地塞米松对脑缺氧缺血新生大鼠bcl-x及bax 基因表达的调节
作者：周伟 吴圣楣 陈惠金
单位：周伟(200092 上海第二医科大学新华医院 上海市儿科医学研究所，现在广州，第一军医大学附属珠江医院儿科 5100282)；吴圣楣(200092 上海第二医科大学新华医院 上海市儿科医学研究所)；陈惠金(200092 上海第二医科大学新华医院 上海市儿科医学研究所)
关键词：脑缺氧；脑缺血；地塞米松；bcl-x；bax
中华儿科杂志000805 【摘要】 目的 探讨地塞米松(DEX)预处理对缺氧缺血(HI)新生大鼠脑保护作用的可能机制。方法 通过建立新生大鼠缺氧缺血性脑病(HIE)动物模型，应用快速竞争性RT-PCR技术，分别对HI、DEX预处理后于HI、缺氧结束后即刻予DEX、DEX加假手术、正常对照5组(每组40只鼠)动物的实验侧大脑组织中bcl-x (bcl-xl和bcl-xs)、bax mRNA的表达进行半定量分析。结果 脑HI后bcl-xs、bax mRNA的表达明显增强，并在HI后24 h左右达高峰(bcl-xs 1.52±0.17, bax 1.43±0.17)，在脑HI后2～72 h，DEX预处理组bcl-xs 、bax mRNA的表达水平(bcl-xs 0.03±0.05～ 0.19±0.23，bax 0.02±0.03～0.13±0.21)显著低于HI组(bcl-xs 0.14±0.06～1.52±0.17，bax 0.09±0.03～1.43±0.17)(P<0.01)，而HI后给予DEX组其bcl-xs 、bax mRNA的表达量(bcl-xs 0.13±0.07～1.53±0.18；bax 0.07±0.05～1.47±0.10)与HI组之间的差异无显著性(P>0.05)。DEX及HI对bcl-xl mRNA的表达无明显影响。结论 脑HI可诱导bcl-xs、bax mRNA过表达，这种过表达在脑HI后细胞凋亡的调控过程中可能起着重要作用。DEX预处理可通过抑制bcl-xs、bax mRNA的过表达起到抗细胞凋亡的作用。
, 百拇医药
The regulatory effects of dexamethasone on mRNA expression of bcl-x and bax in neonatal rats with cerebral hypoxia-ischemia
ZHOU Wei，WU Shengmei，CHEN Huijin
(Xinhua Hospital, Shanghai Second Medical University, Shanghai Institute of Pediatrics, Shanghai 200092, China)
【Abstract】 Objective To explore the possible mechanisms of the neuroprotective effect of dexamethasone(DEX) on neonatal rats with cerebral hypoxia-ischemia. Methods The rapid competitive reverse transcriptase-PCR was used to analyze the expression of bcl-x (bcl-xl and bcl-xs) and bax mRNA at ipsilateral cerebral hemisphere semi-quantitatively in the neonatal rat model of hypoxia-ischemia(HI group), DEX treatment prior to hypoxia-ischemia(DH group), DEX treatment immediately following hypoxia-ischemia(HD group), DEX treatment prior to sham operation and normal controls, respectively. Results The expressions of bcl-x and bax mRNA in the ipsilateral hemisphere following cerebral hypoxia-ischemia increased significantly, and reached the peak level at 24 h (bcl-x was 1.52±0.17 and bax was 1.43±0.17). During 2 h to 72 h following hypoxia-ischemia, the expressions of bcl-x and bax mRNA in DH group (bcl-xs were significantly lower than those in HI group (bcl-xs: 0.03±0.05～ 0.19±0.23 versus 0.14±0.06～1.52±0.17, and bax: 0.02±0.03～0.13±0.21 versus 0.09±0.03～1.43±0.17, respectively, P<0.01). While there were no significant differences in the expressions of bcl-xs and bax mRNA between HD group (0.13±0.07～1.53±0.18 and 0.07±0.05～1.47±0.10, respectively) and HI group (P>0.05). DEX and HI had no evident effect on the expression of bcl-x mRNA. Conclusion Cerebral HI could induce the overexpressions of bax and bcl-x mRNA, which could play an important role in the regulation of apoptosis following cerebral HI. Pretreatment with DEX could exert the anti-apoptotic role by the down-regulation of bax and bcl-xs gene expressions.
