成纤维细胞生长因子受体1(FGFR-1)基因在人肠癌组织中的变化*
作者：常雅萍 苗传龙 冯乐平 娄刚毅 于永利q/#s*, 百拇医药
单位：常雅萍、苗传龙、于永利( 白求恩医科大学免疫学教研室 长春 130012)； 冯乐平、娄刚毅( 吉林省肿瘤防治研究所)q/#s*, 百拇医药
关键词：FGFR-1基因 结肠癌 Southern杂交q/#s*, 百拇医药
免疫学杂志990205摘 要 为观察人FGFR-1基因变化与结肠癌发生的关系。采用RT-PCR法从人肺成纤维细胞中钓取FGFR-1全编码区cDNA，用此cDNA探针与人肠癌及癌旁组织DNA进行Southern印迹分析。结果表明：与癌旁组织相比结肠癌组织Southern印迹图谱发生了改变。提示PGFR-1基因变化与肠癌发生可能存在一定相关性。q/#s*, 百拇医药
中图号 R735.3，Q7q/#s*, 百拇医药
CHANGES OF FGFR-1 GENOMIC DNA IN HUMANq/#s*, 百拇医药
COLORECTAL CARCINOMAq/#s*, 百拇医药
Chang Yaping， Miao Chuanlong， Feng Leping， Lou Gangyi， Yu Yongliq/#s*, 百拇医药
(Department of Immunology， Norman Bethune University ofq/#s*, 百拇医药
Medical Sciences，Changchun 130021)q/#s*, 百拇医药
Abstract To detect the relevance between the changes of FGFR-1 genomic DNA and the generation of colo-rectal carcinoma，the cDNA encoding FGFR-1 region was isolated by RT-PCR from human fibroblasts， then used as a probe to analyze genomic DNAs of colonal carcinoma and adjacent tissues in Southern blotting. The results showed that the Southern blotting maps of colonal carcinama were different from those of adjacent tissues. The variance of FGFR-1 genomic DNA may have certain connection with the development of colonal carcinoma.
Key words FGFR-1 genomic DNA， Colonal carcinoma， Southern blottiongl4!1h, 百拇医药
成纤维细胞生长因子受体(FGFR)，是免疫球蛋白基因超家族成员，现已克隆了4种FGFR，分别被称为FGFR-1，FGFR-2，FGFR-3和FGFR-4。成纤维细胞生长因子(FGFs)的生物学活性是通过FGFR实现的。FGFs是一个多肽生长因子家族，此家族已发现了14个成员，它们主要参与胚胎发育、损伤修复、血管生成和神经再生等生理病理过程。据报道许多类的肿瘤细胞表面均表达较高水平的生长因子受体；FGFRs基因的异常表达与乳腺癌、胃癌、胰腺癌、前列腺癌的发生有关。但已有的资料多局限于FGFR基因的转录及翻译水平的变化。根据FGFR结构与功能的特点，我们推测在某些肿瘤的形成过程中FGFRs的基因在DNA水平上可能有较大的变化，故采用Southern杂交方法分析了人结肠癌及癌旁组织基因组的EcoRI酶切图谱，以期观察到FGFR-1基因的变化并探讨这种变化与肿瘤发生的关系。l4!1h, 百拇医药
1 材料与方法l4!1h, 百拇医药
1.1 FGFR-1基因片段的获取l4!1h, 百拇医药
1.1.1 RT-PCR法钓取FGFR-1 cDNA[1]：自人肺成纤维细胞(分离自肺纤维化病人的活检组织)提取总RNA，将其逆转录成cDNA。采用FGFR-1特异性引物作PCR扩增。用琼脂糖凝胶电泳、gene clean试剂纯化产物。l4!1h, 百拇医药
1.1.2 将PCR片段以TA连接方式克隆入pCRTMⅡ质粒[2](质粒图谱略)。转化大肠杆菌。取白色菌落进行扩大培养。以碱裂解法提取质粒。l4!1h, 百拇医药
1.2 DNA序列分析l4!1h, 百拇医药
以双脱氧末端终止法对插入片段作双链DNA序列分析[2]，序列分析结果表明，插入片段全长约2.2kb，其序列与已发表的FGFR-1的cDNA完全相符[3]。l4!1h, 百拇医药
1.3 Southern印迹杂交l4!1h, 百拇医药
1.3.1 FGFR-1基因探针制备：将重组质粒转化E-coli JM109菌株中，制备质粒，以HindⅢ和XbaⅠ进行单酶切和双酶切，得到约2.2kb片段，以此片段为模板采用随机引物法制备地高辛标记的FGFR-1 cDNA探针。
