“当归补血汤”对人脐静脉内皮细胞的增殖及分泌IL-6和GM-CSF的影响
作者：吴岩 祝彼得 黄秀深 刘渊 杨岚
单位：吴岩(华西医科大学 基础医学院，四川 成都 610041)；祝彼得 黄秀深 刘渊 杨岚(成都中医药大学)
关键词：当归补血汤；内皮细胞；GM-CSF；IL-6
成都中医药大学学报000408 摘 要： 目的：旨在探讨当归补血汤对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的增殖及分泌GM-CSF和IL-6的影响，试图阐明当归补血汤补气生血的机理。方法：建立人脐静脉内皮细胞体外培养模型，将HUVEC与“当归补血汤”不同剂量(0、40、400 μg/ mL)一起培养，以MTT比色法测定内皮细胞增殖情况，以流式细胞仪测定内皮细胞增殖周期。同时收集内皮细胞培养上清液，采用双抗夹心ELISA法对内皮细胞培养上清液中GM-CSF和IL-6进行测定。结果：“当归补血汤”能够促进内皮细胞的增殖和细胞分泌GM-CSF和IL-6(P<0.05)，促进细胞进入增殖期(P<0.05)。结论：①体外培养的人脐静脉内皮细胞具有自发分泌GM-CSF和IL-6的功能。②当归补血汤能够促进内皮细胞的增殖以及GM-CSF和IL-6的分泌。以上结论为当归补血汤益气生血的理论提供了科学的依据。
, http://www.100md.com
中图分类号： R331.2；R392；R967,R289.3 文献标识码：A 文章编号：1004-0668(2000)04-0020-03
人脐静脉内皮细胞是研究体外造血调控的有效模型。在崇尚自然，回归自然的今天，已成为人们研究和开发的热点[1] 。当归补血汤是中医益气生血的经典处方，历年来对该方的临床应用及药理研究报道比较多[2] ，但关于其对内皮细胞生物学作用的影响及其在造血调控中的作用尚未见报道。我们旨在探讨当归补血汤对人脐静脉内皮细胞增殖及产生GM-CSF和IL-6的影响，为研究当归补血汤在造血调控中的作用，以及该方所代表的中医益气生血理论提供科学的论据。
1 材料和方法
1.1 材料
①96孔塑料培养板和培养瓶及各种型号通用吸头(丹麦Nunc产品)，②单孔可调式移液器(芬兰Finnpitte产品)，③8孔可调式移液器(美国PALL-Gelman产品)。
, 百拇医药
1.2 主要试剂
①培养液M199(GIBCO产品)，②小牛血清(GIBCO产品)，③0.1%胶原酶(Sigma产品)，④hIL-6和hGM-CSF ELISA试剂盒(深圳晶美生物公司)，⑤“当归补血汤，采用黄芪注射液(成都地奥产品)、当归注射液(江苏盱眙制药厂)，按黄芪、当归5∶1的传统组方配伍用量比例，建立“当归补血汤”模型。
1.3 脐带标本
健康产妇剖腹产术后12 h以内的脐带。由华西医科大学附属第二医院产科提供。
1.4 实验方法
1.4.1 人脐静脉内皮细胞(HUVEC)体外培养模型的建立 取健康产妇剖腹产术后12 h以内的脐带，立即浸泡在4℃无菌的脐带采集液中。按Jaffe[3]法加以改良后进行培养。用0.1%胶原酶消化分离内皮细胞，以2×104/mL细胞接种于96孔塑料培养板中，用含20%小牛血清的M199培养液进行培，同时加入不同剂量当归补血汤(0、40、400 μg/mL)连续培养7天。培养条件：5%CO2、37℃培养箱，直到细胞生长汇合。按不同时间收集培养上清，-20℃保存待测。同时对所培养的内皮细胞进行鉴定。
, 百拇医药
1.4.2 用MTT比色法测定内皮细胞增殖曲线 将原代内皮细胞以每孔2×104个细胞接种于96孔培养板中，每孔体积200 μL,加入不同剂量“当归补血汤”(0、40、400 μg/mL)。同时将空白对照与实验组平行不加细胞只加培养液。比色时以空白对照孔调零。终止培养前，每孔加入MTT溶液(5 mg/mL)20 μL，37℃，5%CO2条件下继续孵育4 h。小心吸弃孔内培养上清液。每孔加入DMSO 150 μL，振荡10 min，使结晶物充分溶解。选择490 nm波长，在酶联免疫检测仪(美国Bio-Tek公司)上测定各孔光吸收值，记录结果。以时间为横轴，光吸收值为纵轴绘制细胞生长曲线。
1.4.3 “当归补血汤”对内皮细胞增殖周期影响的测定 将内皮细胞以1×105个细胞接种于含15%小牛血清的M199培养液的25 mL塑料培养瓶中，实验分Ⅰ～Ⅴ组，分别加入不同药物浓度的当归补血汤(终浓度分别为0 μg、40μg、400μg)。置37℃，5%CO2饱和湿度培养箱中培育12 h，测定前PBS洗涤2次，加RNA酶工作液和碘化丙啶(PI)荧光染色工作液，4℃避光作用30 min ，上流式细胞仪分析，获细胞周期各时相比例。