, 百拇医药
【Key words】 Cerebral anoxia; Cerebral ischemia; Dexamethasone; Bcl-x; Bax
有资料表明，地塞米松(dexamethasone, DEX)预处理可以减少新生动物脑缺氧缺血(hypoxia ischemia, HI) 后所致的细胞凋亡。由于细胞凋亡受多种基因的调控，在哺乳动物中bcl-2 基因家族及其编码的蛋白质在细胞凋亡调控过程中起着重要作用。因此,本研究拟通过快速竞争性RT-PCR技术，探讨DEX对HI后新生大鼠脑内bcl-2基因家族中bcl-x、 bax mRNA表达的影响，以期阐明DEX预处理对HI新生大鼠(简称鼠)脑保护作用的可能机制。
材料和方法
一、鼠脑HI动物模型的制作和分组
参照Rice等[1]方法，将生后7天的SD大鼠(购自中国科学院上海实验动物中心)取仰卧位，颈正中切口，游离右侧颈总动脉并结扎，缝合切口后置于2 000 ml密闭容器，该容器置于37℃水浴中。以1～2 L/min的速度输入含8%氧气、92%氮气的混合气体，持续2.5 h。
, 百拇医药
将200只鼠随机分为5组(每组40只)：(1)HI组；(2)预给药组(即腹腔注射DEX后12 h左右予HI);(3)后给药组(即缺氧结束后即刻予腹腔注射DEX)；(4)假手术给药组(即仅作颈正中切口，游离右侧颈总动脉，但不结扎，假手术前注射DEX)；(5)正常对照组。分别于缺氧结束后不同时间点(假手术给药组及正常对照组于相对应的时间点)0、2、6、12、24、48、72 h及7 d断颈处死(每个时间点5只)。自丘脑中1/3水平取HI侧(右侧)大脑半球组织约50 mg，置-80℃冰箱备用。DEX剂量为0.5 mg/kg，对照组注射0.9%氯化钠注射液。
二、引物的设计与合成
从基因文库中查到大白鼠bcl-x和bax基因cDNA序列，应用Oligo 5.0软件程序设计上、下游引物，另设计一个下游竞争引物(包含下游引物另加若干个碱基序列)。
bcl-x引物：上游 5′ATCAATGGCAACCCATCCT-GGCACC3′， 下游5′TTGAAACGCTCCTGGCCTTTCCG-GC3′；bcl-x内参照引物：上游同bcl-x 引物，下游5′ TTGAAACGCTCCTGGCCTTTCCGGCTCACTGAATGCTC-TCCGGTACCGC3′；bax 引物：上游5′ATCCAGGATC-GAGCAGGGAGGATGG3′，下游5′AGATGGTCACTGT-CTGCCATGTGGG3′；bax内参照引物：上游同bax 引物；下游5′AGATGGTCACTGTCTGCCATGTGGGCTGCC-ACCCGGAAGAAGACCTCTC3′。
, 百拇医药
bcl-x扩增的目的片段有2个，即长片断bcl-xl(482 bp)和短片断bcl-xs (293 bp)，竞争片段长度为196 bp。Bax扩增的目的片段长度为436 bp，竞争片段为224 bp。引物由美国Cybersyn生物工程公司合成。
三、特定竞争性内参照 (internal standard, IS)的制备
制备方法参照文献[2]。利用HI后6 h的鼠脑组织标本提取RNA，逆转录成cDNA，然后用bcl-x或bax各自的内参照引物进行PCR扩增，2%琼脂糖凝胶电泳胶回收；再利用bcl-x或bax引物对稀释后的回收产物进行第2次PCR扩增，以提高纯度、增加得率。电泳、回收后定量。制备IS后用不同稀释度的IS与一定量的目的cDNA竞争，以选择IS的最佳竞争浓度。
四、快速竞争性逆转录PCR
采用上海华舜生物工程公司生产的柱离心式组织/细胞RNA抽提试剂盒提取RNA，PE Lamda 10紫外/可见光分光光度计定量及电泳确定RNA质量。取2 μg总RNA按逆转录试剂盒(Promega公司)说明进行逆转录。取3 μl 逆转录产物(cDNA)行PCR扩增。总反应体系为25 μl， 其中4×10 nmol/L dNTP 1 μl，12.5 pmol 的引物各1 μl，Taq DNA聚合酶1 U， bcl-x内参照为1 fg、bax内参照为2.5 fg。
, 百拇医药
五、统计学方法
数据以均数±标准差(
±s)表示。采用Kruskai-Wallis秩和检验，用Statistica 5.0 软件进行。
结果
