金纳多对非协调性异种大鼠肝移植缺血再灌注损伤的防治作用
作者：张群华 芮晓晖 蔡端 孙鹏 张延龄
单位：200040 上海医科大学附属华山医院外科
关键词：银杏；异种；肝移植；微循环
中华医学杂志000924 【摘要】 目的 探讨金纳多对非协调性异种肝移植缺血再灌注损伤的防治作用。方法 对豚鼠和SD大鼠非协调性异种肝移植进行金纳多(银杏黄酮配糖体)注射液治疗的分析，实验分为术前、术后金纳多治疗组和对照组，观察异种肝移植后肝脏和心脏的病理变化以及肝脏门脉血流变化。结果肝移植术后，两组的肝脏和心脏病理变化相似，肝内小血管腔内血小板、中性粒细胞聚集和纤维蛋白沉着造成广泛血栓，引起血管阻塞和组织梗死。心肌细胞破坏，心肌纤维排列紊乱。而术前金纳多治疗组，移植肝内小血管血小板和中性粒细胞聚集程度减轻，心肌细胞损害也明显好转。多普勒超声检测发现金纳多可以减轻异种肝移植后肝脏的灌注障碍。结论 金纳多对非协调性异种肝移植缺血再灌注损伤有保护作用。并减轻其超急性排斥反应，对临床异种肝移植的开展有潜在的应用价值。
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Protective effect of Ginaton on rat liver microcirculation disturbance following liver xenotransplantation
ZHANG Qunhua
(Department of Surgery, Huashan Hospital, Shanghai Medical University, Shanghai 200040, China)
RUI Xiaohui
(Department of Surgery, Huashan Hospital, Shanghai Medical University, Shanghai 200040, China)
CAI Duan, et al.
, 百拇医药
(Department of Surgery, Huashan Hospital, Shanghai Medical University, Shanghai 200040, China)
【Abstract】 Objective To study the effect of Ginaton on liver microcirculation disturbance following liver xenotransplantation in rats. Methods Ginaton was injected intravenously to recipients at a dosage of 14 mg/kg before graftng liver of guinea pigs. The portal blood flow(PBF) was measured by Doppler ultrasound at 0, 30 and 60 minutes after transplantation, and the pathologic changes of liver and heart were observed. Results The reperfusion status of control group was poor and leukocyte infiltration appeared in the center of lobute following transplantation and myocardial cells were impaired. Significant reduction in PBF was found in rats following transplantation. Ginaton pretreatment distinctly ameliorated PBF. The speed of PBF was closely correlated with the pathologic changes following transplantation. Conclusion In the process of liver transplantation, ischemia reperfusion damage may lead to xenoheptic microcirculaton disturbance. Ginaton could improve the xenoheptic microcirculation and reduce ischemic reperfusion damage.