1.3.2 人结肠癌、直肠癌及癌旁组织的DNA制备：采用酚氯仿抽提法。gk\!, 百拇医药
1.3.3 杂交：取7份肠癌病人癌组织、癌旁组织及正常人外周血基因组DNA为样品。癌旁组织为距离癌组织5cm以上的正常组织。两组织的确定均以病理切片为标准。将20μg基因组DNA的EcoRI消化物做0.7%琼脂糖凝胶电泳。用毛细管转移法将分散的DNA区带变性后转移至硝酸纤维素膜上。按地高辛标记及检测试剂盒提供的方法进行预杂交和杂交反应。gk\!, 百拇医药
1.4 免疫学检测gk\!, 百拇医药
将洗过的硝纤膜在室温封闭30min，加入碱性磷酸酶标记的羊抗地高辛多克隆抗体，室温孵育30min，洗去未结合抗体。将平衡后的硝纤膜在100ml含450μl NBT(硝基蓝四氮唑)和350μl BCIP(5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸二钠盐)的显色缓冲液中显色24h，终止反应，自然光下拍照。gk\!, 百拇医药
2 结果gk\!, 百拇医药
在7份癌旁组织标本，一号样品可见一5.6kb区带，其它6份均可见显现5.6kb和9.4kb两条相同的区带，见图1。而7份癌组织仅可见1号样品显现6.5kb与9.4kb两条区带，2号样品显现一9.4kb区带，而其它5份样品未见区带显现，见图2。
gk\!, 百拇医药
图 1 人肠癌癌旁组织FGFR-1基因EcoRI酶切Southern印迹分析gk\!, 百拇医药
Fig 1 Southern blotting analysis of EcoRI digested human genomicgk\!, 百拇医药
DNA from adjacent tissues of colorectal carcinomagk\!, 百拇医药
A：Recombinant pCRTMⅡ plasmid B，C，D，E，F，G，H：Adjacent tissue samples 1～7
gk\!, 百拇医药
图 2 人肠癌组织FGFR-1基因组EcoRI酶切Southern印迹分析
Fig 2 Southern blotting analysis of EcoRI digestd genomic(a!3a6, http://www.100md.com
DNA of human colorectal carcinoma tissues(a!3a6, http://www.100md.com
A：Recombinant pCRTMⅡ plasmid B，C，D，E：Tumor tissue samples 1～4(a!3a6, http://www.100md.com
本研究还观察了7份正常人外周血FGFR-1基因的变化，仅有一份标本显现11kb的区带，见图3。结果表明：①正常人外周血细胞与肠癌组织FGFR-1基因的EcoRI-Southern酶切图谱不同。正常人外周血DNA用EcoRI酶切后杂交，只显现一条约11kb的区带，而肠癌组织可显现9.4kb及6.5kb的区带。②肠癌患者癌组织与癌旁组织FGFR-1基因的EcoRI-Southern图谱不同。肠癌组织可显现9.4kb与6.5kb的区带，而癌旁组织显现的是9.4kb与6.5kb的区带。③同一个体癌组织与癌旁组织FGFR-1基因的EcoRI-Southern图谱亦不同。如图1中的B标本与图2中的B标本来自同一个体，但显现的杂交片段不同。癌组织可见一9.4kb与6.5kb片段，癌旁组织却只显现一5.6kb的片段。C标本也是来自同一个体，也表现出明显差异。
(a!3a6, http://www.100md.com
图 3 人外周血FGFR-1基因EcoRI酶切Southern印迹分析(a!3a6, http://www.100md.com
Fig 3 Southern blotting analysis of EcoRI digested genomic(a!3a6, http://www.100md.com
DNA from human peripheral blood leukocytes(a!3a6, http://www.100md.com
A：Recombinant pCRTMⅡ plasmid B，C，D：Peripheral blood leukocyte samples 1～4(a!3a6, http://www.100md.com
3 讨论(a!3a6, http://www.100md.com
近年研究表明，在多种肿瘤和乳腺癌、胃癌、胰腺癌、前列腺癌等组织可见FGFRs基因的过度表达[4，5]。本室前期工作表明，在头颈部肿瘤及乳腺癌组织中可见FGFR-1在DNA水平的变化[6]。本文采用FGFR-1基因探针，Southern杂交分析了肠癌及癌旁组织基因组EcoRI酶切图谱，亦表明了两者在DNA水平上的差异。尤其在同一个体，癌组织FGFR-1基因组酶切图谱与癌旁组织呈现不同的区带，说明了FGFR-1基因组在不同组织的异质性。癌组织FGFR-1基因组酶切图谱的变化是由于FGFR基因发生重排的结果还是基因突变所导致，以及这种变化对FGFR-1的表达的影响是否存在及机制如何，值得进一步探讨；而这种差异与肿瘤发生发展的相关性则是更需进一步研究的课题。
