L\|MAME对小肠上皮细胞辐射防护作用机理的探讨
作者：丁桂荣 郭 鹞
单位：710032 西安，第四军医大学，军队卫生系防原医学教研室
关键词：硝基左旋精氨酸甲基酯；小肠；上皮细胞；一氧化氮；辐射
L
目的 探讨硝基左旋精氨酸甲基酯(L\|NAME)对小肠上皮细胞辐射防护的机理。方法 实验用大鼠IEC\|6细胞，60Co\|γ射线照射；荧光分光光度法测定培养液上清中一氧化氮(NO)含量；NADPH黄递酶组化法(ND组化法)和免疫细胞化学法观察一氧化氮合酶(NOS)活性变化；MTT法检测细胞的生存力。结果 IEC\|6细胞经射照射后，其培养液上清中NO含量明显增加，细胞内结构型一氧化氮合酶(nNOS)活性升高，诱导型一氧化氮合酶(iNOS)活性降低，L\|NAME能明显提高细胞的生存力，NO底物\|左旋精氨酸(L\|Arg)部分逆转其作用。结论 NO参与了IEC\|6细胞的辐射损伤，L\|NAME对IEC\|6细胞具有辐射防护作用。
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Effect of L\|NAME on radiation\|induced IEC\|6 cell injury Ding Guirong Guo Yao Department of Radiation Medicine,The Military Medical University.Xian 710032 China.
Objective To study the effect of L\|NAME on radiation\|induced injury of small intestinal epithelial cells\|6(IEC\|6).Methods Rat IEC\|6 cells were irradiated with 60Co\|rays.The content of nitric oxide(NO) in media supernatant of IEC\|6 cells was measured by fluorometric method nitric oxide synthase (NOS) activity was observed by histochemistry of NADPH\|diaphase and immunocytochemistry.Cell viability was evaluated by method of MTT.Results NO generation by IEC\|6 cells was significantly increased after irradiation.The assay of nNOS activity showed that it was stimulated.iNOS activity was inhibited.L\|NAME was able to increase cell viability which had been reduced by irradiation,but it was reversed partly by pretreatment with NO substrsate\|L\|Arg.Conclusion NO was involved in IEC\|6 cell injury induced by radiation and L\|NAME could provide protective effect on it.
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Key words L\|NAME Small intestines Epithelial cells Nitric Oxide Radiation
已知NO(nitric oxide)是一种重要的细胞内信息分子，调节免疫功能、血管扩张和神经传递，它在维持血管完整性方面也起着重要作用。小肠作为辐射敏感器官，其损伤机理及治疗一直是放射医学中广为关注的问题。近来有文献报道[1，2]，γ射线照射小鼠后，其肝、肠等器官NO合成增加，用NO抑制剂预处理小鼠，可使其半数致死剂量明显提高，提示NO抑制剂具有辐射防护作用。本实验从γ射线照射后培养肠上皮NO含量测定、NOS活性检测及硝基左旋精氨酸甲基酯(L\|NAME)对细胞生存力的影响三个方面探讨L\|NAME对小肠上皮辐射防护的机理。
1 材料和方法
1.1 材料：IEC\|6细胞株为大鼠小肠上皮细胞株，由英国Paterson肿瘤研究所上皮生物室提供；NO检测试剂盒由本校化学教研室提供；链霉素抗生物素蛋白—过氧化酶免疫组化试剂盒(SP)为福州迈新生物技术有限公司产品；iNOS一抗为Santa Cruz公司产品。