一、特定竞争性内标量的确定
选择目的条带与竞争条带均较明显的电泳泳道含量(bcl-x为1 fg；bax 为2.5 fg), 即为竞争水平。
二、HI后鼠脑内bcl-x、bax基因表达动态变化
正常情况下，鼠脑内bcl-xs和bax mRNA的表达一般低于可检测水平。HI可诱导其表达增加。HI后6 h, 实验侧(HI侧)脑bax和 bcl-xs mRNA的表达开始明显增强，24 h达高峰，此后逐渐下降，7 d时其表达已低于可检测水平(表1)。而正常情况下bcl-xl mRNA在鼠脑内即有很强的表达(2.8±0.8)，HI对其表达无明显影响。
, 百拇医药
三、DEX对bcl-x、bax基因表达的调节作用
正常对照组及假手术给药组鼠脑内bcl-xs、bax mRNA的表达均低于可检测水平。预给药组其脑内bcl-xs 或bax mRNA的表达在2、6、12、24、48、72 h等观察点较HI组均呈明显下降或几乎完全被抑制(P<0.01)。而后给药组其脑内bax和 bcl-xs mRNA 的表达与HI组差异无显著性(P>0.05)。在脑HI后7d时各组bax和 bcl-xs mRNA的表达均已低于可检测水平(表1)。Bcl-xl mRNA则在各组均有较强表达，其在各组各观察点表达之间的差异均无显著性(P>0.05, 数据未显示)。
表1 不同处理组大鼠在脑HI后不同时间脑内 bcl-xs, bax mRNA的相对表达量(±s,fg/fg，n=5) 缺氧缺血
, 百拇医药
时间
bcl-xs mRNA
bax mRNA
Z组
J组
HI组
预给药组
后给药组
Z组
J组
HI组
预给药组
后给药组
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0 h
0
0
0.08±0.03
0
0.08±0.03
0
0
0
0
0
2 h
0
, 百拇医药 0
0.14±0.06
0.03±0.05*
0.13±0.07
0
0
0.18±0.06
0.03±0.05
0.19±0.07
6 h
0
0
, http://www.100md.com 0.56±0.11
0.09±0.10
0.57±0.10
0
0
0.47±0.14
0.08±0.10
0.47±0.14
12 h
0
0
1.17±0.31
0.19±0.23
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1.21±0.28
0
0
0.92±0.18
0.08±0.09
0.89±0.17
24 h
0
0
1.52±0.17
0.15±0.22
1.53±0.18
, http://www.100md.com 0
0
1.43±0.17
0.13±0.21
1.47±0.10
48 h
0
0
1.05±0.26
0.06±0.07
1.05±0.26
0
0
, 百拇医药
0.61±0.10
0.12±0.14
0.55±0.13
72 h
0
0
0.57±0.12
0.08±0.11
0.55±0.13
0
0
0.09±0.03
, 百拇医药 0.02±0.03
0.07±0.05
7 d
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
注：Z组代表正常对照组，J组代表假手术给药组。自2～72 h，预给药组与HI组比较，P<0.01 (*P<0.05); 预给药组与后给药组比较 P<0.01 (*P<0.05); HI组与后给药组比较 P>0.05讨论
, 百拇医药
新生动物脑HI后可引起许多基因表达的改变，从而引发一系列细胞凋亡。本研究结果表明，脑HI可诱导bcl-xs及bax mRNA过表达，二者都是促进细胞凋亡的相关基因。而且bcl-xs及bax mRNA过表达的高峰时相均位于脑HI后24 h左右。我们另外的研究以及国内外其他一些研究均与上述bcl-xs和 bax mRNA的表达高峰时相基本吻合。提示bax, bcl-xs mRNA 的过表达在脑HI后细胞凋亡的调控过程中起着重要作用。不过，Dixon等[3]的研究显示，脑缺血成年大鼠虽然其bcl-x mRNA表达显著增强，但其翻译产物bcl-xs与bcl-xl的比率甚低，说明bcl-xs蛋白合成量很少。因此，HI后bcl-xs基因及其编码的蛋白质在脑细胞凋亡调控过程中起到的作用可能是有限的。有人认为bcl-xl / bax的比值在确定生后中枢神经系统神经元凋亡阀方面起着关键作用[4]。本研究结果显示，HI对bcl-xl mRNA表达无影响，但HI诱导了bax mRNA表达的增强，因而bcl-xl / bax的比值降低，导致了脑细胞的凋亡，与上述观点相一致。