* 本课题受国家跨世纪优秀人才基金及香港求是基金会资助(教技厅 1995 4号)56itn, 百拇医药
作者简介 第一作者：女，49岁，硕士，副教授56itn, 百拇医药
参考文献56itn, 百拇医药
1 于永利，杨贵贞.以cRNA为内参照物测定人支气管肺泡洗出液细胞TNF-α mRNA的含量.中国免疫学杂志，1992，8(2)：10056itn, 百拇医药
2 于永利，麻彤辉，杨贵贞.TA克隆及双链DNA测序：介绍一种快速克隆分析PCR产物的方法.中国免疫学杂志，1994，10(1)：556itn, 百拇医药
3 Wang IY，Edebson ST，Yu YL，et al.Natural kinase-deficient variant of fibroblast growth factor receptor 1.Biochemistry，1996，35：1013456itn, 百拇医药
4 Jacquemier J，Adelaide J，Parc P，et al.Expression of the FGFR-1 gene in human breast-carcinoma cells.Int J Cancer，1994，59：37356itn, 百拇医药
5 Leung HY，Gullick WJ，Lemoine NR.Experession and functional activity of fibroblast growth factors and their receptors in human pancreation cancer.Int J Cancer，1994，59(5)：66756itn, 百拇医药
6 王 平，于永利.成纤维细胞生长因子受体1基因簇在某些肿瘤组织中的变化.中国免疫学杂志，1996，12(3)：13556itn, 百拇医药
(1998-09-03收稿；1998-10-22修回)(常雅萍 苗传龙 冯乐平 娄刚毅 于永利)
单位：常雅萍、苗传龙、于永利( 白求恩医科大学免疫学教研室 长春 130012)； 冯乐平、娄刚毅( 吉林省肿瘤防治研究所)q/#s*, 百拇医药
关键词：FGFR-1基因 结肠癌 Southern杂交q/#s*, 百拇医药
免疫学杂志990205摘 要 为观察人FGFR-1基因变化与结肠癌发生的关系。采用RT-PCR法从人肺成纤维细胞中钓取FGFR-1全编码区cDNA，用此cDNA探针与人肠癌及癌旁组织DNA进行Southern印迹分析。结果表明：与癌旁组织相比结肠癌组织Southern印迹图谱发生了改变。提示PGFR-1基因变化与肠癌发生可能存在一定相关性。q/#s*, 百拇医药
中图号 R735.3，Q7q/#s*, 百拇医药
CHANGES OF FGFR-1 GENOMIC DNA IN HUMANq/#s*, 百拇医药
COLORECTAL CARCINOMAq/#s*, 百拇医药
Chang Yaping， Miao Chuanlong， Feng Leping， Lou Gangyi， Yu Yongliq/#s*, 百拇医药
(Department of Immunology， Norman Bethune University ofq/#s*, 百拇医药
Medical Sciences，Changchun 130021)q/#s*, 百拇医药
Abstract To detect the relevance between the changes of FGFR-1 genomic DNA and the generation of colo-rectal carcinoma，the cDNA encoding FGFR-1 region was isolated by RT-PCR from human fibroblasts， then used as a probe to analyze genomic DNAs of colonal carcinoma and adjacent tissues in Southern blotting. The results showed that the Southern blotting maps of colonal carcinama were different from those of adjacent tissues. The variance of FGFR-1 genomic DNA may have certain connection with the development of colonal carcinoma.