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【Key words】 Ginaton; Liver xenotransplantation; Microcirculation
异种肝移植超急性排斥反应和缺血再灌注研究是当今移植外科的前沿课题，关于金纳多(银杏黄酮配糖体)注射液对非协调性异种肝移植缺血再灌注损伤的保护作用国内外尚少见报道。作者旨在对异种肝移植中金纳多的保护作用机理作一初步探讨，以期改善异种肝移植缺血再灌注损伤。
材料与方法
一、材料
1.实验动物：供体雄性豚鼠，体重200～250 g，受体为雄性SD大鼠，体重250～300 g供体动物术前不禁食水，受体动物术前8 h禁食但不禁水。实验动物随机配对分为3组：大鼠移植前金纳多治疗组、移植后金纳多治疗组和对照组，每组各进行10对豚鼠至大鼠异种肝移植。
, 百拇医药
2.异种肝移植模型的建立：采用王轩等人进行同种肝移植的缝合法[1]进行豚鼠至大鼠的异种肝移植。各组在供、受体的体重、供体手术时间、套管准备时间、受体手术时间、无肝期等方面均差异无显著意义。
二、方法
1.采用德国威玛舒培大药厂生产的金纳多(Ginaton)注射液，移植前治疗组于术前30 min经阴茎背静脉注射金纳多14 mg*kg-1*min-1；移植后治疗组于术后肝下下腔静脉接通后同法注射金纳多；对照组于术前30 min经阴茎背静脉注射生理盐水1 ml。
2.组织学及超微结构的观察：在受体SD大鼠门静脉开放后60 min观察供肝血流灌注情况，肝脏尾状叶和心脏左心室肌多点取样分别作HE染色，组织学和透视电镜超微结构检查。
3.多普勒超声检测：动物麻醉后至取肝前，以Imexlab9100多普勒超声诊断仪的8 mHz探头(产品号X1-9008)正对血流方向，与血管成30～45度夹角，测定移植肝的门脉血流(PBF)，听取多普勒声音变化，记录测得波形和波幅。测定时采用单向血流方式，避免静脉回流的干扰，同时开启滤波功能，减少杂波影响。分别测定门脉接通后0、30、60 min时的PBF。
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结果
1.金纳多对移植肝缺血再灌注的影响：(1) 对照组：门静脉开放后供肝呈现由肝脏中央开始的逐步充血，可见斑片状灌注，肝脏灌注明显障碍。(2) 金纳多移植前治疗组：门静脉开放后供肝灌注较对照组充分、均匀，肝脏灌注障碍有所改善。(3) 金纳多移植后治疗组：肝脏灌注同对照组，用药后并无改善。
2.金纳多对移植肝排斥反应的影响：(1) 对照组：可见到肝血窦内血小板和粒细胞聚集，广泛血栓形成，肝细胞变性(图1)。(2) 金纳多移植前治疗组：肝血窦内血小板和粒细胞聚集减少，肝细胞轻度肿胀(图2)。(3) 金纳多移植后治疗组：与对照组相似。
3.金纳多对肝脏和心脏细胞超微结构变化的影响：(1) 对照组：肝细胞线粒体明显肿胀，嵴破坏，结构紊乱，内质网扩张、脱粒，肝细胞狄氏间隙消失，肝细胞窦状隙可见到血小板和粒细胞粘附，血栓形成，部分内皮细胞消失(图3)；心肌细胞肿胀，肌原纤维排列紊乱、疏松化、断裂，线粒体呈多形性，大小不等。(2) 金纳多移植前治疗组：肝细胞线粒体肿胀减轻，窦状隙血小板减少，内皮细胞较完整(图4)；心肌细胞结构较正常，肌原纤维排列较整齐，线粒体轻度肿胀。金纳多移植后治疗组：肝细胞及心肌细胞改变与对照组无区别。
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4.金纳多对移植肝门脉血流变化的影响：豚鼠至大鼠异种肝移植后，开始时3组波幅均在0.4 kHz左右，移植后60 min金纳多移植前治疗组移植肝PBF的多普勒声音强度(0.21 kHz)比对照组(0.145 kHz)和金纳多移植后治疗组(0.135 kHz)升高(声音大)，说明门脉血流量增加，流速增快，各组波幅有相应变化。结果显示：随着移植后时间的推移，移植肝门脉的血流灌注逐渐减少，在金纳多移植前治疗组这种减少较为缓慢。
讨论
超急性排斥反应是异种肝移植的重要障碍，该反应对机体和移植肝的损害极大。超急性排斥反应是由于移植肝细胞膜上的抗原和受体的循环抗体之间发生对抗所致。移植肝可以有小血管腔内存在大量血小板、中性粒细胞聚集和纤维蛋白的沉着所造成的广泛血栓、血管阻塞和组织梗死。重要的是移植肝缺血后肝组织的灌注停止，肝细胞缺氧，ATP生成减少，产生一系列损伤，再灌注时，富氧血流进入损伤后的肝组织，可产生进一步损伤，其主要是典是黄嘌呤氧化酶系统激活及吞噬细胞“呼吸爆发”作用，产生大量氧自由基，除了直接肝细胞损伤外，氧自由基还可引发一系列复杂的生物活性分子的产生和反应：如吞噬细胞的激活、内毒素释放、补体激活、花生四烯酸代谢激活(生成前列腺素、血栓素等)。同时，由于门脉阻断、肠道淤血，可产生肠道细菌移位，进入淋巴及微循环，无需质疑，这一系列的反应可以加重移植肝的损伤和多器官功能障碍(MODS)。由此可见移植肝的存活不仅与超急性排斥反应有关，而且与缺血再灌注后产生的一系列生物活性分子有关。所以减轻移植肝缺血再灌注损伤的程度对防治超急性排斥反应是极为重要的[2，3]。