, 百拇医药
DEX为一人工合成的糖皮质激素，近年来一些实验研究表明，DEX预处理对HI新生动物具有神经保护作用，这种作用存在时间依赖性，即在HI前4～48 h内给予DEX具有神经保护作用，而在HI前3 h内及发生HI后应用DEX则无效[5]。其作用机制尚不清楚，但这种时间依赖性提示DEX的作用可能与基因水平的调控有关。本研究结果显示，DEX预处理可明显抑制HI对bax、bcl-xs mRNA过表达的诱导。而在HI后给予DEX则未能起到同样的作用。即刻早期基因c-jun可作为一种转录因子调节细胞内相应靶基因的表达，在对其后续靶基因的转录调节时，可能会触发死亡基因的转录。c-jun是一种重要的即刻早期基因，已有研究认为它在神经元凋亡中起着重要作用[6]。Macaya等[7]研究表明, 脑HI能诱导即c-jun过表达，而DEX预处理则能抑制HI对其的诱导，因此造成DEX作用的时间依赖性的原因也许可以解释为：脑HI诱导c-jun等即刻早期基因的过表达，继而触发死亡基因bax和bcl-xs等的转录，从而启动程序化细胞死亡过程。DEX预处理可抑制HI对c-jun等的诱导，故不能触发bax和bcl-xs等的转录，而使细胞免遭凋亡。但是，一旦HI诱导了c-jun等的表达，此时再用DEX则不能阻断程序化细胞死亡，因而不能起到神经保护作用。另外，电生理研究显示糖皮质激素可抑制中枢神经系统神经元活性。Liu等也观察到，经DEX预处理的鼠HI后，其缺血侧运动皮质神经元成熟及髓鞘形成均延迟，但不久即恢复至正常水平，认为DEX对HI鼠的保护作用乃是由于暂时抑制神经元的成熟所致[5]。因此，推测DEX对bax和bcl-xs基因表达的调节，也可能是神经元活性受到了DEX的暂时抑制，因而未能对HI产生应答，没有诱导bax和bcl-xs mRNA的过表达, 致使细胞免于凋亡。
, 百拇医药
参考文献
1，Rice JE, Vannucci RC, Brierley JB. The influence of immaturity on hypoxic-ischemic brain damage in the rat. Ann Neurol, 1981, 9:131-141.
2，Jiang YH, Davidson LA, Lupton JR, et al. Rapid competitive PCR determination of relative gene expression in limiting tissue samples. Clin Chem, 1996, 42:227-233.
3，Dixon EP, Stephenson DT, Clemens JA, et al. Bcl-Xshort is elevated following severe global ischemia in rat brains. Brain Res, 1997, 776:222-229.
, http://www.100md.com
4，Parsadanian AS, Cheng Y, Keller-Peck CR, et al. Bcl-xl is an antiapoptotic regulator for postnatal CNS neurons. J Neurosci, 1998, 18:1009-1019.
5，周伟, 吴圣楣. 地塞米松与围产期缺氧缺血性脑损伤. 国外医学妇幼保健分册, 1997, 8:166-168.
6，Estus S, Zaks WJ, Freeman RS, et al. Altered gene expression in neurons during programmed cell death: identification of c-jun as necessary for neuron apoptosis. J Cell Biol, 1994, 127: 1717-1727.