, 百拇医药
1.4.4 GM-CSF和IL-6的测定 采用双抗夹心ELISA法(均按试剂盒说明操作)。
1.4.5 资料的统计学处理 均采用t检验进行统计处理。
2 结果
2.1 内皮细胞鉴定
内皮细胞经F VIII/vWF抗体染色后胞浆内显示棕褐色颗粒。透射电镜观察，在少数内皮细胞胞质中可见典型棒状的Weible-Palada小体。证实所培养细胞为内皮细胞。
2.2 “当归补血汤”对培养的人脐静脉内皮细胞增殖的影响
见图1。
, 百拇医药 图1 不同浓度“当归补血汤”对HUVEC增殖的影响
2.3 “当归补血汤”对内皮细胞增殖周期的影响
见图2。
图2 不同浓度“当归补血汤”对培养的人脐静脉内皮细胞增殖周期的影响
2.4 “当归补血汤”对培养的人脐静脉内皮细胞产生IL-6的影响
见表1。
表1 不同浓度“当归补血汤”对培养的人脐静脉内皮细胞产生IL-6的影响 培养天数
0 μg/mL
40 μg/mL
, 百拇医药
400 μg/mL
空白对照
3.0284±0.0000
3.0284± 0.0000
3.0284±0.0000
2
264.4243±9.0881*
1311.7860± 47.7915*#
913.0081±62.1715*#
4
, http://www.100md.com 566.5567±101.7869*
1427.9290±11.2461*#
1067.2991±74.6268*#
6
962.8004±112.5837*
1831.6000±25.3460*#
1342.9733±15.8203*#
7
746.6703± 29.1630*
, http://www.100md.com
1568.6203±156.5120*#
1201.1800±13.9589*#
与空白对照比较，*P<0.05；与空白对照比较，#P<0.05
2.4 当归补血汤对培养的人脐静脉内皮细胞产生GM-CSF的影响
见表2。表2 不同浓度当归补血汤对培养的人脐静脉内皮细胞产生GM-CSF的影响 培养天数
0 μg/mL
40 μg/mL
400 μg/mL
空白对照
, 百拇医药
1.9407±0.0000
1.9407± 0.0000
1.9407±0.0000
2
10.2307±2.0060*
56.4137±11.7628*#
27.2022±0.8703*
4
3.8721±7.3565*
150.0754±56.9590*#
, http://www.100md.com
33.5926±3.6240*
6
61.2180±8.7590*
250.0140±14.0751*#
54.8284±5.7405*
7
44.4343±5.1317*
223.3466± 9.2927*#
44.5186±2.9590*
, 百拇医药
与空白对照比较，*P<0.05；与空白对照比较，#P<0.05。
3 讨论
内皮细胞是造血微环境中重要的基质细胞成分之一，除对造血细胞构成支架外，还通过细胞与细胞之间相互作用及分泌多种细胞因子从而影响与调控造血[4]。我们以HUVEC体外培养模型为对象，采用黄芪、当归注射液，按当归补血汤传统组方原则，建立“当归补血汤”模型，研究了“当归补血汤”模型对内皮细胞的生物学作用。G0/G1和S+G2/M细胞数量比例的变化反映着细胞增值周期状态，正常内皮细胞增殖率很低，我们用流式细胞术观察到“当归补血汤”能够促进内皮细胞由静止期(G0/G1期)进入增殖期(S+G2/M期)，这表明当归补血汤中的某些药物成分具有促进细胞有丝分裂的能力。本研究结果表明，当归补血汤能够促进IL-6和GM-CSF的分泌。随着内皮细胞培养天数的增加，GM-CSF和IL-6的释放量也随之增加，当细胞进入对数增长期后，GM-CSF和IL-6接近释放峰值，与内皮细胞增殖情况基本吻合。
, 百拇医药
IL-6具有多种生物学活性，在造血调控中IL-6能够诱导造血干细胞生长，同时能诱导巨核细胞成熟。IL-6和IL-3在诱导小鼠多种造血前体细胞增殖方面有协同作用，IL-6诱导这些细胞从休眠状态进入细胞周期。IL-6和IL-3共同刺激产生的骨髓细胞集落比单独IL-3诱导的集落更容易在致死性放射照射小鼠骨髓中出现。同样IL-6也具有协同M-CSF和GM-CSF的作用。GM-CSF是影响骨髓干细胞分化发育的集落剌激因子。GM-CSF可维持造血细胞和成熟血细胞的存活，能够促进造血祖细胞(包括粒细胞、红系祖细胞和巨核系祖细胞)的增殖和分化；体外还可与Epo协同作用，促进红系和多潜能系克隆的形成。GM-CSF不但参与造血而且可以减缓由于化疗对造血系统所产生的副作用，同时促进其造血功能的恢复[5]。本研究结果提示：当归补血汤能够通过直接刺激内皮细胞分泌造血因子参与造血调控，这可能是当归补血汤发挥补气生血作用的机制之一。