Key words FGFR-1 genomic DNA， Colonal carcinoma， Southern blottiongl4!1h, 百拇医药
成纤维细胞生长因子受体(FGFR)，是免疫球蛋白基因超家族成员，现已克隆了4种FGFR，分别被称为FGFR-1，FGFR-2，FGFR-3和FGFR-4。成纤维细胞生长因子(FGFs)的生物学活性是通过FGFR实现的。FGFs是一个多肽生长因子家族，此家族已发现了14个成员，它们主要参与胚胎发育、损伤修复、血管生成和神经再生等生理病理过程。据报道许多类的肿瘤细胞表面均表达较高水平的生长因子受体；FGFRs基因的异常表达与乳腺癌、胃癌、胰腺癌、前列腺癌的发生有关。但已有的资料多局限于FGFR基因的转录及翻译水平的变化。根据FGFR结构与功能的特点，我们推测在某些肿瘤的形成过程中FGFRs的基因在DNA水平上可能有较大的变化，故采用Southern杂交方法分析了人结肠癌及癌旁组织基因组的EcoRI酶切图谱，以期观察到FGFR-1基因的变化并探讨这种变化与肿瘤发生的关系。l4!1h, 百拇医药
1 材料与方法l4!1h, 百拇医药
1.1 FGFR-1基因片段的获取l4!1h, 百拇医药
1.1.1 RT-PCR法钓取FGFR-1 cDNA[1]：自人肺成纤维细胞(分离自肺纤维化病人的活检组织)提取总RNA，将其逆转录成cDNA。采用FGFR-1特异性引物作PCR扩增。用琼脂糖凝胶电泳、gene clean试剂纯化产物。l4!1h, 百拇医药
1.1.2 将PCR片段以TA连接方式克隆入pCRTMⅡ质粒[2](质粒图谱略)。转化大肠杆菌。取白色菌落进行扩大培养。以碱裂解法提取质粒。l4!1h, 百拇医药
1.2 DNA序列分析l4!1h, 百拇医药
以双脱氧末端终止法对插入片段作双链DNA序列分析[2]，序列分析结果表明，插入片段全长约2.2kb，其序列与已发表的FGFR-1的cDNA完全相符[3]。l4!1h, 百拇医药
1.3 Southern印迹杂交l4!1h, 百拇医药
1.3.1 FGFR-1基因探针制备：将重组质粒转化E-coli JM109菌株中，制备质粒，以HindⅢ和XbaⅠ进行单酶切和双酶切，得到约2.2kb片段，以此片段为模板采用随机引物法制备地高辛标记的FGFR-1 cDNA探针。
1.3.2 人结肠癌、直肠癌及癌旁组织的DNA制备：采用酚氯仿抽提法。gk\!, 百拇医药
1.3.3 杂交：取7份肠癌病人癌组织、癌旁组织及正常人外周血基因组DNA为样品。癌旁组织为距离癌组织5cm以上的正常组织。两组织的确定均以病理切片为标准。将20μg基因组DNA的EcoRI消化物做0.7%琼脂糖凝胶电泳。用毛细管转移法将分散的DNA区带变性后转移至硝酸纤维素膜上。按地高辛标记及检测试剂盒提供的方法进行预杂交和杂交反应。gk\!, 百拇医药
1.4 免疫学检测gk\!, 百拇医药
将洗过的硝纤膜在室温封闭30min，加入碱性磷酸酶标记的羊抗地高辛多克隆抗体，室温孵育30min，洗去未结合抗体。将平衡后的硝纤膜在100ml含450μl NBT(硝基蓝四氮唑)和350μl BCIP(5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸二钠盐)的显色缓冲液中显色24h，终止反应，自然光下拍照。gk\!, 百拇医药
2 结果gk\!, 百拇医药
在7份癌旁组织标本，一号样品可见一5.6kb区带，其它6份均可见显现5.6kb和9.4kb两条相同的区带，见图1。而7份癌组织仅可见1号样品显现6.5kb与9.4kb两条区带，2号样品显现一9.4kb区带，而其它5份样品未见区带显现，见图2。
gk\!, 百拇医药图 1 人肠癌癌旁组织FGFR-1基因EcoRI酶切Southern印迹分析gk\!, 百拇医药
Fig 1 Southern blotting analysis of EcoRI digested human genomicgk\!, 百拇医药
DNA from adjacent tissues of colorectal carcinomagk\!, 百拇医药
A：Recombinant pCRTMⅡ plasmid B，C，D，E，F，G，H：Adjacent tissue samples 1～7
gk\!, 百拇医药图 2 人肠癌组织FGFR-1基因组EcoRI酶切Southern印迹分析
Fig 2 Southern blotting analysis of EcoRI digestd genomic(a!3a6, http://www.100md.com
DNA of human colorectal carcinoma tissues(a!3a6, http://www.100md.com