7，Macaya A, Munell F, Ferrer I, et al. Cell death and associated c-jun induction in perinatal hypoxia-ischemia. Effect of the neuroprotetive drug dexamethasone. Mol Brain Res,1998, 56:29-37.
(收稿日期：1999-06-15), 百拇医药
单位：周伟(200092 上海第二医科大学新华医院 上海市儿科医学研究所，现在广州，第一军医大学附属珠江医院儿科 5100282)；吴圣楣(200092 上海第二医科大学新华医院 上海市儿科医学研究所)；陈惠金(200092 上海第二医科大学新华医院 上海市儿科医学研究所)
关键词：脑缺氧；脑缺血；地塞米松；bcl-x；bax
中华儿科杂志000805 【摘要】 目的 探讨地塞米松(DEX)预处理对缺氧缺血(HI)新生大鼠脑保护作用的可能机制。方法 通过建立新生大鼠缺氧缺血性脑病(HIE)动物模型，应用快速竞争性RT-PCR技术，分别对HI、DEX预处理后于HI、缺氧结束后即刻予DEX、DEX加假手术、正常对照5组(每组40只鼠)动物的实验侧大脑组织中bcl-x (bcl-xl和bcl-xs)、bax mRNA的表达进行半定量分析。结果 脑HI后bcl-xs、bax mRNA的表达明显增强，并在HI后24 h左右达高峰(bcl-xs 1.52±0.17, bax 1.43±0.17)，在脑HI后2～72 h，DEX预处理组bcl-xs 、bax mRNA的表达水平(bcl-xs 0.03±0.05～ 0.19±0.23，bax 0.02±0.03～0.13±0.21)显著低于HI组(bcl-xs 0.14±0.06～1.52±0.17，bax 0.09±0.03～1.43±0.17)(P<0.01)，而HI后给予DEX组其bcl-xs 、bax mRNA的表达量(bcl-xs 0.13±0.07～1.53±0.18；bax 0.07±0.05～1.47±0.10)与HI组之间的差异无显著性(P>0.05)。DEX及HI对bcl-xl mRNA的表达无明显影响。结论 脑HI可诱导bcl-xs、bax mRNA过表达，这种过表达在脑HI后细胞凋亡的调控过程中可能起着重要作用。DEX预处理可通过抑制bcl-xs、bax mRNA的过表达起到抗细胞凋亡的作用。
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The regulatory effects of dexamethasone on mRNA expression of bcl-x and bax in neonatal rats with cerebral hypoxia-ischemia
ZHOU Wei，WU Shengmei，CHEN Huijin
(Xinhua Hospital, Shanghai Second Medical University, Shanghai Institute of Pediatrics, Shanghai 200092, China)
【Abstract】 Objective To explore the possible mechanisms of the neuroprotective effect of dexamethasone(DEX) on neonatal rats with cerebral hypoxia-ischemia. Methods The rapid competitive reverse transcriptase-PCR was used to analyze the expression of bcl-x (bcl-xl and bcl-xs) and bax mRNA at ipsilateral cerebral hemisphere semi-quantitatively in the neonatal rat model of hypoxia-ischemia(HI group), DEX treatment prior to hypoxia-ischemia(DH group), DEX treatment immediately following hypoxia-ischemia(HD group), DEX treatment prior to sham operation and normal controls, respectively. Results The expressions of bcl-x and bax mRNA in the ipsilateral hemisphere following cerebral hypoxia-ischemia increased significantly, and reached the peak level at 24 h (bcl-x was 1.52±0.17 and bax was 1.43±0.17). During 2 h to 72 h following hypoxia-ischemia, the expressions of bcl-x and bax mRNA in DH group (bcl-xs were significantly lower than those in HI group (bcl-xs: 0.03±0.05～ 0.19±0.23 versus 0.14±0.06～1.52±0.17, and bax: 0.02±0.03～0.13±0.21 versus 0.09±0.03～1.43±0.17, respectively, P<0.01). While there were no significant differences in the expressions of bcl-xs and bax mRNA between HD group (0.13±0.07～1.53±0.18 and 0.07±0.05～1.47±0.10, respectively) and HI group (P>0.05). DEX and HI had no evident effect on the expression of bcl-x mRNA. Conclusion Cerebral HI could induce the overexpressions of bax and bcl-x mRNA, which could play an important role in the regulation of apoptosis following cerebral HI. Pretreatment with DEX could exert the anti-apoptotic role by the down-regulation of bax and bcl-xs gene expressions.
