新生儿败血症细菌16SrRNA基因的分子生物学诊断
作者：尚世强 汪洁 洪文澜 俞惠民 孙眉月 滕懿群
单位：310003 杭州，浙江大学医学院儿童医院
关键词：
中华传染病杂志000213 新生儿败血症是严重的全身细菌感染性疾病，目前仍缺乏快速、准确的诊断方法。我们在16SrRNA基因内，自行设计引物，建立了16SrRNA基因聚合酶链反应(PCR)加反相杂交法诊断败血症新方法，取得了较好结果，现将结果报告如下。
材料与方法
一、临床资料
131例患儿系1996年3月～1997年3月间浙江大学医学院儿童医院拟诊为新生儿败血症的住院患儿。同时，对同期住院的非感染性疾病患儿30例抽血作为阴性对照组。按照1987年全国新生儿会议制定的《新生儿败血症诊断标准修订方案》[1]，败血症分为血培养阳性的确诊败血症及临床败血症。临床败血症指具有临床症状及实验室非特异诊断的5项指标中至少2项阳性者。这5项指标包括白细胞总数(WBC)，血小板(PLT)，中性粒细胞杆状核与分叶核比值(I/T)，C-反应蛋白(CRP)和微量血沉(mESR)。
, 百拇医药
二、检测菌株、人基因组(DNA)及病毒株
检测菌株选择1990年1月～1996年12月本院引起新生儿败血症常见的革兰阳性与革兰阴性细菌株20种，见表1。标准菌株、临床分离株、人基因组DNA及病毒株均由本院细菌室及感染实验室提供。
三、方法
(一) 标本DNA抽提 菌株DNA制备，用经典酚-氯仿抽提；临床血白细胞DNA抽提，采用本实验室建立的方法[2]。所有试剂均以0.22 μm孔径滤菌器过滤分装。抽血严格无菌操作。
(二) 16SrRNA基因引物及寡核苷酸探针的设计与合成 引物选自细菌16SrRNA基因保守区内，经计算机软件辅助设计，中国科学院上海细胞生物学研究所合成。同时设计3条寡核苷酸探针，分别是对所有细菌共有的通用探针，对革兰阳性菌特异的革兰阳性探针，对革兰阴性菌特异的革兰阴性探针。引物序列及有关参数见表2。引物5′端带有生物素基团，以便PCR扩增后进行反相杂交。
, 百拇医药
表1 20种标准菌株及临床分离株 种类
细菌
编号*
革兰阳性菌
金黄色葡萄球菌
SS279
表皮葡萄球菌
SS303
肺炎链球菌
ATCC33400
唾液链球菌
ATCC13419
, 百拇医药
血链球菌
ATCC10556
枯草杆菌
ATCC6051
易变微球菌
SS148
革兰阴性菌
大肠埃希菌
ATCC11775
产气肠杆菌
ATCC13048
奇异变形杆菌
, 百拇医药
SS1003
肺炎克雷伯菌
ATCC13883
费劳地枸橼酸杆菌
ATCC8090
铜绿假单胞菌
ATCC10145
流感嗜血杆菌
ATCC33391
粘质沙雷菌
SS987
痢疾志贺菌
, 百拇医药
SS777
鼠伤寒沙门菌
SS913
伤寒沙门菌
SS920
鲁氏不动杆菌
SS920
嗜水气单胞菌
ATCC7966
* ATCC为标准菌株，SS为本院临床分离株表2 16SrRNA基因引物及寡核苷酸探针序列及有关参数
序列5′-3′
, 百拇医药 长度(bp)
所在基因位置
引物1
5′-TGCGGTTGGAT-
CACCTCCT-3′
371
1521～1539
引物2
5′-TCCCCACCTT-
CCTCCAGTT-3′
1187～1169
通用探针
, 百拇医药
5′-CGGTGAATACGTT-
CCCGGGCCTTGTAC-3′
1368～1394
G+探针
5′-GACGTCAAATCAT-
CATGCCCCTTATGTC-3′
1189～1216
G探针
5′-GACGTAAGGGCCAT-
GATTGACGTC-3′
, 百拇医药
1189～1216
(三) 16SrRNA基因PCR实验程序 采用常规PCR扩增方法，每次反应均设阳性、阴性、空白对照。
(四) 反相杂交 先寡核苷酸加尾，取加尾后的通用探针、革兰阳性探针、革兰阴性探针各6 pmol点于尼龙膜(zeta-probe)上，置254 nmUV灯下照射固定10 min后进行杂交及洗膜、显色。
(五) 血培养及非特异5项指标 均按临床常规方法进行。
四、统计方法
各方法检测结果用配对计数资料比较。诊断方法的比较采用流行病学的诊断标准计算其灵敏度，特异度，拟然比及正确诊断指数。结果
