最先报道表达于人类黑色素瘤细胞，后发现在一部分白血病细胞上亦可表达，但不表达于正常的造血组织。其存在往往提示预后不良，并与某些分化抗原，以及MLL基因的异常相关。蒙其惠赠，我们用7.1单抗经流式细胞仪—间接免疫荧光标记法对62例成人急性髓细胞白血病(adult acute myeloid leukema,AML)及24例急性淋巴细胞白血病(acute lymphoblastic leukemia,ALL)患者骨髓细胞NG2表达进行了检测。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 研究对象
1997年8月～1999年1月在我所经骨髓细胞形态学诊为急性白血病者,其中初治AML 62例(M3除外),ALL24例，其基本资料见表1。
1.2 检测方法
(1)骨髓单个核细胞的制备：经肝素抗凝的新鲜骨髓标本，用1.077 g.L-1的淋巴细胞分层液分离，取单个核细胞层，用PBS(pH7.4)洗涤两次，计数并调整至每毫升1×107个细胞。(2) 抗体标记：取上述细胞悬液50 μl，一管加7.1单抗50 μl(1∶1000稀释)，另一管不加作为阴性对照。4 ℃ 孵育45 min后，用含0.01%(体积分数)胎牛血清的PBS洗涤两次，加入带FITC标记的羊抗鼠IgG二抗，4 ℃ 孵育45 min，PBS洗涤后用80%(体积分数)乙醇1～2 ml固定，一周内检测。(3)流式细胞术(flow cytometry,FCM)测定：流式细胞仪为B-D公司的FACSort，所用激光功率为25 mW,激发光波长为488 nm。第一荧光检测器(FLⅠ)收集FITC的荧光信号。每份样品测定2000个细胞，用cellquest软件分析数据。(4)免疫表型：根据本室常规，对骨髓细胞标记一组单克隆抗体，包括CD2、CD3、CD4、CD7、CD8、CD10、CD11、CD13、CD14、CD15、CD19、CD20、CD22、CD33、CD34、CD38、CD117、HLA-DR等，用流式细胞仪检测。(5)统计方法：χ2、t、F检验及秩和检验。
, 百拇医药
表1 患者的一般临床资料
Table 1 General clinical data of the patients
n
Male/
Female
Age.
(years)
WBC
(×109.L-1)*
Hb，ρ/(g.L-1)*
, http://www.100md.com
Platelet
(×109.L-1)*
Hepato
megaly
Spleen
megaly
Lympho
megaly
AML
62
38/24
, 百拇医药
15-76
0.7-59.2
19-144
5-300
9/57
9/56
16/57
(40)
(13)
(80)
(30)
ALL
24
, 百拇医药
20/4
15-72
1.7-171
47-159
2-381
6/21
8/20
10/22
(29)
(24)
(10)0
(76.5)
.， range and middle number;(),middle value.
, 百拇医药
2 结果
2.1 NG2表达的阳性率
当25%的细胞荧光强度强于对照时定义为阳性,12名骨髓大致正常者的阳性率均小于25%。据此，12例(19.35%)AML和1例(4.17%)ALL患者为阳性。
2.2 NG2表达与临床、实验室检查的相关性
12例NG2阳性的AML患者与50例阴性对照相比在年龄、性别、白细胞数、血小板数和血色素,髓外浸润方面差异均无显著性,但在FAB分型方面差异有显著性,M0、M1占有明显优势(50%比10%)，见表2。
表2 86例急性白血病患者的FAB分型及与MoAb7.1的关系
Table 2 The relationship between FAB type and MoAb7.1 among 86 patients FAB
, http://www.100md.com
M0
M1
M2
M4
M5
M6
AUL
B-ALL
T-ALL
Total
7.1
1
, 百拇医药
4
26
6
5
3
5
17
6
73
Negative
7.1
2
4
2
, 百拇医药
0
2
1
1
1
0
13
Positive
Total
3
8
28
6
7
, 百拇医药
4
6
18
6
86
2.3 NG2表达与免疫表型的关系
经秩和检验表明在AML中,NG2与CD9,CD13及CD14,CD15的表达有相关性(P<0.05),NG2阳性者更易表达CD9和CD13而CD14,CD15的阳性率较低。另外CD34,CD38等干/祖细胞标志的表达率也较高(P=0.1)。因ALL阳性病例数过少，未做统计学分析。