, 百拇医药
【Key words】 Cerebral anoxia; Cerebral ischemia; Dexamethasone; Bcl-x; Bax
有资料表明，地塞米松(dexamethasone, DEX)预处理可以减少新生动物脑缺氧缺血(hypoxia ischemia, HI) 后所致的细胞凋亡。由于细胞凋亡受多种基因的调控，在哺乳动物中bcl-2 基因家族及其编码的蛋白质在细胞凋亡调控过程中起着重要作用。因此,本研究拟通过快速竞争性RT-PCR技术，探讨DEX对HI后新生大鼠脑内bcl-2基因家族中bcl-x、 bax mRNA表达的影响，以期阐明DEX预处理对HI新生大鼠(简称鼠)脑保护作用的可能机制。
材料和方法
一、鼠脑HI动物模型的制作和分组
参照Rice等[1]方法，将生后7天的SD大鼠(购自中国科学院上海实验动物中心)取仰卧位，颈正中切口，游离右侧颈总动脉并结扎，缝合切口后置于2 000 ml密闭容器，该容器置于37℃水浴中。以1～2 L/min的速度输入含8%氧气、92%氮气的混合气体，持续2.5 h。
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将200只鼠随机分为5组(每组40只)：(1)HI组；(2)预给药组(即腹腔注射DEX后12 h左右予HI);(3)后给药组(即缺氧结束后即刻予腹腔注射DEX)；(4)假手术给药组(即仅作颈正中切口，游离右侧颈总动脉，但不结扎，假手术前注射DEX)；(5)正常对照组。分别于缺氧结束后不同时间点(假手术给药组及正常对照组于相对应的时间点)0、2、6、12、24、48、72 h及7 d断颈处死(每个时间点5只)。自丘脑中1/3水平取HI侧(右侧)大脑半球组织约50 mg，置-80℃冰箱备用。DEX剂量为0.5 mg/kg，对照组注射0.9%氯化钠注射液。
二、引物的设计与合成
从基因文库中查到大白鼠bcl-x和bax基因cDNA序列，应用Oligo 5.0软件程序设计上、下游引物，另设计一个下游竞争引物(包含下游引物另加若干个碱基序列)。
bcl-x引物：上游 5′ATCAATGGCAACCCATCCT-GGCACC3′， 下游5′TTGAAACGCTCCTGGCCTTTCCG-GC3′；bcl-x内参照引物：上游同bcl-x 引物，下游5′ TTGAAACGCTCCTGGCCTTTCCGGCTCACTGAATGCTC-TCCGGTACCGC3′；bax 引物：上游5′ATCCAGGATC-GAGCAGGGAGGATGG3′，下游5′AGATGGTCACTGT-CTGCCATGTGGG3′；bax内参照引物：上游同bax 引物；下游5′AGATGGTCACTGTCTGCCATGTGGGCTGCC-ACCCGGAAGAAGACCTCTC3′。
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bcl-x扩增的目的片段有2个，即长片断bcl-xl(482 bp)和短片断bcl-xs (293 bp)，竞争片段长度为196 bp。Bax扩增的目的片段长度为436 bp，竞争片段为224 bp。引物由美国Cybersyn生物工程公司合成。
三、特定竞争性内参照 (internal standard, IS)的制备
制备方法参照文献[2]。利用HI后6 h的鼠脑组织标本提取RNA，逆转录成cDNA，然后用bcl-x或bax各自的内参照引物进行PCR扩增，2%琼脂糖凝胶电泳胶回收；再利用bcl-x或bax引物对稀释后的回收产物进行第2次PCR扩增，以提高纯度、增加得率。电泳、回收后定量。制备IS后用不同稀释度的IS与一定量的目的cDNA竞争，以选择IS的最佳竞争浓度。
四、快速竞争性逆转录PCR
采用上海华舜生物工程公司生产的柱离心式组织/细胞RNA抽提试剂盒提取RNA，PE Lamda 10紫外/可见光分光光度计定量及电泳确定RNA质量。取2 μg总RNA按逆转录试剂盒(Promega公司)说明进行逆转录。取3 μl 逆转录产物(cDNA)行PCR扩增。总反应体系为25 μl， 其中4×10 nmol/L dNTP 1 μl，12.5 pmol 的引物各1 μl，Taq DNA聚合酶1 U， bcl-x内参照为1 fg、bax内参照为2.5 fg。
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五、统计学方法
数据以均数±标准差(
±s)表示。采用Kruskai-Wallis秩和检验，用Statistica 5.0 软件进行。结果