, 百拇医药
图1 对照组广泛血栓形成，肝细胞变性 HE ×400
图2 金纳多移植前治疗组肝细胞轻度肿胀，血栓形成减少 HE ×400
图3 对照组肝细胞内质网扩张，线粒体肿胀 ×4 000
图4 金纳多移植前治疗组肝细胞线粒体肿胀减轻 ×3 000
金纳多(Ginaton)含有银杏黄酮配糖体，具有清除体内的自由基和抑制脂质过氧化的形成，从而保护细胞膜免于自由基所造成的一系列损伤；降低全血粘稠度，增进红细胞及白细胞的可塑性，从而改善微循环及大循环；增加缺血组织葡萄糖与氧的供应量；通过刺激儿茶酚胺的释放和抑制其破坏来维持动脉和静脉血管的张力，经由刺激前列环素和内皮舒张因子的生成产生动脉舒张作用。本研究结果表明，异种肝移植的供肝再灌注早期存在大量血小板聚集导致微血栓形成，而这种血小板聚集可释放大量TXA2、白三烯、血小板激活因子等炎性介质，可参与移植肝超急性排斥反应。已知TXA2具有强烈的缩血管作用，并促成血小板凝集、粒细胞聚集与脱颗粒反应，增加肝血管通透性与肝血管阻力、微血栓形成并加重组织灌注不良。金纳多可以作为拮抗物质，其生物活性使得血小板聚集与微血栓形成减少，可能会减少肝内TXA2的生成，从而起到预防或减少再灌注损伤的作用。
, 百拇医药
基金项目：为上海市科委重点基金资助项目(98XD14002)
参考文献
1，王轩，杨甲酶，严以群，等.大鼠原位肝移植不同术式的探讨.中华器官移植杂志，1998，4：76-78.
2，Linke R, Wngner F, Hammer C. Analysis of the microcirculation during xenogeneic liver perfusion in the guinea pig-rat model. The contribution of leukocytes to the rejection proc. Transpl Int, 1998, 11 Suppl 1S457-460.
3，Settaf A, Meriggi F, Van de Stadt J, et al. Delayed rejection of liver xenografts compared to heart xenografts in the rat. Transplant Proc, 1987, 19:1155-1156.
(收稿日期：1999-10-18), 百拇医药
单位：200040 上海医科大学附属华山医院外科
关键词：银杏；异种；肝移植；微循环
中华医学杂志000924 【摘要】 目的 探讨金纳多对非协调性异种肝移植缺血再灌注损伤的防治作用。方法 对豚鼠和SD大鼠非协调性异种肝移植进行金纳多(银杏黄酮配糖体)注射液治疗的分析，实验分为术前、术后金纳多治疗组和对照组，观察异种肝移植后肝脏和心脏的病理变化以及肝脏门脉血流变化。结果肝移植术后，两组的肝脏和心脏病理变化相似，肝内小血管腔内血小板、中性粒细胞聚集和纤维蛋白沉着造成广泛血栓，引起血管阻塞和组织梗死。心肌细胞破坏，心肌纤维排列紊乱。而术前金纳多治疗组，移植肝内小血管血小板和中性粒细胞聚集程度减轻，心肌细胞损害也明显好转。多普勒超声检测发现金纳多可以减轻异种肝移植后肝脏的灌注障碍。结论 金纳多对非协调性异种肝移植缺血再灌注损伤有保护作用。并减轻其超急性排斥反应，对临床异种肝移植的开展有潜在的应用价值。
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Protective effect of Ginaton on rat liver microcirculation disturbance following liver xenotransplantation
ZHANG Qunhua
(Department of Surgery, Huashan Hospital, Shanghai Medical University, Shanghai 200040, China)
RUI Xiaohui
(Department of Surgery, Huashan Hospital, Shanghai Medical University, Shanghai 200040, China)
CAI Duan, et al.