一、16SrRNA基因PCR法的敏感性与特异性
, http://www.100md.com
用PCR法扩增20种检测菌株，经电泳在相当于371 bp处均可见一条DNA带。用人基因组DNA、巨细胞病毒扩增，未见阳性条带。说明与人基因组及病毒无交叉反应，对细菌具有较高的特异性。取大肠埃希菌所抽提的DNA作模板，1∶10定量稀释，PCR最小检出量为1 pg(10-12 g)。对20种检测菌株PCR产物进行反相杂交结果：20种菌株中，7株革兰阳性菌中，革兰阳性菌探针、通用探针阴性，革兰阴性探针阴性；13株革兰阴性菌中，革兰阴性菌探针、通用探针均阳性，革兰阳性菌探针阴性。反相杂交区分革兰阳性/革兰阴性菌结果与已知检测菌株全部符合。
二、新生儿外周血检测情况
131份血标本中，PCR法检测阳性率为41.9%(55/131)，血培养阳性率为17.6%(23/131)，PCR阳性检出率较血培养及非特异指标为高，见表3。经配对计数资料检验，差异有显著性(P值均<0.05)，见表4。说明PCR法较其他方法灵敏。30例非感染性疾病患儿PCR法检测均为阴性。若以血培养阳性加/或5项指标2项阳性为诊断标准，PCR法的灵敏度为88.9%(48/54)，特异性为90.9%(70/77)，拟然比为9.78，正确诊断指数达0.798。
, 百拇医药
表3 131份血标本各方法检测结果 标本数
细菌
培养
PCR
5项
指标
反相杂交
通用探针
G+探针
G探针
9
+
, 百拇医药 +
-
9
6
3
13
+
+
+
13
6
7
1
+
, 百拇医药
-
-
26
-
+
+
26
11
15
5
-
-
+
70
, 百拇医药
-
-
-
7
-
+
-
7
4
3
表4 16SrRNA基因PCR与其他方法细菌检测结果对照 PCR
总例数
血培养
, http://www.100md.com
5项指标*
阳性
阴性
阳性
阴性
阳性
55
22
33
39
16
阴性
76
, 百拇医药
1
75
5
71
合计
131
23
108
44
87
配对χ2
28.26
4.76
, 百拇医药
P<0.005
P<0.05
* 5项指标为CRP，mESR,WBC,PLT及I/T讨论
新生儿败血症临床上缺乏特异指征，血培养虽是重要的诊断依据，但阳性率不高，所需时间长，不能达到早期诊断的目的。我们在细菌16SrRNA基因保守区内自行设计引物，建立了可检测所有细菌的16SrRNA基因PCR法，对检测菌株及临床血标本、人基因组DNA及巨细胞病毒进行PCR法扩增，经实验证明具有高度的特异性与敏感性，PCR最小DNA检出量1 pg(相当于3个细菌)，所有检测菌株均获371 bp的阳性DNA条带，不与人基因组DNA及病毒交叉反应。而且检测快速，6～8 h即可报告。经临床标本检测证明，若以血培养阳性为确诊败血症、5项指标2法项阳性为临床败血症的诊断标准，PCR法的灵敏度为88.9%，特异性为90.9%，正确诊断指数达0.798，说明16SrRNA基因PCR是一种有相当潜力和前途的诊断方法。同时，PCR法结果可进一步进行反相杂交，以区分细菌系革兰阳性菌抑或革兰阴性菌，可以指导临床用药。从而达到：(1)早期快速诊断新生儿败血症；(2)明确病原菌系革兰阳性或革兰阴性菌，为临床使用何类抗生素提供参考。
, http://www.100md.com
本组PCR法阳性率为41.9%，血培养17.6%，5项非特异指标2项阳性为33.6%，PCR法阳性率高于血培养和其它方法。说明PCR法能够发现其它方法无法查到的细菌感染。131例患者中，23例血培养阳性为确诊败血症，31例系临床败血症，共计诊断败血症者为54例。在这54例败血症中，PCR法检测阳性48例，6例PCR法阴性。分析6例PCR法阴性原因可能为PCR体系中血红蛋白等抑制物存在较多[3]，或抽提过程中细菌DNA的丢失[4]而导致PCR法假阴性。也不排除非特异性检查指标误诊临床败血症的可能。Philip报道根据5项指标2项阳性诊断败血症的病例中，有13%的假阳性。
血培养阴性及不符合临床败血症的患儿77例，PCR法检测阴性者70例，阳性7例。分析7例PCR法检测与常规败血症诊断不符合的原因，可能由于：(1)存在某些要求特殊培养条件的细菌，如L型等或无法培养的细菌[5]；(2)非特异性指标有假阴性的可能，Echeverria等[3，6]报道约有7%为假阴性结果；(3)在PCR法操作过程中有发生污染的可能性。