A：Recombinant pCRTMⅡ plasmid B，C，D，E：Tumor tissue samples 1～4(a!3a6, http://www.100md.com
本研究还观察了7份正常人外周血FGFR-1基因的变化，仅有一份标本显现11kb的区带，见图3。结果表明：①正常人外周血细胞与肠癌组织FGFR-1基因的EcoRI-Southern酶切图谱不同。正常人外周血DNA用EcoRI酶切后杂交，只显现一条约11kb的区带，而肠癌组织可显现9.4kb及6.5kb的区带。②肠癌患者癌组织与癌旁组织FGFR-1基因的EcoRI-Southern图谱不同。肠癌组织可显现9.4kb与6.5kb的区带，而癌旁组织显现的是9.4kb与6.5kb的区带。③同一个体癌组织与癌旁组织FGFR-1基因的EcoRI-Southern图谱亦不同。如图1中的B标本与图2中的B标本来自同一个体，但显现的杂交片段不同。癌组织可见一9.4kb与6.5kb片段，癌旁组织却只显现一5.6kb的片段。C标本也是来自同一个体，也表现出明显差异。
(a!3a6, http://www.100md.com图 3 人外周血FGFR-1基因EcoRI酶切Southern印迹分析(a!3a6, http://www.100md.com
Fig 3 Southern blotting analysis of EcoRI digested genomic(a!3a6, http://www.100md.com
DNA from human peripheral blood leukocytes(a!3a6, http://www.100md.com
A：Recombinant pCRTMⅡ plasmid B，C，D：Peripheral blood leukocyte samples 1～4(a!3a6, http://www.100md.com
3 讨论(a!3a6, http://www.100md.com
近年研究表明，在多种肿瘤和乳腺癌、胃癌、胰腺癌、前列腺癌等组织可见FGFRs基因的过度表达[4，5]。本室前期工作表明，在头颈部肿瘤及乳腺癌组织中可见FGFR-1在DNA水平的变化[6]。本文采用FGFR-1基因探针，Southern杂交分析了肠癌及癌旁组织基因组EcoRI酶切图谱，亦表明了两者在DNA水平上的差异。尤其在同一个体，癌组织FGFR-1基因组酶切图谱与癌旁组织呈现不同的区带，说明了FGFR-1基因组在不同组织的异质性。癌组织FGFR-1基因组酶切图谱的变化是由于FGFR基因发生重排的结果还是基因突变所导致，以及这种变化对FGFR-1的表达的影响是否存在及机制如何，值得进一步探讨；而这种差异与肿瘤发生发展的相关性则是更需进一步研究的课题。
* 本课题受国家跨世纪优秀人才基金及香港求是基金会资助(教技厅 1995 4号)56itn, 百拇医药
作者简介 第一作者：女，49岁，硕士，副教授56itn, 百拇医药
参考文献56itn, 百拇医药
1 于永利，杨贵贞.以cRNA为内参照物测定人支气管肺泡洗出液细胞TNF-α mRNA的含量.中国免疫学杂志，1992，8(2)：10056itn, 百拇医药
2 于永利，麻彤辉，杨贵贞.TA克隆及双链DNA测序：介绍一种快速克隆分析PCR产物的方法.中国免疫学杂志，1994，10(1)：556itn, 百拇医药
3 Wang IY，Edebson ST，Yu YL，et al.Natural kinase-deficient variant of fibroblast growth factor receptor 1.Biochemistry，1996，35：1013456itn, 百拇医药
4 Jacquemier J，Adelaide J，Parc P，et al.Expression of the FGFR-1 gene in human breast-carcinoma cells.Int J Cancer，1994，59：37356itn, 百拇医药
5 Leung HY，Gullick WJ，Lemoine NR.Experession and functional activity of fibroblast growth factors and their receptors in human pancreation cancer.Int J Cancer，1994，59(5)：66756itn, 百拇医药
6 王 平，于永利.成纤维细胞生长因子受体1基因簇在某些肿瘤组织中的变化.中国免疫学杂志，1996，12(3)：13556itn, 百拇医药
(1998-09-03收稿；1998-10-22修回)(常雅萍 苗传龙 冯乐平 娄刚毅 于永利)