基金项目：四川省教育厅重点科研项目
, 百拇医药
作者简介：吴岩，女，1957年12月生；华西医科大学在读博士研究生，副教授；研究方向：造血调控。
参考文献
1，肖红斌，梁鑫淼，卢佩章，等.重要复方分析新方法及其应用[J].科学通讯，1999，44(6)：588
2，骆和生，罗鼎辉主编.中药免疫药理与临床[M].北京：北京医科大学(协和医科大学出版社，1999.40
3，Jaffe E.A, Nachman RL, Becker CG， et al. Culture of human endothelial cells derived from umibilical veins identification by morphologic and immunologic criteria[J].J Clin Invest，1973，52(2)：2745
, 百拇医药
4，Jazwiec B, Solanilla A, Grosset C et al. Endothelial cell support of hematopoiesis is differentially altered by IL-1 and glucocorticoids[J].Leukemia，1998，12(8)：1210
5，Shi Y, Inoue S, Shinozaki R, et al. Release of cytokines from human umibical vein endothelial cells treated with platinum compounds in vitro[J].Jpn.J.Cancer Res，1998，89(2)：757
收稿日期：2000-08-21, 百拇医药
单位：吴岩(华西医科大学 基础医学院，四川 成都 610041)；祝彼得 黄秀深 刘渊 杨岚(成都中医药大学)
关键词：当归补血汤；内皮细胞；GM-CSF；IL-6
成都中医药大学学报000408 摘 要： 目的：旨在探讨当归补血汤对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的增殖及分泌GM-CSF和IL-6的影响，试图阐明当归补血汤补气生血的机理。方法：建立人脐静脉内皮细胞体外培养模型，将HUVEC与“当归补血汤”不同剂量(0、40、400 μg/ mL)一起培养，以MTT比色法测定内皮细胞增殖情况，以流式细胞仪测定内皮细胞增殖周期。同时收集内皮细胞培养上清液，采用双抗夹心ELISA法对内皮细胞培养上清液中GM-CSF和IL-6进行测定。结果：“当归补血汤”能够促进内皮细胞的增殖和细胞分泌GM-CSF和IL-6(P<0.05)，促进细胞进入增殖期(P<0.05)。结论：①体外培养的人脐静脉内皮细胞具有自发分泌GM-CSF和IL-6的功能。②当归补血汤能够促进内皮细胞的增殖以及GM-CSF和IL-6的分泌。以上结论为当归补血汤益气生血的理论提供了科学的依据。
, http://www.100md.com
中图分类号： R331.2；R392；R967,R289.3 文献标识码：A 文章编号：1004-0668(2000)04-0020-03
人脐静脉内皮细胞是研究体外造血调控的有效模型。在崇尚自然，回归自然的今天，已成为人们研究和开发的热点[1] 。当归补血汤是中医益气生血的经典处方，历年来对该方的临床应用及药理研究报道比较多[2] ，但关于其对内皮细胞生物学作用的影响及其在造血调控中的作用尚未见报道。我们旨在探讨当归补血汤对人脐静脉内皮细胞增殖及产生GM-CSF和IL-6的影响，为研究当归补血汤在造血调控中的作用，以及该方所代表的中医益气生血理论提供科学的论据。
1 材料和方法
1.1 材料
①96孔塑料培养板和培养瓶及各种型号通用吸头(丹麦Nunc产品)，②单孔可调式移液器(芬兰Finnpitte产品)，③8孔可调式移液器(美国PALL-Gelman产品)。
, 百拇医药
1.2 主要试剂
①培养液M199(GIBCO产品)，②小牛血清(GIBCO产品)，③0.1%胶原酶(Sigma产品)，④hIL-6和hGM-CSF ELISA试剂盒(深圳晶美生物公司)，⑤“当归补血汤，采用黄芪注射液(成都地奥产品)、当归注射液(江苏盱眙制药厂)，按黄芪、当归5∶1的传统组方配伍用量比例，建立“当归补血汤”模型。
1.3 脐带标本
健康产妇剖腹产术后12 h以内的脐带。由华西医科大学附属第二医院产科提供。
1.4 实验方法