, 百拇医药
综上所述，结合病史和临床表现，16SrRNA基因扩增加反相杂交可为新生儿败血症的诊断提供一种快速的病原学辅助诊断依据。
本课题由浙江省自然科学基金(396457)及省卫生厅人才基金资助
参考文献
1，吴仕孝.新生儿败血症诊断标准修订方案.中华儿科杂志，1988，26：163-164.
2，尚世强，洪文澜，石一复，等.孕妇巨细胞病毒、弓形虫感染及其可能导致宫内的传播.中华传染病杂志，1996，14：152-156.
3，Echeverria P,Sethabutr O,Serichantalergs O.Modern diagnosis(with molecular tests) of acute infectious diarrhea. Gastroenterol Clin North Am, 1993,22:661-668.
, 百拇医药
4，Geha DJ,Uhl JR,Gustaferro CA,et al.Multiplex PCR for identification of methicillin-resistant staphylococci in the clinical laboratory.J Clin Microbiol,1994,32:1768-1772.
5，Relman DA,Schmidt TM,MacDermott RP,et al.Identification of the uncultured bacillus of whipple's disease.N Engl J Med,1992,327: 293-301.
6，Naber SP.Molecular pothology-diagnosis of infectious disease.N Engl J Med,1994, 331:1212-1215.
收稿日期：1999-08-25, 百拇医药
单位：310003 杭州，浙江大学医学院儿童医院
关键词：
中华传染病杂志000213 新生儿败血症是严重的全身细菌感染性疾病，目前仍缺乏快速、准确的诊断方法。我们在16SrRNA基因内，自行设计引物，建立了16SrRNA基因聚合酶链反应(PCR)加反相杂交法诊断败血症新方法，取得了较好结果，现将结果报告如下。
材料与方法
一、临床资料
131例患儿系1996年3月～1997年3月间浙江大学医学院儿童医院拟诊为新生儿败血症的住院患儿。同时，对同期住院的非感染性疾病患儿30例抽血作为阴性对照组。按照1987年全国新生儿会议制定的《新生儿败血症诊断标准修订方案》[1]，败血症分为血培养阳性的确诊败血症及临床败血症。临床败血症指具有临床症状及实验室非特异诊断的5项指标中至少2项阳性者。这5项指标包括白细胞总数(WBC)，血小板(PLT)，中性粒细胞杆状核与分叶核比值(I/T)，C-反应蛋白(CRP)和微量血沉(mESR)。
, 百拇医药
二、检测菌株、人基因组(DNA)及病毒株
检测菌株选择1990年1月～1996年12月本院引起新生儿败血症常见的革兰阳性与革兰阴性细菌株20种，见表1。标准菌株、临床分离株、人基因组DNA及病毒株均由本院细菌室及感染实验室提供。
三、方法
(一) 标本DNA抽提 菌株DNA制备，用经典酚-氯仿抽提；临床血白细胞DNA抽提，采用本实验室建立的方法[2]。所有试剂均以0.22 μm孔径滤菌器过滤分装。抽血严格无菌操作。
(二) 16SrRNA基因引物及寡核苷酸探针的设计与合成 引物选自细菌16SrRNA基因保守区内，经计算机软件辅助设计，中国科学院上海细胞生物学研究所合成。同时设计3条寡核苷酸探针，分别是对所有细菌共有的通用探针，对革兰阳性菌特异的革兰阳性探针，对革兰阴性菌特异的革兰阴性探针。引物序列及有关参数见表2。引物5′端带有生物素基团，以便PCR扩增后进行反相杂交。
, 百拇医药
表1 20种标准菌株及临床分离株 种类
细菌
编号*
革兰阳性菌
金黄色葡萄球菌
SS279
表皮葡萄球菌
SS303
肺炎链球菌
ATCC33400
唾液链球菌
ATCC13419
, 百拇医药
血链球菌
