成纤维细胞与纤连蛋白粘附及其诱导的酪氨酸磷酸化蛋白在硬皮病原胶原基因表达中的作用
作者:洪微 廖万清 孔宪涛 陈敏亮
单位:200003上海,第二军医大学附属长征医院
关键词:硬皮病;成纤维细胞;酪氨酸磷酸化
中华皮肤科杂志990408
【摘要】目的 研究硬皮病成纤维细胞与纤连蛋白粘附,以及粘附诱导的酪氨酸磷酸化蛋白在成纤维细胞表达原胶原mRNA中的作用。方法 将硬皮病成纤维细胞置于纤连蛋白包被的培养体系中粘附培养,运用RT-PCR、免疫印迹法分别检测原胶原mRNA表达的变化及粘附诱导的酪氨酸磷酸化蛋白;并观察阻断酪氨酸磷酸化后,原胶原mRNA和酪氨酸磷酸化蛋白的变化。结果 硬皮病成纤维细胞与纤连蛋白粘附,可诱导相对分子质量为98000、65000酪氨酸磷酸化蛋白生成,且原胶原proα1(Ⅰ)mRNA的表达显著增加;经酪氨酸激酶抑制剂作用后,伴随着相对分子质量为98000、65000酪氨酸磷酸化蛋白的减少,原胶原proα1(Ⅰ)mRNA显著降低。结论 成纤维细胞与纤连蛋白粘附,在硬皮病原胶原表达增加中具有重要作用,由粘附诱导的酪氨酸磷酸化是其中的一个重要环节。
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Role of Adhesion Between Fibroblasts and Fibronectin and Tyrosine Phosphorylated Proteins Induced by the Adhesion on the Expression of
Procollagen in Scleroderma
HONG Wei, LIAO Wanqing, KONG Xiantao, et al
.Department of Dermatology, Changzheng Hospital, Second Military Medical University,Shanghai 200003
【Abstract】 Objective In order to investigate the role of adhesion between fibronectin and fibroblasts from scleroderma as well as tyrosine phosphorylated proteins induced by the adhesion on procollagen mRNA expression. Methods Fibroblasts from lesions of scleroderma were cultured in culture bottles absorbed with fibronectin. The levels of procollagen α1(I) mRNA and tyrosine phosphorylated proteins induced by the adhesion were detected by RT-PCR and immunoblotting, respectively. An inhibitor of tyrosine kinase, herbimycin A, was added to the medium to block the phosphorylation of tyrosine. The changes of procollagen mRNA and tyrosine phosphorylated proteins were further investigated. Results Adhesion between scleroderma fibroblasts and fibronectin not only induced the production of 98 000 and 65 000 tyrosine phosphorylated proteins, but also enhanced obviously the expression of procollagen α1(I) mRNA. When the phosphorylation of tyrosine was blocked, the level of procollagen α1(I) mRNA decreased significantly with the reduction of 98 000, 65 000 tyrosine phosphorylated proteins. Conclusion Adhesion between fibronectin and the fibroblasts plays an important role in enhanced expression of procollagen mRNA in scleroderma. Phosphorylation of tyrosine seems to be a key step in the process of expression of procollagen mRNA.