2.4 NG2表达与疗效的关系
11例NG2阳性的AML患者有4例达完全缓解(complete response,CR),1例部分缓解(partial response,PR),6例未缓解(no response,NR);对照组分别为27,3和11例。CR率分别为36.36% 比65.85%(P=0.08).在ALL中表达NG2的1例达到短暂缓解，而对照组CR率为61.90%。因此NG2的表达似与预后不良有一定的相关性。
, 百拇医药
3 讨论
细胞免疫标记的检测不仅可以对白血病的诊断提供帮助，在对疾病的预后、残留病变的追踪等方面也起着重要的作用。如何寻找到白血病特有的抗原是其关键。Smith等[1]发现的7.1单抗就是其中较有希望的一种,它所识别的硫酸透明质酸糖蛋白被认为是细胞黏附和转移的抑制剂。正常的造血组织不表达7.1，仅在一部分白血病细胞上表达，在儿童AML中的阳性率为11%[1]，ALL为8.6%[2]，与我们成人的结果相似。阳性患儿的缓解率、无病生存率均低于对照，4年的实际生存率仅为16.7%，阴性患儿是44.5%。同样，在我们的12例阳性患者中仅有5例到达CR，其中的2例在短期内复发，两者的CR率是41.67% 比64.52%，虽病例数有限，但仍提示此抗体可能与预后不良有一定的关系。至于能否作为白血病的特异标志，用来检测残留病变，因应用时间较短，这方面还没有更多的文献报道，但值得进一步的研究。
60例AML患者的免疫表型与7.1表达的比较发现，7.1与CD9、CD13和CD14、CD15有很好的相关性(P<0.05)，7.1阳性的细胞更易表达CD9、CD13。CD34、CD38等造血干/祖细胞的标志也较高(P=0.1),这与FAB分型中M0、M1所占比例较高一致，很可能7.1表达于较早期阶段的造血细胞。代表单核细胞的CD14在7.1阳性的标本中较低，与Hilden[3]的婴儿AML中7.1阳性患儿多为M4/M5的结果不符，可能与婴儿与成人的细胞生物学特性不同有关，这还需要分析更多的病例才能最终明确。1例阳性的ALL患者，其CD10阴性同文献相符[2]。
, 百拇医药
7.1之所以引起人们的关注，更多的是因为它与MLL基因的异常有很好的相关性。对儿童和婴儿的研究发现7.1阳性者基本均有MLL基因的异常，但有MLL异常的并不一定为7.1阳性[1～3]。成人的相关性似乎不那么严格，Wucher[4]报道38例7.1阳性的患者有29例有MLL的异常，其余17例用Southern方法检测均未发现。因为M3具有特异的遗传学标志，因此本研究未将其包括在内，我们利用RT-PCR的方法在13例7.1阳性的患者中证实2例有MLL的重排，而阴性患者均未检测到(另文发表)。
7.1作为一种新的较特异性的白血病细胞的标志，在对白血病的诊断、预后方面的作用有一定的价值，其与MLL基因的关系正在进行研究。
参考文献
1，Smith FO,Rauch C,Williams DE,et al.The human homologue of rat NG2,a chondroitin sulfate proteoglycan,is not expressed on the cell surface of normal hematopoietic cells but is expressed by acute myeloid leukemia blasts from poor-prognosis patients with abnormalities of chromosome band 11q23[J].Blood,1996,87(3):1123-1133
, http://www.100md.com
2，Behm FG,Smith FO,Raimondi SC,et al.Human homologue of the rat chondroitin sulfate proteoglycan,NG2,detected by monoclonal antibody 7.1,identifies childhood acute lymphoblastic leukemias with t(4;11)(q21;q23) or t(11;19)(q23;p13) and MLL gene rearrangements[J].Blood,1996,87(3):1134-1139
3，Hilden JM,Smith FO,Frestedt JL,et al.MLL gene rearrangement,cytogenetic 11q23 abnormalities,and expression of the NG2 molecule in infant acute myeloid leukemia[J].Blood,1997,89(10):3801-3805