一、特定竞争性内标量的确定
选择目的条带与竞争条带均较明显的电泳泳道含量(bcl-x为1 fg；bax 为2.5 fg), 即为竞争水平。
二、HI后鼠脑内bcl-x、bax基因表达动态变化
正常情况下，鼠脑内bcl-xs和bax mRNA的表达一般低于可检测水平。HI可诱导其表达增加。HI后6 h, 实验侧(HI侧)脑bax和 bcl-xs mRNA的表达开始明显增强，24 h达高峰，此后逐渐下降，7 d时其表达已低于可检测水平(表1)。而正常情况下bcl-xl mRNA在鼠脑内即有很强的表达(2.8±0.8)，HI对其表达无明显影响。
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三、DEX对bcl-x、bax基因表达的调节作用
正常对照组及假手术给药组鼠脑内bcl-xs、bax mRNA的表达均低于可检测水平。预给药组其脑内bcl-xs 或bax mRNA的表达在2、6、12、24、48、72 h等观察点较HI组均呈明显下降或几乎完全被抑制(P<0.01)。而后给药组其脑内bax和 bcl-xs mRNA 的表达与HI组差异无显著性(P>0.05)。在脑HI后7d时各组bax和 bcl-xs mRNA的表达均已低于可检测水平(表1)。Bcl-xl mRNA则在各组均有较强表达，其在各组各观察点表达之间的差异均无显著性(P>0.05, 数据未显示)。
表1 不同处理组大鼠在脑HI后不同时间脑内 bcl-xs, bax mRNA的相对表达量(
±s,fg/fg，n=5) 缺氧缺血, 百拇医药
时间
bcl-xs mRNA
bax mRNA
Z组
J组
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预给药组
后给药组
Z组
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HI组
预给药组
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, http://www.100md.com 0.56±0.11
0.09±0.10
0.57±0.10
0
0
0.47±0.14
0.08±0.10
0.47±0.14
12 h
0
0
1.17±0.31
0.19±0.23
, 百拇医药
1.21±0.28
0
0
0.92±0.18
0.08±0.09
0.89±0.17
24 h
0
0
1.52±0.17
0.15±0.22
1.53±0.18
, http://www.100md.com 0
0
1.43±0.17
0.13±0.21
1.47±0.10
48 h
0
0
1.05±0.26
0.06±0.07
1.05±0.26
0
0
, 百拇医药
0.61±0.10
0.12±0.14
0.55±0.13
72 h
0
0
0.57±0.12
0.08±0.11
0.55±0.13
0
0
0.09±0.03
, 百拇医药 0.02±0.03
0.07±0.05
7 d
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
注：Z组代表正常对照组，J组代表假手术给药组。自2～72 h，预给药组与HI组比较，P<0.01 (*P<0.05); 预给药组与后给药组比较 P<0.01 (*P<0.05); HI组与后给药组比较 P>0.05讨论
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新生动物脑HI后可引起许多基因表达的改变，从而引发一系列细胞凋亡。本研究结果表明，脑HI可诱导bcl-xs及bax mRNA过表达，二者都是促进细胞凋亡的相关基因。而且bcl-xs及bax mRNA过表达的高峰时相均位于脑HI后24 h左右。我们另外的研究以及国内外其他一些研究均与上述bcl-xs和 bax mRNA的表达高峰时相基本吻合。提示bax, bcl-xs mRNA 的过表达在脑HI后细胞凋亡的调控过程中起着重要作用。不过，Dixon等[3]的研究显示，脑缺血成年大鼠虽然其bcl-x mRNA表达显著增强，但其翻译产物bcl-xs与bcl-xl的比率甚低，说明bcl-xs蛋白合成量很少。因此，HI后bcl-xs基因及其编码的蛋白质在脑细胞凋亡调控过程中起到的作用可能是有限的。有人认为bcl-xl / bax的比值在确定生后中枢神经系统神经元凋亡阀方面起着关键作用[4]。本研究结果显示，HI对bcl-xl mRNA表达无影响，但HI诱导了bax mRNA表达的增强，因而bcl-xl / bax的比值降低，导致了脑细胞的凋亡，与上述观点相一致。