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【Key words】 Scleroderma Fibroblasts Tyrosine phosphorylation
细胞外基质(ECM)-细胞间粘附作用在纤维化过程中具有重要意义,并且这种作用涉及到一系列细胞内信号转导过程,目前对于这方面的报道甚少。我们以硬皮病皮损成纤维细胞(FB)为靶细胞,将FB置于包被了纤连蛋白(Fn)的培养瓶中培养,检测粘附前后原胶原表达的变化以及Fn-FB粘附诱导的酪氨酸磷酸化蛋白,并观察阻断酪氨酸磷酸化后,原胶原表达和酪氨酸磷酸化蛋白的变化,从而探讨粘附及其诱导的酪氨酸磷酸化蛋白在硬皮病FB原胶原基因表达中的作用。
材料和方法
一、材料
1.病例:硬皮病患者10例,为1995年9月至1996年11月在本院皮肤科就诊的患者,经临床及病理证实。其中男2例,女8例;年龄9~46岁,平均年龄28.2岁;病程2~16个月不等。
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2.主要试剂:人血浆Fn、抑蛋白酶肽(牛胰Kunniz抑制剂)、苯甲酰磺酰氟(PMSF)均购于GibcoBRL公司;抗磷酸酪氨酸单抗、酪氨酸激酶抑制剂除莠霉素(herbimycinA)购于美国CalbiochemNovabiochem公司;Taq聚合酶购于宝灵曼公司;蛋白电泳低分子量Marker、PVDF膜及3mm滤纸购于华顺生物试剂公司。细胞悬浮缓冲液、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(8%分离胶、5%积层胶)、凝胶加样缓冲液、Tris-甘氨酸电泳缓冲液、考马斯亮蓝染色液、脱色液、转移缓冲液及DAB显色液配方参见《分子克隆》[1]。
3.引物:由中国科学院生化所合成,PAGE纯化,其序列如下:proα1(Ⅰ):5′-CCTGGCAAAGATGCACTC-3′,3′-GAAATTGTCTCCCATTTTTTTGGC-5′;GADPH:5′-GCAATCTGCATGTGTCTGTG-3′,3′-TTACCCAGGCTGAGTACTGCT-5′。
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4.反转录试剂盒、LSAB组合试剂盒分别购于宝灵曼公司和Dako公司。
二、方法
1.硬皮病皮损FB的培养:采用组织块法培养,具体步骤参见文献[2]。
2.Fn-FB粘附:将Fn溶于DMEM,浓度为100μg/mL,加入培养瓶中使瓶底恰好铺满,4℃过夜,使用前PBS冲洗2次。将约2×106FB分别置于Fn包被的2个培养瓶内,5%CO2孵箱孵育,1瓶30min后收集细胞提取蛋白,另1瓶6h后收集细胞提取RNA。
3.HerbimycinA对酪氨酸磷酸化的抑制:将2×106FB分别置Fn包被的2个培养瓶内,5%CO2孵箱孵育15min后,加入100μmol/L除莠霉素A,5%CO2孵箱继续孵育,1瓶30min后收集细胞提取蛋白;另1瓶继续孵育6h后收集细胞提取RNA。
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4.蛋白质的提取及聚丙烯酰胺凝胶电泳:收集的细胞经PBS洗涤2遍后,加入5倍体积细胞悬浮缓冲液重悬细胞,再加入等体积2×SDS凝胶加样缓冲液,置沸水浴10min,立即以最大超声功率剪切DNA2min,离心10000r/min10min,吸取上清液,置-20℃保存备用。取等量蛋白进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(8%分离胶,5%积层胶),详细步骤参见《分子克隆》。
5.免疫印迹检测酪氨酸磷酸化蛋白,采用电转移法,参照《分子克隆》所述电转移法步骤,将聚丙烯酰胺凝胶电泳产物转移至PVDF膜上(200mA电流电转移4h),经丽春红S染色鉴定转膜成功后,将滤膜自然干燥,再用5%脱脂牛奶封闭,置分子杂交仪中室温2h;PBS洗后加入4mL抗磷酸酪氨酸单抗(2μg/mL),再置分子杂交仪中室温2h;PBS洗后将膜置PBS中浸泡5min,2次;再加入4mL牛奶、1mLPBS及HRP-抗小鼠二抗(2μg/mL),置分子杂交仪中室温2h;PBS洗后,将膜浸泡于PBS中5min,2次。最后加入新鲜配制的DAB显色液,避光显色,观察结果并拍照。
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6.RT-PCR检测原胶原proα1(Ⅰ)mRNA:
(1)RNA的提取及反转录:提取RNA(参照《分子克隆》),变性琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA完整性,紫外分光光度计定量。取RNA5μg,加入oligo(dT)1μL,DEPC处理水至体积12μL,依照GibcoBRL公司反转录试剂盒说明书进行反转录。