4，Wucher C,Schinttger S,Schoch C,et al.Detection of acute leukemia cells with 11q23-rearrangements by flow cytometry:sensitivity and specificity of momoclonal antibody 7.1[J].Blood,1998,92(suppl，10):228a
收稿日期：1999-02-02, http://www.100md.com
单位：北京大学人民医院血液病研究所,北京 100044
关键词：白血病；骨髓细胞；透明质酸；代谢；糖蛋白NG2
北京医科大学学报000623 [摘 要]目的：检测成人急性白血病细胞中NG2的表达，了解其与临床表现、免疫表型及疗效的关系。方法：用流式细胞仪-间接免疫荧光标记法检测62例成人急性髓细胞白血病(adult acute myeloid leukemia,AML)和24例急性淋巴细胞白血病(acute lymphoblastic leukemia,ALL)患者骨髓细胞膜表面人类小鼠硫酸透明质酸糖蛋白NG2同源物的表达。结果：在19.35%的AML和4.17%的ALL中此抗原表达阳性。阳性者与对照在临床特征和血象方面无差异。但在AML中与FAB分型有一定的相关性,以M0、M1为多。NG2阳性者更易表达CD9和CD13，而CD14、CD15的阳性率较低(P<0.05)，CD34、CD38等干/祖细胞标志的表达率也较高(P=0.1)。 NG2阳性患者的缓解率较低(P=0.08)。结论：NG2多表达于早期的造血干/祖细胞，与预后似乎有一定的关系。
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[中图分类号]R733.71 [文献标识码]A
[文章编号]1000-1530(2000)06-0561-03
Expression of the NG2 molecule in adult acute leukemia
CHEN Yu-Hong,GAO Hui,CHANG Yan,YU Hong,CHEN Shan-Shan
(Institute of Hematology,Peking University People's Hospital,Beijing 100044,China)
ABSTRACT Objective:To investigate the expression of NG2 molecule in adult acute leukemia and its relationship with the clinical manifestations,immunophenotype and prognosis.Methods:Monoclonal antibody 7.1,which could recognize the human homologue of the rat NG2 chondroitin sulfate proteglycan molecule was used to screen the blast cells from 62 adults with adult acute myeloid leukemia (AML) and 24 with acute lymphoblastic leukemia (ALL) by flow cytometry.Results:19.35% AML and 4.17% ALL bone marrow expressed the NG2 molecule.Blast cells expressing the NG2 occurred more frequently in FAB-M0 and M1 (P<0.05).NG2 positive AML more often expressed CD9,CD13 (P<0.05) and CD34,CD38 (P=0.1).NG2 indicated a poor outcome in both AML and ALL.Conclusion:The NG2 is likely expressed in the early hematopoietic cells and may potentially serve as a poor prognosis predictor.