, 百拇医药
(Department of Surgery, Huashan Hospital, Shanghai Medical University, Shanghai 200040, China)
【Abstract】 Objective To study the effect of Ginaton on liver microcirculation disturbance following liver xenotransplantation in rats. Methods Ginaton was injected intravenously to recipients at a dosage of 14 mg/kg before graftng liver of guinea pigs. The portal blood flow(PBF) was measured by Doppler ultrasound at 0, 30 and 60 minutes after transplantation, and the pathologic changes of liver and heart were observed. Results The reperfusion status of control group was poor and leukocyte infiltration appeared in the center of lobute following transplantation and myocardial cells were impaired. Significant reduction in PBF was found in rats following transplantation. Ginaton pretreatment distinctly ameliorated PBF. The speed of PBF was closely correlated with the pathologic changes following transplantation. Conclusion In the process of liver transplantation, ischemia reperfusion damage may lead to xenoheptic microcirculaton disturbance. Ginaton could improve the xenoheptic microcirculation and reduce ischemic reperfusion damage.
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【Key words】 Ginaton; Liver xenotransplantation; Microcirculation
异种肝移植超急性排斥反应和缺血再灌注研究是当今移植外科的前沿课题，关于金纳多(银杏黄酮配糖体)注射液对非协调性异种肝移植缺血再灌注损伤的保护作用国内外尚少见报道。作者旨在对异种肝移植中金纳多的保护作用机理作一初步探讨，以期改善异种肝移植缺血再灌注损伤。
材料与方法
一、材料
1.实验动物：供体雄性豚鼠，体重200～250 g，受体为雄性SD大鼠，体重250～300 g供体动物术前不禁食水，受体动物术前8 h禁食但不禁水。实验动物随机配对分为3组：大鼠移植前金纳多治疗组、移植后金纳多治疗组和对照组，每组各进行10对豚鼠至大鼠异种肝移植。
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2.异种肝移植模型的建立：采用王轩等人进行同种肝移植的缝合法[1]进行豚鼠至大鼠的异种肝移植。各组在供、受体的体重、供体手术时间、套管准备时间、受体手术时间、无肝期等方面均差异无显著意义。
二、方法
1.采用德国威玛舒培大药厂生产的金纳多(Ginaton)注射液，移植前治疗组于术前30 min经阴茎背静脉注射金纳多14 mg*kg-1*min-1；移植后治疗组于术后肝下下腔静脉接通后同法注射金纳多；对照组于术前30 min经阴茎背静脉注射生理盐水1 ml。
2.组织学及超微结构的观察：在受体SD大鼠门静脉开放后60 min观察供肝血流灌注情况，肝脏尾状叶和心脏左心室肌多点取样分别作HE染色，组织学和透视电镜超微结构检查。
3.多普勒超声检测：动物麻醉后至取肝前，以Imexlab9100多普勒超声诊断仪的8 mHz探头(产品号X1-9008)正对血流方向，与血管成30～45度夹角，测定移植肝的门脉血流(PBF)，听取多普勒声音变化，记录测得波形和波幅。测定时采用单向血流方式，避免静脉回流的干扰，同时开启滤波功能，减少杂波影响。分别测定门脉接通后0、30、60 min时的PBF。
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结果
1.金纳多对移植肝缺血再灌注的影响：(1) 对照组：门静脉开放后供肝呈现由肝脏中央开始的逐步充血，可见斑片状灌注，肝脏灌注明显障碍。(2) 金纳多移植前治疗组：门静脉开放后供肝灌注较对照组充分、均匀，肝脏灌注障碍有所改善。(3) 金纳多移植后治疗组：肝脏灌注同对照组，用药后并无改善。