(2)PCRproα1(Ⅰ)及GADPH:取反转录产物cDNA2μL,引物以100μLTE溶解后,各取1μL,10×PCR缓冲液2μL,10mmol/LdNTP1μL,Taq酶2U,25mmol/LMgCL21.6μL(终浓度2.0mmol/L),加水至终体积为20μL,混匀、离心,以矿物油覆盖,详见文献[2]。
7.计算机图象分析:RTPCR产物分析详见文献[2]。免疫印迹结果分析采用计算机图象分析计算面积灰度值。
, 百拇医药 8.统计学处理:配对计量资料的t检验。
结果
1.Fn-FB粘附诱导的酪氨酸磷酸化蛋白:免疫印迹检测Fn-FB粘附诱导的酪氨酸磷酸化蛋白,结果表明Fn-FB粘附可诱导生成相对分子质量为98000酪氨酸磷酸化蛋白(pp98)、pp65和pp40,未与Fn粘附的FB仅可检出pp40。如图1所示。
1:蛋白电泳Marker,2:未粘附组,3:纤连蛋白-成纤维细胞粘附组,4:纤连蛋白-成纤维细胞-除莠霉素A组
图1 酪氨酸磷酸化蛋白的免疫印迹分析
2.Fn-FB粘附对FB原胶原proα1(Ⅰ)mRNA表达的影响:FB置包被Fn培养瓶内培养6h,RT-PCR检测FB原胶原proα(Ⅰ)mRNA水平(5.48±0.44)较未与Fn粘附组(2.86±0.77)显著增多(t=4.696,P<0.01),图2。
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1:DNAMarker:λ/EcRⅠ+HindⅢ,2:未粘附组,3:纤连蛋白-成纤维细胞粘附组,4:纤连蛋白-成纤维细胞-除莠霉素A组
图2 RT-PCR检测原胶原proα1(Ⅰ)mRNA表达的电泳照
3.酪氨酸激酶抑制剂除莠霉素A对FB酪氨酸磷酸化的影响:FB在包被Fn培养瓶内与除莠霉素A共孵育30min,免疫印迹仅可检测到pp98,对其进行计算机灰度扫描量化,面积灰度值均数为9.87±0.93,较Fn-FB粘附组11.99±0.89显著减少(t=1.88,P<0.05)
4.抑制酪氨酸磷酸化对FB原胶原proα(Ⅰ)mRNA表达的影响:FB在包被Fn培养瓶内与除莠霉素A共孵育6h,RT-PCR检测FB原胶原proα(Ⅰ)mRNA水平,结果表明Fn-FB-除莠霉素组FB合成原胶原proα1(Ⅰ)mRNA(3.17±0.18)较Fn-FB组(5.48±0.44)显著减少(t=16.94,P<0.01)
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讨论
ECM与细胞间相互作用主要是由粘附分子整合素家族所介导,并涉及一系列细胞内信号传导过程,主要包括酪氨酸激酶系统、丝氨酸-苏氨酸激酶家族、调节细胞内Ca++水平以及作用于Na+—H+泵调节细胞内H+浓度等[3]。Lin等[4]发现单核细胞粘附于培养皿或Fn、层粘连蛋白、Ⅰ型胶原、Ⅳ型胶原15min后相对分子质量70000酪氨酸磷酸化蛋白快速而显著的增加,30min达峰值,伴随着酪氨酸磷酸化蛋白的增加,单核细胞表达IL-1β也明显增多,并且抗整合素单抗或其F(ab)2片段也能诱导上述效应,从而证明了酪氨酸磷酸化蛋白是整合素介导的粘附过程中单核细胞IL-1β基因诱导的一个重要环节。
关于粘附与原胶原基因表达间的关系,Dhawn等[5,6]发现使小鼠3T3成纤维细胞悬浮生长时,未检测到Ⅰ型原胶原mRNA,而当其粘附于培养皿生长时,原胶原proα1(Ⅰ)、proα1(Ⅲ)mRNA在6h内可增加达10倍。我们曾运用反义核苷酸技术证明阻断硬皮病皮损FB整合素表达后,皮损FB原胶原proα1(Ⅰ)、proα1(Ⅲ)mRNA合成明显减少[2]。本文进一步对FB与Fn粘附及其诱导的细胞内酪氨酸磷酸化蛋白,以及它们在硬皮病原胶原基因表达中的作用进行了探讨。当FB与Fn粘附后,30min内可诱导pp98、pp65生成,6h后,可检出原胶原proα1(Ⅰ)mRNA显著增加。进一步运用酪氨酸激酶抑制剂除莠霉素A阻断酪氨酸磷酸化过程,pp98显著减少,pp60未检出(可能因为抑制后量太少);并且经除莠霉素A抑制酪氨酸磷酸化后,FB合成原胶原proα1(Ⅰ)mRNA也较Fn-FB粘附组显著减少。而除莠霉素A对FB表面整合素的表达无影响(本文未报告此结果),说明除莠霉素A对原胶原表达的抑制并非通过阻断整合素的表达这一环节,也排除了原胶原表达减少是除莠霉素A的毒性作用。上述结果提示Fn-FB粘附在硬皮病原胶原基因表达增强中具有重要作用,并且与粘附所诱导的酪氨酸磷酸化蛋白密切相关。
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国家自然科学基金资助项目(39670673)
参考文献
1J.萨姆布克,EF.弗里奇,J.爱尼阿蒂斯,著.金冬雁,黎孟枫等译.分子克隆实验指南.第2版.北京:科学技术出版社,1992.