1.4.1 人脐静脉内皮细胞(HUVEC)体外培养模型的建立 取健康产妇剖腹产术后12 h以内的脐带，立即浸泡在4℃无菌的脐带采集液中。按Jaffe[3]法加以改良后进行培养。用0.1%胶原酶消化分离内皮细胞，以2×104/mL细胞接种于96孔塑料培养板中，用含20%小牛血清的M199培养液进行培，同时加入不同剂量当归补血汤(0、40、400 μg/mL)连续培养7天。培养条件：5%CO2、37℃培养箱，直到细胞生长汇合。按不同时间收集培养上清，-20℃保存待测。同时对所培养的内皮细胞进行鉴定。
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1.4.2 用MTT比色法测定内皮细胞增殖曲线 将原代内皮细胞以每孔2×104个细胞接种于96孔培养板中，每孔体积200 μL,加入不同剂量“当归补血汤”(0、40、400 μg/mL)。同时将空白对照与实验组平行不加细胞只加培养液。比色时以空白对照孔调零。终止培养前，每孔加入MTT溶液(5 mg/mL)20 μL，37℃，5%CO2条件下继续孵育4 h。小心吸弃孔内培养上清液。每孔加入DMSO 150 μL，振荡10 min，使结晶物充分溶解。选择490 nm波长，在酶联免疫检测仪(美国Bio-Tek公司)上测定各孔光吸收值，记录结果。以时间为横轴，光吸收值为纵轴绘制细胞生长曲线。
1.4.3 “当归补血汤”对内皮细胞增殖周期影响的测定 将内皮细胞以1×105个细胞接种于含15%小牛血清的M199培养液的25 mL塑料培养瓶中，实验分Ⅰ～Ⅴ组，分别加入不同药物浓度的当归补血汤(终浓度分别为0 μg、40μg、400μg)。置37℃，5%CO2饱和湿度培养箱中培育12 h，测定前PBS洗涤2次，加RNA酶工作液和碘化丙啶(PI)荧光染色工作液，4℃避光作用30 min ，上流式细胞仪分析，获细胞周期各时相比例。
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1.4.4 GM-CSF和IL-6的测定 采用双抗夹心ELISA法(均按试剂盒说明操作)。
1.4.5 资料的统计学处理 均采用t检验进行统计处理。
2 结果
2.1 内皮细胞鉴定
内皮细胞经F VIII/vWF抗体染色后胞浆内显示棕褐色颗粒。透射电镜观察，在少数内皮细胞胞质中可见典型棒状的Weible-Palada小体。证实所培养细胞为内皮细胞。
2.2 “当归补血汤”对培养的人脐静脉内皮细胞增殖的影响
见图1。
, 百拇医药 图1 不同浓度“当归补血汤”对HUVEC增殖的影响
2.3 “当归补血汤”对内皮细胞增殖周期的影响
见图2。
图2 不同浓度“当归补血汤”对培养的人脐静脉内皮细胞增殖周期的影响
2.4 “当归补血汤”对培养的人脐静脉内皮细胞产生IL-6的影响
见表1。
表1 不同浓度“当归补血汤”对培养的人脐静脉内皮细胞产生IL-6的影响 培养天数
0 μg/mL
40 μg/mL
, 百拇医药
400 μg/mL
空白对照
3.0284±0.0000
3.0284± 0.0000
3.0284±0.0000
2
264.4243±9.0881*
1311.7860± 47.7915*#
913.0081±62.1715*#
4
, http://www.100md.com 566.5567±101.7869*
1427.9290±11.2461*#
1067.2991±74.6268*#
6
962.8004±112.5837*
1831.6000±25.3460*#
1342.9733±15.8203*#
7
746.6703± 29.1630*
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1568.6203±156.5120*#
1201.1800±13.9589*#
与空白对照比较，*P<0.05；与空白对照比较，#P<0.05
2.4 当归补血汤对培养的人脐静脉内皮细胞产生GM-CSF的影响
见表2。表2 不同浓度当归补血汤对培养的人脐静脉内皮细胞产生GM-CSF的影响 培养天数
0 μg/mL
40 μg/mL
400 μg/mL
空白对照
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1.9407±0.0000
1.9407± 0.0000
1.9407±0.0000
2
10.2307±2.0060*
56.4137±11.7628*#
27.2022±0.8703*
4
3.8721±7.3565*
150.0754±56.9590*#