2.金纳多对移植肝排斥反应的影响：(1) 对照组：可见到肝血窦内血小板和粒细胞聚集，广泛血栓形成，肝细胞变性(图1)。(2) 金纳多移植前治疗组：肝血窦内血小板和粒细胞聚集减少，肝细胞轻度肿胀(图2)。(3) 金纳多移植后治疗组：与对照组相似。
3.金纳多对肝脏和心脏细胞超微结构变化的影响：(1) 对照组：肝细胞线粒体明显肿胀，嵴破坏，结构紊乱，内质网扩张、脱粒，肝细胞狄氏间隙消失，肝细胞窦状隙可见到血小板和粒细胞粘附，血栓形成，部分内皮细胞消失(图3)；心肌细胞肿胀，肌原纤维排列紊乱、疏松化、断裂，线粒体呈多形性，大小不等。(2) 金纳多移植前治疗组：肝细胞线粒体肿胀减轻，窦状隙血小板减少，内皮细胞较完整(图4)；心肌细胞结构较正常，肌原纤维排列较整齐，线粒体轻度肿胀。金纳多移植后治疗组：肝细胞及心肌细胞改变与对照组无区别。
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4.金纳多对移植肝门脉血流变化的影响：豚鼠至大鼠异种肝移植后，开始时3组波幅均在0.4 kHz左右，移植后60 min金纳多移植前治疗组移植肝PBF的多普勒声音强度(0.21 kHz)比对照组(0.145 kHz)和金纳多移植后治疗组(0.135 kHz)升高(声音大)，说明门脉血流量增加，流速增快，各组波幅有相应变化。结果显示：随着移植后时间的推移，移植肝门脉的血流灌注逐渐减少，在金纳多移植前治疗组这种减少较为缓慢。
讨论
超急性排斥反应是异种肝移植的重要障碍，该反应对机体和移植肝的损害极大。超急性排斥反应是由于移植肝细胞膜上的抗原和受体的循环抗体之间发生对抗所致。移植肝可以有小血管腔内存在大量血小板、中性粒细胞聚集和纤维蛋白的沉着所造成的广泛血栓、血管阻塞和组织梗死。重要的是移植肝缺血后肝组织的灌注停止，肝细胞缺氧，ATP生成减少，产生一系列损伤，再灌注时，富氧血流进入损伤后的肝组织，可产生进一步损伤，其主要是典是黄嘌呤氧化酶系统激活及吞噬细胞“呼吸爆发”作用，产生大量氧自由基，除了直接肝细胞损伤外，氧自由基还可引发一系列复杂的生物活性分子的产生和反应：如吞噬细胞的激活、内毒素释放、补体激活、花生四烯酸代谢激活(生成前列腺素、血栓素等)。同时，由于门脉阻断、肠道淤血，可产生肠道细菌移位，进入淋巴及微循环，无需质疑，这一系列的反应可以加重移植肝的损伤和多器官功能障碍(MODS)。由此可见移植肝的存活不仅与超急性排斥反应有关，而且与缺血再灌注后产生的一系列生物活性分子有关。所以减轻移植肝缺血再灌注损伤的程度对防治超急性排斥反应是极为重要的[2，3]。
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图1 对照组广泛血栓形成，肝细胞变性 HE ×400
图2 金纳多移植前治疗组肝细胞轻度肿胀，血栓形成减少 HE ×400
图3 对照组肝细胞内质网扩张，线粒体肿胀 ×4 000
图4 金纳多移植前治疗组肝细胞线粒体肿胀减轻 ×3 000
金纳多(Ginaton)含有银杏黄酮配糖体，具有清除体内的自由基和抑制脂质过氧化的形成，从而保护细胞膜免于自由基所造成的一系列损伤；降低全血粘稠度，增进红细胞及白细胞的可塑性，从而改善微循环及大循环；增加缺血组织葡萄糖与氧的供应量；通过刺激儿茶酚胺的释放和抑制其破坏来维持动脉和静脉血管的张力，经由刺激前列环素和内皮舒张因子的生成产生动脉舒张作用。本研究结果表明，异种肝移植的供肝再灌注早期存在大量血小板聚集导致微血栓形成，而这种血小板聚集可释放大量TXA2、白三烯、血小板激活因子等炎性介质，可参与移植肝超急性排斥反应。已知TXA2具有强烈的缩血管作用，并促成血小板凝集、粒细胞聚集与脱颗粒反应，增加肝血管通透性与肝血管阻力、微血栓形成并加重组织灌注不良。金纳多可以作为拮抗物质，其生物活性使得血小板聚集与微血栓形成减少，可能会减少肝内TXA2的生成，从而起到预防或减少再灌注损伤的作用。
, 百拇医药
基金项目：为上海市科委重点基金资助项目(98XD14002)
参考文献
1，王轩，杨甲酶，严以群，等.大鼠原位肝移植不同术式的探讨.中华器官移植杂志，1998，4：76-78.
2，Linke R, Wngner F, Hammer C. Analysis of the microcirculation during xenogeneic liver perfusion in the guinea pig-rat model. The contribution of leukocytes to the rejection proc. Transpl Int, 1998, 11 Suppl 1S457-460.
3，Settaf A, Meriggi F, Van de Stadt J, et al. Delayed rejection of liver xenografts compared to heart xenografts in the rat. Transplant Proc, 1987, 19:1155-1156.
(收稿日期：1999-10-18), 百拇医药