2洪微,廖万清,孔宪涛,等.整合素表达对硬皮病成纤维细胞合成原胶原的影响.中华皮肤科杂志,1998,31:227-229.
3 Clark EA, Brugge JS. Integrins and signal transduction pathways: the road taken. Science, 1995,268:233- 239.
4 Lin TH, Yurochko A, Kornberg L, et al. The role of protein tyrosine phosphorylation in integrin-mediated gene induction in monocytes. J Cell Biol, 1994,126:1585- 1593.
, 百拇医药
5 Dhawn J, Farmer SR. Regulation of α 1(Ⅰ)- collagen gene expression in response to cell adhesion in Swiss 3T3 fibroblasts. J Biol Chem, 1990,265:9015- 9021.
6 Dhawn J, Lichtler AC, Rowe DW, et al. Cell adhesion regulates proα 1(Ⅰ) collagen mRNA stability and transcription in mouse fibroblasts. J Biol Chem, 1991,266:8470- 8475.
收稿:1998-07-16修回:1998-11-26, 百拇医药
单位:200003上海,第二军医大学附属长征医院
关键词:硬皮病;成纤维细胞;酪氨酸磷酸化
中华皮肤科杂志990408
【摘要】目的 研究硬皮病成纤维细胞与纤连蛋白粘附,以及粘附诱导的酪氨酸磷酸化蛋白在成纤维细胞表达原胶原mRNA中的作用。方法 将硬皮病成纤维细胞置于纤连蛋白包被的培养体系中粘附培养,运用RT-PCR、免疫印迹法分别检测原胶原mRNA表达的变化及粘附诱导的酪氨酸磷酸化蛋白;并观察阻断酪氨酸磷酸化后,原胶原mRNA和酪氨酸磷酸化蛋白的变化。结果 硬皮病成纤维细胞与纤连蛋白粘附,可诱导相对分子质量为98000、65000酪氨酸磷酸化蛋白生成,且原胶原proα1(Ⅰ)mRNA的表达显著增加;经酪氨酸激酶抑制剂作用后,伴随着相对分子质量为98000、65000酪氨酸磷酸化蛋白的减少,原胶原proα1(Ⅰ)mRNA显著降低。结论 成纤维细胞与纤连蛋白粘附,在硬皮病原胶原表达增加中具有重要作用,由粘附诱导的酪氨酸磷酸化是其中的一个重要环节。
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Role of Adhesion Between Fibroblasts and Fibronectin and Tyrosine Phosphorylated Proteins Induced by the Adhesion on the Expression of
Procollagen in Scleroderma
HONG Wei, LIAO Wanqing, KONG Xiantao, et al
.Department of Dermatology, Changzheng Hospital, Second Military Medical University,Shanghai 200003
【Abstract】 Objective In order to investigate the role of adhesion between fibronectin and fibroblasts from scleroderma as well as tyrosine phosphorylated proteins induced by the adhesion on procollagen mRNA expression. Methods Fibroblasts from lesions of scleroderma were cultured in culture bottles absorbed with fibronectin. The levels of procollagen α1(I) mRNA and tyrosine phosphorylated proteins induced by the adhesion were detected by RT-PCR and immunoblotting, respectively. An inhibitor of tyrosine kinase, herbimycin A, was added to the medium to block the phosphorylation of tyrosine. The changes of procollagen mRNA and tyrosine phosphorylated proteins were further investigated. Results Adhesion between scleroderma fibroblasts and fibronectin not only induced the production of 98 000 and 65 000 tyrosine phosphorylated proteins, but also enhanced obviously the expression of procollagen α1(I) mRNA. When the phosphorylation of tyrosine was blocked, the level of procollagen α1(I) mRNA decreased significantly with the reduction of 98 000, 65 000 tyrosine phosphorylated proteins. Conclusion Adhesion between fibronectin and the fibroblasts plays an important role in enhanced expression of procollagen mRNA in scleroderma. Phosphorylation of tyrosine seems to be a key step in the process of expression of procollagen mRNA.