ATCC10556
枯草杆菌
ATCC6051
易变微球菌
SS148
革兰阴性菌
大肠埃希菌
ATCC11775
产气肠杆菌
ATCC13048
奇异变形杆菌
, 百拇医药
SS1003
肺炎克雷伯菌
ATCC13883
费劳地枸橼酸杆菌
ATCC8090
铜绿假单胞菌
ATCC10145
流感嗜血杆菌
ATCC33391
粘质沙雷菌
SS987
痢疾志贺菌
, 百拇医药
SS777
鼠伤寒沙门菌
SS913
伤寒沙门菌
SS920
鲁氏不动杆菌
SS920
嗜水气单胞菌
ATCC7966
* ATCC为标准菌株，SS为本院临床分离株表2 16SrRNA基因引物及寡核苷酸探针序列及有关参数
序列5′-3′
, 百拇医药 长度(bp)
所在基因位置
引物1
5′-TGCGGTTGGAT-
CACCTCCT-3′
371
1521～1539
引物2
5′-TCCCCACCTT-
CCTCCAGTT-3′
1187～1169
通用探针
, 百拇医药
5′-CGGTGAATACGTT-
CCCGGGCCTTGTAC-3′
1368～1394
G+探针
5′-GACGTCAAATCAT-
CATGCCCCTTATGTC-3′
1189～1216
G探针
5′-GACGTAAGGGCCAT-
GATTGACGTC-3′
, 百拇医药
1189～1216
(三) 16SrRNA基因PCR实验程序 采用常规PCR扩增方法，每次反应均设阳性、阴性、空白对照。
(四) 反相杂交 先寡核苷酸加尾，取加尾后的通用探针、革兰阳性探针、革兰阴性探针各6 pmol点于尼龙膜(zeta-probe)上，置254 nmUV灯下照射固定10 min后进行杂交及洗膜、显色。
(五) 血培养及非特异5项指标 均按临床常规方法进行。
四、统计方法
各方法检测结果用配对计数资料比较。诊断方法的比较采用流行病学的诊断标准计算其灵敏度，特异度，拟然比及正确诊断指数。结果
一、16SrRNA基因PCR法的敏感性与特异性
, http://www.100md.com
用PCR法扩增20种检测菌株，经电泳在相当于371 bp处均可见一条DNA带。用人基因组DNA、巨细胞病毒扩增，未见阳性条带。说明与人基因组及病毒无交叉反应，对细菌具有较高的特异性。取大肠埃希菌所抽提的DNA作模板，1∶10定量稀释，PCR最小检出量为1 pg(10-12 g)。对20种检测菌株PCR产物进行反相杂交结果：20种菌株中，7株革兰阳性菌中，革兰阳性菌探针、通用探针阴性，革兰阴性探针阴性；13株革兰阴性菌中，革兰阴性菌探针、通用探针均阳性，革兰阳性菌探针阴性。反相杂交区分革兰阳性/革兰阴性菌结果与已知检测菌株全部符合。
二、新生儿外周血检测情况
131份血标本中，PCR法检测阳性率为41.9%(55/131)，血培养阳性率为17.6%(23/131)，PCR阳性检出率较血培养及非特异指标为高，见表3。经配对计数资料检验，差异有显著性(P值均<0.05)，见表4。说明PCR法较其他方法灵敏。30例非感染性疾病患儿PCR法检测均为阴性。若以血培养阳性加/或5项指标2项阳性为诊断标准，PCR法的灵敏度为88.9%(48/54)，特异性为90.9%(70/77)，拟然比为9.78，正确诊断指数达0.798。
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表3 131份血标本各方法检测结果 标本数
细菌
培养
PCR
5项
指标
反相杂交
通用探针
G+探针
G探针
9
+
, 百拇医药 +
-
9
6
3
13
+
+
+
13
6
7
1
+
, 百拇医药
-
-
26
-
+
+
26
11
15
5
-
-
+
70
, 百拇医药
-
-
-
7
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+
-
7
4
3
表4 16SrRNA基因PCR与其他方法细菌检测结果对照 PCR
总例数
血培养
, http://www.100md.com
5项指标*
阳性
阴性
阳性
阴性
阳性
55
22
33
39
16
阴性
76
, 百拇医药
1
75
5
71
合计
131
23
108
44
87
配对χ2
28.26