, http://www.100md.com
33.5926±3.6240*
6
61.2180±8.7590*
250.0140±14.0751*#
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7
44.4343±5.1317*
223.3466± 9.2927*#
44.5186±2.9590*
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与空白对照比较，*P<0.05；与空白对照比较，#P<0.05。
3 讨论
内皮细胞是造血微环境中重要的基质细胞成分之一，除对造血细胞构成支架外，还通过细胞与细胞之间相互作用及分泌多种细胞因子从而影响与调控造血[4]。我们以HUVEC体外培养模型为对象，采用黄芪、当归注射液，按当归补血汤传统组方原则，建立“当归补血汤”模型，研究了“当归补血汤”模型对内皮细胞的生物学作用。G0/G1和S+G2/M细胞数量比例的变化反映着细胞增值周期状态，正常内皮细胞增殖率很低，我们用流式细胞术观察到“当归补血汤”能够促进内皮细胞由静止期(G0/G1期)进入增殖期(S+G2/M期)，这表明当归补血汤中的某些药物成分具有促进细胞有丝分裂的能力。本研究结果表明，当归补血汤能够促进IL-6和GM-CSF的分泌。随着内皮细胞培养天数的增加，GM-CSF和IL-6的释放量也随之增加，当细胞进入对数增长期后，GM-CSF和IL-6接近释放峰值，与内皮细胞增殖情况基本吻合。
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IL-6具有多种生物学活性，在造血调控中IL-6能够诱导造血干细胞生长，同时能诱导巨核细胞成熟。IL-6和IL-3在诱导小鼠多种造血前体细胞增殖方面有协同作用，IL-6诱导这些细胞从休眠状态进入细胞周期。IL-6和IL-3共同刺激产生的骨髓细胞集落比单独IL-3诱导的集落更容易在致死性放射照射小鼠骨髓中出现。同样IL-6也具有协同M-CSF和GM-CSF的作用。GM-CSF是影响骨髓干细胞分化发育的集落剌激因子。GM-CSF可维持造血细胞和成熟血细胞的存活，能够促进造血祖细胞(包括粒细胞、红系祖细胞和巨核系祖细胞)的增殖和分化；体外还可与Epo协同作用，促进红系和多潜能系克隆的形成。GM-CSF不但参与造血而且可以减缓由于化疗对造血系统所产生的副作用，同时促进其造血功能的恢复[5]。本研究结果提示：当归补血汤能够通过直接刺激内皮细胞分泌造血因子参与造血调控，这可能是当归补血汤发挥补气生血作用的机制之一。
基金项目：四川省教育厅重点科研项目
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作者简介：吴岩，女，1957年12月生；华西医科大学在读博士研究生，副教授；研究方向：造血调控。
参考文献
1，肖红斌，梁鑫淼，卢佩章，等.重要复方分析新方法及其应用[J].科学通讯，1999，44(6)：588
2，骆和生，罗鼎辉主编.中药免疫药理与临床[M].北京：北京医科大学(协和医科大学出版社，1999.40
3，Jaffe E.A, Nachman RL, Becker CG， et al. Culture of human endothelial cells derived from umibilical veins identification by morphologic and immunologic criteria[J].J Clin Invest，1973，52(2)：2745
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4，Jazwiec B, Solanilla A, Grosset C et al. Endothelial cell support of hematopoiesis is differentially altered by IL-1 and glucocorticoids[J].Leukemia，1998，12(8)：1210
5，Shi Y, Inoue S, Shinozaki R, et al. Release of cytokines from human umibical vein endothelial cells treated with platinum compounds in vitro[J].Jpn.J.Cancer Res，1998，89(2)：757
收稿日期：2000-08-21, 百拇医药