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【Key words】 Scleroderma Fibroblasts Tyrosine phosphorylation
细胞外基质(ECM)-细胞间粘附作用在纤维化过程中具有重要意义,并且这种作用涉及到一系列细胞内信号转导过程,目前对于这方面的报道甚少。我们以硬皮病皮损成纤维细胞(FB)为靶细胞,将FB置于包被了纤连蛋白(Fn)的培养瓶中培养,检测粘附前后原胶原表达的变化以及Fn-FB粘附诱导的酪氨酸磷酸化蛋白,并观察阻断酪氨酸磷酸化后,原胶原表达和酪氨酸磷酸化蛋白的变化,从而探讨粘附及其诱导的酪氨酸磷酸化蛋白在硬皮病FB原胶原基因表达中的作用。
材料和方法
一、材料
1.病例:硬皮病患者10例,为1995年9月至1996年11月在本院皮肤科就诊的患者,经临床及病理证实。其中男2例,女8例;年龄9~46岁,平均年龄28.2岁;病程2~16个月不等。
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2.主要试剂:人血浆Fn、抑蛋白酶肽(牛胰Kunniz抑制剂)、苯甲酰磺酰氟(PMSF)均购于GibcoBRL公司;抗磷酸酪氨酸单抗、酪氨酸激酶抑制剂除莠霉素(herbimycinA)购于美国CalbiochemNovabiochem公司;Taq聚合酶购于宝灵曼公司;蛋白电泳低分子量Marker、PVDF膜及3mm滤纸购于华顺生物试剂公司。细胞悬浮缓冲液、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(8%分离胶、5%积层胶)、凝胶加样缓冲液、Tris-甘氨酸电泳缓冲液、考马斯亮蓝染色液、脱色液、转移缓冲液及DAB显色液配方参见《分子克隆》[1]。
3.引物:由中国科学院生化所合成,PAGE纯化,其序列如下:proα1(Ⅰ):5′-CCTGGCAAAGATGCACTC-3′,3′-GAAATTGTCTCCCATTTTTTTGGC-5′;GADPH:5′-GCAATCTGCATGTGTCTGTG-3′,3′-TTACCCAGGCTGAGTACTGCT-5′。
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4.反转录试剂盒、LSAB组合试剂盒分别购于宝灵曼公司和Dako公司。
二、方法
1.硬皮病皮损FB的培养:采用组织块法培养,具体步骤参见文献[2]。
2.Fn-FB粘附:将Fn溶于DMEM,浓度为100μg/mL,加入培养瓶中使瓶底恰好铺满,4℃过夜,使用前PBS冲洗2次。将约2×106FB分别置于Fn包被的2个培养瓶内,5%CO2孵箱孵育,1瓶30min后收集细胞提取蛋白,另1瓶6h后收集细胞提取RNA。
3.HerbimycinA对酪氨酸磷酸化的抑制:将2×106FB分别置Fn包被的2个培养瓶内,5%CO2孵箱孵育15min后,加入100μmol/L除莠霉素A,5%CO2孵箱继续孵育,1瓶30min后收集细胞提取蛋白;另1瓶继续孵育6h后收集细胞提取RNA。
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4.蛋白质的提取及聚丙烯酰胺凝胶电泳:收集的细胞经PBS洗涤2遍后,加入5倍体积细胞悬浮缓冲液重悬细胞,再加入等体积2×SDS凝胶加样缓冲液,置沸水浴10min,立即以最大超声功率剪切DNA2min,离心10000r/min10min,吸取上清液,置-20℃保存备用。取等量蛋白进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(8%分离胶,5%积层胶),详细步骤参见《分子克隆》。