, 百拇医药
KEY WORDS Leukemia;Bone marrow cells;Hyaluronic acid/metab;Glycoprotein NG2
寻求肿瘤特异性的抗原标志对于肿瘤的诊断、治疗、追踪均有重要的意义。遗憾的是白血病是由一群处于不同分化阶段的血细胞分化受阻或增殖过度引起的恶性疾病。因此目前应用于临床的基本都是一些白细胞的正常分化抗原，通过分析其在表达系列及阶段上的紊乱来对白血病进行分型。1996年Hutchinson肿瘤研究所的Smith等[1]制备了一种单抗命名为7.1,它识别的抗原是小鼠硫酸透明质酸糖蛋白的人类同源物NG2。此种抗原最先报道表达于人类黑色素瘤细胞，后发现在一部分白血病细胞上亦可表达，但不表达于正常的造血组织。其存在往往提示预后不良，并与某些分化抗原，以及MLL基因的异常相关。蒙其惠赠，我们用7.1单抗经流式细胞仪—间接免疫荧光标记法对62例成人急性髓细胞白血病(adult acute myeloid leukema,AML)及24例急性淋巴细胞白血病(acute lymphoblastic leukemia,ALL)患者骨髓细胞NG2表达进行了检测。
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1 材料与方法
1.1 研究对象
1997年8月～1999年1月在我所经骨髓细胞形态学诊为急性白血病者,其中初治AML 62例(M3除外),ALL24例，其基本资料见表1。
1.2 检测方法
(1)骨髓单个核细胞的制备：经肝素抗凝的新鲜骨髓标本，用1.077 g.L-1的淋巴细胞分层液分离，取单个核细胞层，用PBS(pH7.4)洗涤两次，计数并调整至每毫升1×107个细胞。(2) 抗体标记：取上述细胞悬液50 μl，一管加7.1单抗50 μl(1∶1000稀释)，另一管不加作为阴性对照。4 ℃ 孵育45 min后，用含0.01%(体积分数)胎牛血清的PBS洗涤两次，加入带FITC标记的羊抗鼠IgG二抗，4 ℃ 孵育45 min，PBS洗涤后用80%(体积分数)乙醇1～2 ml固定，一周内检测。(3)流式细胞术(flow cytometry,FCM)测定：流式细胞仪为B-D公司的FACSort，所用激光功率为25 mW,激发光波长为488 nm。第一荧光检测器(FLⅠ)收集FITC的荧光信号。每份样品测定2000个细胞，用cellquest软件分析数据。(4)免疫表型：根据本室常规，对骨髓细胞标记一组单克隆抗体，包括CD2、CD3、CD4、CD7、CD8、CD10、CD11、CD13、CD14、CD15、CD19、CD20、CD22、CD33、CD34、CD38、CD117、HLA-DR等，用流式细胞仪检测。(5)统计方法：χ2、t、F检验及秩和检验。
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表1 患者的一般临床资料
Table 1 General clinical data of the patients
n
Male/
Female
Age.
(years)
WBC
(×109.L-1)*
Hb，ρ/(g.L-1)*
, http://www.100md.com
Platelet
(×109.L-1)*
Hepato
megaly
Spleen
megaly
Lympho
megaly
AML
62
38/24
, 百拇医药
15-76
0.7-59.2
19-144
5-300
9/57
9/56
16/57
(40)
(13)
(80)
(30)
ALL
24
, 百拇医药
20/4
15-72
1.7-171
47-159
2-381
6/21
8/20
10/22
(29)
(24)
(10)0
(76.5)
.， range and middle number;(),middle value.
, 百拇医药
2 结果
2.1 NG2表达的阳性率
当25%的细胞荧光强度强于对照时定义为阳性,12名骨髓大致正常者的阳性率均小于25%。据此，12例(19.35%)AML和1例(4.17%)ALL患者为阳性。
2.2 NG2表达与临床、实验室检查的相关性
12例NG2阳性的AML患者与50例阴性对照相比在年龄、性别、白细胞数、血小板数和血色素,髓外浸润方面差异均无显著性,但在FAB分型方面差异有显著性,M0、M1占有明显优势(50%比10%)，见表2。
表2 86例急性白血病患者的FAB分型及与MoAb7.1的关系
Table 2 The relationship between FAB type and MoAb7.1 among 86 patients FAB
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M0
M1
M2
M4
M5
M6
AUL
B-ALL
T-ALL
Total
7.1
1
, 百拇医药
4
26
6
5
3
5
17
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Negative
7.1
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0
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Positive
Total
3
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4
6
18
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86
2.3 NG2表达与免疫表型的关系