4.76
, 百拇医药
P<0.005
P<0.05
* 5项指标为CRP，mESR,WBC,PLT及I/T讨论
新生儿败血症临床上缺乏特异指征，血培养虽是重要的诊断依据，但阳性率不高，所需时间长，不能达到早期诊断的目的。我们在细菌16SrRNA基因保守区内自行设计引物，建立了可检测所有细菌的16SrRNA基因PCR法，对检测菌株及临床血标本、人基因组DNA及巨细胞病毒进行PCR法扩增，经实验证明具有高度的特异性与敏感性，PCR最小DNA检出量1 pg(相当于3个细菌)，所有检测菌株均获371 bp的阳性DNA条带，不与人基因组DNA及病毒交叉反应。而且检测快速，6～8 h即可报告。经临床标本检测证明，若以血培养阳性为确诊败血症、5项指标2法项阳性为临床败血症的诊断标准，PCR法的灵敏度为88.9%，特异性为90.9%，正确诊断指数达0.798，说明16SrRNA基因PCR是一种有相当潜力和前途的诊断方法。同时，PCR法结果可进一步进行反相杂交，以区分细菌系革兰阳性菌抑或革兰阴性菌，可以指导临床用药。从而达到：(1)早期快速诊断新生儿败血症；(2)明确病原菌系革兰阳性或革兰阴性菌，为临床使用何类抗生素提供参考。
, http://www.100md.com
本组PCR法阳性率为41.9%，血培养17.6%，5项非特异指标2项阳性为33.6%，PCR法阳性率高于血培养和其它方法。说明PCR法能够发现其它方法无法查到的细菌感染。131例患者中，23例血培养阳性为确诊败血症，31例系临床败血症，共计诊断败血症者为54例。在这54例败血症中，PCR法检测阳性48例，6例PCR法阴性。分析6例PCR法阴性原因可能为PCR体系中血红蛋白等抑制物存在较多[3]，或抽提过程中细菌DNA的丢失[4]而导致PCR法假阴性。也不排除非特异性检查指标误诊临床败血症的可能。Philip报道根据5项指标2项阳性诊断败血症的病例中，有13%的假阳性。
血培养阴性及不符合临床败血症的患儿77例，PCR法检测阴性者70例，阳性7例。分析7例PCR法检测与常规败血症诊断不符合的原因，可能由于：(1)存在某些要求特殊培养条件的细菌，如L型等或无法培养的细菌[5]；(2)非特异性指标有假阴性的可能，Echeverria等[3，6]报道约有7%为假阴性结果；(3)在PCR法操作过程中有发生污染的可能性。
, 百拇医药
综上所述，结合病史和临床表现，16SrRNA基因扩增加反相杂交可为新生儿败血症的诊断提供一种快速的病原学辅助诊断依据。
本课题由浙江省自然科学基金(396457)及省卫生厅人才基金资助
参考文献
1，吴仕孝.新生儿败血症诊断标准修订方案.中华儿科杂志，1988，26：163-164.
2，尚世强，洪文澜，石一复，等.孕妇巨细胞病毒、弓形虫感染及其可能导致宫内的传播.中华传染病杂志，1996，14：152-156.
3，Echeverria P,Sethabutr O,Serichantalergs O.Modern diagnosis(with molecular tests) of acute infectious diarrhea. Gastroenterol Clin North Am, 1993,22:661-668.
, 百拇医药
4，Geha DJ,Uhl JR,Gustaferro CA,et al.Multiplex PCR for identification of methicillin-resistant staphylococci in the clinical laboratory.J Clin Microbiol,1994,32:1768-1772.
5，Relman DA,Schmidt TM,MacDermott RP,et al.Identification of the uncultured bacillus of whipple's disease.N Engl J Med,1992,327: 293-301.
6，Naber SP.Molecular pothology-diagnosis of infectious disease.N Engl J Med,1994, 331:1212-1215.
收稿日期：1999-08-25, 百拇医药