5.免疫印迹检测酪氨酸磷酸化蛋白,采用电转移法,参照《分子克隆》所述电转移法步骤,将聚丙烯酰胺凝胶电泳产物转移至PVDF膜上(200mA电流电转移4h),经丽春红S染色鉴定转膜成功后,将滤膜自然干燥,再用5%脱脂牛奶封闭,置分子杂交仪中室温2h;PBS洗后加入4mL抗磷酸酪氨酸单抗(2μg/mL),再置分子杂交仪中室温2h;PBS洗后将膜置PBS中浸泡5min,2次;再加入4mL牛奶、1mLPBS及HRP-抗小鼠二抗(2μg/mL),置分子杂交仪中室温2h;PBS洗后,将膜浸泡于PBS中5min,2次。最后加入新鲜配制的DAB显色液,避光显色,观察结果并拍照。
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6.RT-PCR检测原胶原proα1(Ⅰ)mRNA:
(1)RNA的提取及反转录:提取RNA(参照《分子克隆》),变性琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA完整性,紫外分光光度计定量。取RNA5μg,加入oligo(dT)1μL,DEPC处理水至体积12μL,依照GibcoBRL公司反转录试剂盒说明书进行反转录。
(2)PCRproα1(Ⅰ)及GADPH:取反转录产物cDNA2μL,引物以100μLTE溶解后,各取1μL,10×PCR缓冲液2μL,10mmol/LdNTP1μL,Taq酶2U,25mmol/LMgCL21.6μL(终浓度2.0mmol/L),加水至终体积为20μL,混匀、离心,以矿物油覆盖,详见文献[2]。
7.计算机图象分析:RTPCR产物分析详见文献[2]。免疫印迹结果分析采用计算机图象分析计算面积灰度值。
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结果
1.Fn-FB粘附诱导的酪氨酸磷酸化蛋白:免疫印迹检测Fn-FB粘附诱导的酪氨酸磷酸化蛋白,结果表明Fn-FB粘附可诱导生成相对分子质量为98000酪氨酸磷酸化蛋白(pp98)、pp65和pp40,未与Fn粘附的FB仅可检出pp40。如图1所示。
1:蛋白电泳Marker,2:未粘附组,3:纤连蛋白-成纤维细胞粘附组,4:纤连蛋白-成纤维细胞-除莠霉素A组
图1 酪氨酸磷酸化蛋白的免疫印迹分析
2.Fn-FB粘附对FB原胶原proα1(Ⅰ)mRNA表达的影响:FB置包被Fn培养瓶内培养6h,RT-PCR检测FB原胶原proα(Ⅰ)mRNA水平(5.48±0.44)较未与Fn粘附组(2.86±0.77)显著增多(t=4.696,P<0.01),图2。
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1:DNAMarker:λ/EcRⅠ+HindⅢ,2:未粘附组,3:纤连蛋白-成纤维细胞粘附组,4:纤连蛋白-成纤维细胞-除莠霉素A组
图2 RT-PCR检测原胶原proα1(Ⅰ)mRNA表达的电泳照
3.酪氨酸激酶抑制剂除莠霉素A对FB酪氨酸磷酸化的影响:FB在包被Fn培养瓶内与除莠霉素A共孵育30min,免疫印迹仅可检测到pp98,对其进行计算机灰度扫描量化,面积灰度值均数为9.87±0.93,较Fn-FB粘附组11.99±0.89显著减少(t=1.88,P<0.05)
4.抑制酪氨酸磷酸化对FB原胶原proα(Ⅰ)mRNA表达的影响:FB在包被Fn培养瓶内与除莠霉素A共孵育6h,RT-PCR检测FB原胶原proα(Ⅰ)mRNA水平,结果表明Fn-FB-除莠霉素组FB合成原胶原proα1(Ⅰ)mRNA(3.17±0.18)较Fn-FB组(5.48±0.44)显著减少(t=16.94,P<0.01)
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讨论