, 百拇医药
DEX为一人工合成的糖皮质激素，近年来一些实验研究表明，DEX预处理对HI新生动物具有神经保护作用，这种作用存在时间依赖性，即在HI前4～48 h内给予DEX具有神经保护作用，而在HI前3 h内及发生HI后应用DEX则无效[5]。其作用机制尚不清楚，但这种时间依赖性提示DEX的作用可能与基因水平的调控有关。本研究结果显示，DEX预处理可明显抑制HI对bax、bcl-xs mRNA过表达的诱导。而在HI后给予DEX则未能起到同样的作用。即刻早期基因c-jun可作为一种转录因子调节细胞内相应靶基因的表达，在对其后续靶基因的转录调节时，可能会触发死亡基因的转录。c-jun是一种重要的即刻早期基因，已有研究认为它在神经元凋亡中起着重要作用[6]。Macaya等[7]研究表明, 脑HI能诱导即c-jun过表达，而DEX预处理则能抑制HI对其的诱导，因此造成DEX作用的时间依赖性的原因也许可以解释为：脑HI诱导c-jun等即刻早期基因的过表达，继而触发死亡基因bax和bcl-xs等的转录，从而启动程序化细胞死亡过程。DEX预处理可抑制HI对c-jun等的诱导，故不能触发bax和bcl-xs等的转录，而使细胞免遭凋亡。但是，一旦HI诱导了c-jun等的表达，此时再用DEX则不能阻断程序化细胞死亡，因而不能起到神经保护作用。另外，电生理研究显示糖皮质激素可抑制中枢神经系统神经元活性。Liu等也观察到，经DEX预处理的鼠HI后，其缺血侧运动皮质神经元成熟及髓鞘形成均延迟，但不久即恢复至正常水平，认为DEX对HI鼠的保护作用乃是由于暂时抑制神经元的成熟所致[5]。因此，推测DEX对bax和bcl-xs基因表达的调节，也可能是神经元活性受到了DEX的暂时抑制，因而未能对HI产生应答，没有诱导bax和bcl-xs mRNA的过表达, 致使细胞免于凋亡。
, 百拇医药
参考文献
1，Rice JE, Vannucci RC, Brierley JB. The influence of immaturity on hypoxic-ischemic brain damage in the rat. Ann Neurol, 1981, 9:131-141.
2，Jiang YH, Davidson LA, Lupton JR, et al. Rapid competitive PCR determination of relative gene expression in limiting tissue samples. Clin Chem, 1996, 42:227-233.
3，Dixon EP, Stephenson DT, Clemens JA, et al. Bcl-Xshort is elevated following severe global ischemia in rat brains. Brain Res, 1997, 776:222-229.
, http://www.100md.com
4，Parsadanian AS, Cheng Y, Keller-Peck CR, et al. Bcl-xl is an antiapoptotic regulator for postnatal CNS neurons. J Neurosci, 1998, 18:1009-1019.
5，周伟, 吴圣楣. 地塞米松与围产期缺氧缺血性脑损伤. 国外医学妇幼保健分册, 1997, 8:166-168.
6，Estus S, Zaks WJ, Freeman RS, et al. Altered gene expression in neurons during programmed cell death: identification of c-jun as necessary for neuron apoptosis. J Cell Biol, 1994, 127: 1717-1727.
7，Macaya A, Munell F, Ferrer I, et al. Cell death and associated c-jun induction in perinatal hypoxia-ischemia. Effect of the neuroprotetive drug dexamethasone. Mol Brain Res,1998, 56:29-37.
(收稿日期：1999-06-15), 百拇医药