经秩和检验表明在AML中,NG2与CD9,CD13及CD14,CD15的表达有相关性(P<0.05),NG2阳性者更易表达CD9和CD13而CD14,CD15的阳性率较低。另外CD34,CD38等干/祖细胞标志的表达率也较高(P=0.1)。因ALL阳性病例数过少，未做统计学分析。
2.4 NG2表达与疗效的关系
11例NG2阳性的AML患者有4例达完全缓解(complete response,CR),1例部分缓解(partial response,PR),6例未缓解(no response,NR);对照组分别为27,3和11例。CR率分别为36.36% 比65.85%(P=0.08).在ALL中表达NG2的1例达到短暂缓解，而对照组CR率为61.90%。因此NG2的表达似与预后不良有一定的相关性。
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3 讨论
细胞免疫标记的检测不仅可以对白血病的诊断提供帮助，在对疾病的预后、残留病变的追踪等方面也起着重要的作用。如何寻找到白血病特有的抗原是其关键。Smith等[1]发现的7.1单抗就是其中较有希望的一种,它所识别的硫酸透明质酸糖蛋白被认为是细胞黏附和转移的抑制剂。正常的造血组织不表达7.1，仅在一部分白血病细胞上表达，在儿童AML中的阳性率为11%[1]，ALL为8.6%[2]，与我们成人的结果相似。阳性患儿的缓解率、无病生存率均低于对照，4年的实际生存率仅为16.7%，阴性患儿是44.5%。同样，在我们的12例阳性患者中仅有5例到达CR，其中的2例在短期内复发，两者的CR率是41.67% 比64.52%，虽病例数有限，但仍提示此抗体可能与预后不良有一定的关系。至于能否作为白血病的特异标志，用来检测残留病变，因应用时间较短，这方面还没有更多的文献报道，但值得进一步的研究。
60例AML患者的免疫表型与7.1表达的比较发现，7.1与CD9、CD13和CD14、CD15有很好的相关性(P<0.05)，7.1阳性的细胞更易表达CD9、CD13。CD34、CD38等造血干/祖细胞的标志也较高(P=0.1),这与FAB分型中M0、M1所占比例较高一致，很可能7.1表达于较早期阶段的造血细胞。代表单核细胞的CD14在7.1阳性的标本中较低，与Hilden[3]的婴儿AML中7.1阳性患儿多为M4/M5的结果不符，可能与婴儿与成人的细胞生物学特性不同有关，这还需要分析更多的病例才能最终明确。1例阳性的ALL患者，其CD10阴性同文献相符[2]。
, 百拇医药
7.1之所以引起人们的关注，更多的是因为它与MLL基因的异常有很好的相关性。对儿童和婴儿的研究发现7.1阳性者基本均有MLL基因的异常，但有MLL异常的并不一定为7.1阳性[1～3]。成人的相关性似乎不那么严格，Wucher[4]报道38例7.1阳性的患者有29例有MLL的异常，其余17例用Southern方法检测均未发现。因为M3具有特异的遗传学标志，因此本研究未将其包括在内，我们利用RT-PCR的方法在13例7.1阳性的患者中证实2例有MLL的重排，而阴性患者均未检测到(另文发表)。
7.1作为一种新的较特异性的白血病细胞的标志，在对白血病的诊断、预后方面的作用有一定的价值，其与MLL基因的关系正在进行研究。
参考文献
1，Smith FO,Rauch C,Williams DE,et al.The human homologue of rat NG2,a chondroitin sulfate proteoglycan,is not expressed on the cell surface of normal hematopoietic cells but is expressed by acute myeloid leukemia blasts from poor-prognosis patients with abnormalities of chromosome band 11q23[J].Blood,1996,87(3):1123-1133
, http://www.100md.com
2，Behm FG,Smith FO,Raimondi SC,et al.Human homologue of the rat chondroitin sulfate proteoglycan,NG2,detected by monoclonal antibody 7.1,identifies childhood acute lymphoblastic leukemias with t(4;11)(q21;q23) or t(11;19)(q23;p13) and MLL gene rearrangements[J].Blood,1996,87(3):1134-1139
3，Hilden JM,Smith FO,Frestedt JL,et al.MLL gene rearrangement,cytogenetic 11q23 abnormalities,and expression of the NG2 molecule in infant acute myeloid leukemia[J].Blood,1997,89(10):3801-3805
4，Wucher C,Schinttger S,Schoch C,et al.Detection of acute leukemia cells with 11q23-rearrangements by flow cytometry:sensitivity and specificity of momoclonal antibody 7.1[J].Blood,1998,92(suppl，10):228a
收稿日期：1999-02-02, http://www.100md.com