ECM与细胞间相互作用主要是由粘附分子整合素家族所介导,并涉及一系列细胞内信号传导过程,主要包括酪氨酸激酶系统、丝氨酸-苏氨酸激酶家族、调节细胞内Ca++水平以及作用于Na+—H+泵调节细胞内H+浓度等[3]。Lin等[4]发现单核细胞粘附于培养皿或Fn、层粘连蛋白、Ⅰ型胶原、Ⅳ型胶原15min后相对分子质量70000酪氨酸磷酸化蛋白快速而显著的增加,30min达峰值,伴随着酪氨酸磷酸化蛋白的增加,单核细胞表达IL-1β也明显增多,并且抗整合素单抗或其F(ab)2片段也能诱导上述效应,从而证明了酪氨酸磷酸化蛋白是整合素介导的粘附过程中单核细胞IL-1β基因诱导的一个重要环节。
关于粘附与原胶原基因表达间的关系,Dhawn等[5,6]发现使小鼠3T3成纤维细胞悬浮生长时,未检测到Ⅰ型原胶原mRNA,而当其粘附于培养皿生长时,原胶原proα1(Ⅰ)、proα1(Ⅲ)mRNA在6h内可增加达10倍。我们曾运用反义核苷酸技术证明阻断硬皮病皮损FB整合素表达后,皮损FB原胶原proα1(Ⅰ)、proα1(Ⅲ)mRNA合成明显减少[2]。本文进一步对FB与Fn粘附及其诱导的细胞内酪氨酸磷酸化蛋白,以及它们在硬皮病原胶原基因表达中的作用进行了探讨。当FB与Fn粘附后,30min内可诱导pp98、pp65生成,6h后,可检出原胶原proα1(Ⅰ)mRNA显著增加。进一步运用酪氨酸激酶抑制剂除莠霉素A阻断酪氨酸磷酸化过程,pp98显著减少,pp60未检出(可能因为抑制后量太少);并且经除莠霉素A抑制酪氨酸磷酸化后,FB合成原胶原proα1(Ⅰ)mRNA也较Fn-FB粘附组显著减少。而除莠霉素A对FB表面整合素的表达无影响(本文未报告此结果),说明除莠霉素A对原胶原表达的抑制并非通过阻断整合素的表达这一环节,也排除了原胶原表达减少是除莠霉素A的毒性作用。上述结果提示Fn-FB粘附在硬皮病原胶原基因表达增强中具有重要作用,并且与粘附所诱导的酪氨酸磷酸化蛋白密切相关。
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国家自然科学基金资助项目(39670673)
参考文献
1J.萨姆布克,EF.弗里奇,J.爱尼阿蒂斯,著.金冬雁,黎孟枫等译.分子克隆实验指南.第2版.北京:科学技术出版社,1992.
2洪微,廖万清,孔宪涛,等.整合素表达对硬皮病成纤维细胞合成原胶原的影响.中华皮肤科杂志,1998,31:227-229.
3 Clark EA, Brugge JS. Integrins and signal transduction pathways: the road taken. Science, 1995,268:233- 239.
4 Lin TH, Yurochko A, Kornberg L, et al. The role of protein tyrosine phosphorylation in integrin-mediated gene induction in monocytes. J Cell Biol, 1994,126:1585- 1593.
, 百拇医药
5 Dhawn J, Farmer SR. Regulation of α 1(Ⅰ)- collagen gene expression in response to cell adhesion in Swiss 3T3 fibroblasts. J Biol Chem, 1990,265:9015- 9021.
6 Dhawn J, Lichtler AC, Rowe DW, et al. Cell adhesion regulates proα 1(Ⅰ) collagen mRNA stability and transcription in mouse fibroblasts. J Biol Chem, 1991,266:8470- 8475.
收稿:1998-07-16修回:1998-11-26, 百拇医药