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1.2 细胞培养：在含10%新生牛血清的DMEM培养体系中培养。每升培养液加青霉素10万U，链霉素100mg,NaHCO\-3 3.7g，胰岛素250U，0.02%EDTA消化细胞后传代，5%CO\-2恒温孵箱中培养。
1.3 照射：将细胞传代于培养板或培养皿中，用60Coγ射线照射，源距45cm，剂量率1.426Gy/min，吸收剂量8Gy，室温下进行。
1.4 IEC\|6细胞照射后培养上清中NO含量测定：将细胞消化传代于24孔培养板中(1.2×10\+4细胞/孔)，37℃孵育16～24小时后8Gyγ射线一次性照射，照毕立即换用新鲜培养液培养，分别于照后24，48和72小时培养上清按本校建立的NO检测方法[3]，检测NO\+-\-2含量，间接反应NO的生成情况。
1.5 IEC\|6细胞NOS活性检测：将传代细胞接种于预置有盖玻片的培养皿中培养，待细胞即将长满时，把长有细胞的盖玻片取出，用0.01%mol/L PBS冲洗后，4%多聚甲醛固定15分钟。ND组化反应液由β-NADPH(1mg/ml Sigma)和NBT(0.5mg/ml Sigma)组成，0.03%Triton x\|100配制(pH8.0)，将标本放入反应液中37℃孵育1小时，0.01mol/L PBS漂洗(5分钟×3)终止反应。iNOS免疫细胞化学染色，按试剂盒说明进行，DAB呈色。以上两反应完毕后，均酒精逐级脱水，二甲苯透明，中性树脂封固，镜下观察并照相。
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1.6 L\|NAME对照射细胞生存力的影响：将细胞传代于96孔培样板中(200细胞/孔)，孵育24小时，8Gyγ射线照射，照毕立即更换分别含有下列物质的新鲜培养液：L\|NAME(5×10-4mol/L),L\|NAME(5×10-4mol/L)加L\|Arg(5×10-3mol/L)，继续培养48小时后，加MTT20μl/孔(5mg/ml Sigma)，37℃孵育4小时，吸掉上清，加二甲基亚砜150μl/孔，振荡10分钟，在酶联免疫检测仪上测定570nm处OD值。
2 结果
2.1 细胞照射后培养液上清中NO含量变化
IEC\|6细胞经γ射线照射后，培养液上清中NO\+-\-2含量照后24小时为0.989±0.105pmol/10\+4cell,照后48小时为1.421±0.287pmol/10\+4cell,照后72小时为1.353±0.192pmol/10\+4cell,对照组为0.666±0.195pmol/10\+4cell。照后48、72小时培养上清中NO含量较对照组明显增加(P<0.05)。
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2.2 γ射线照射后IEC\|6细胞NOS活性变化
资料已证明NADPH黄递酶就是cNOS[4]，因此用ND组化法来观察cNOS的分布及活性已成为一种可靠而简便的方法。在本实验中可见cNOS位于IEC\|6细胞胞浆内，围绕胞核分布，阳性产物为蓝色颗粒状沉淀，胞核不着色(见图1)。iNOS免疫反应产物为棕色颗粒状沉淀，亦位为于胞浆，胞核周围着色较深，核不着色(见图3)。8Gyγ射线照射后，cNOS阳性产物着色加深，且有浓集现象(见图2)，iNOS免疫反应产物则着色变浅(见图4)。
2.3 L\|NAME对受照细胞生存力的影响
MTT法测定结果，单照组吸光度(A值)0.032±0.011，L\|NAME组的A值为0.104±0.027，L\|NAME加L\|Arg组A值0.071±0.011。同单照组相比，L\|NAME明显提高了IEC\|6细胞的生存力(P<0.01)，L\|Arg部分逆转了其作用(P<0.05)。
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3 讨论
实验结果表明培养的IEC\|6细胞具有钙依赖性的cNOS活性和钙非依赖性的iNOD活性。γ射线照射可使cNOS活性增加，iNOS活性降低，由于cNOS活性的增加大于iNOS活性的降低，从而导致了细胞释放NO增多，而NO与照射细胞的生存力密切相关。在细胞受照后立即给予NOS抑制剂L\|NAME，能明显提高细胞生存力，加入NO底物L\|Arg则部分逆转其作用。由此可见，NO参与了IEC\|6细胞的辐射损伤，如能抑制NO过量生成，则对细胞具有辐射保护作用。
资料表明，cNOS催化生成的NO具有神经递质和细胞信使的功能。在肠道，它通过抑制白细胞粘附和维持内脏血流发挥其保护作用。由iNOS催化生成的NO主要参与炎症及免疫应答过程，肠粘膜iNOS的表达可能是建立针对肠腔细菌的宿主化学屏障的重要方式。在机体正常状态下，cNOS和iNOS保持适当的活性水平，无论二者活性过高或过低对机体都是有害的[5，6]。在本实验中，由于照射后cNOS和iNOS活性的变化，导致NO释放增加。过量生成的NO与超氧可以生成一种高度细胞毒性氧化物—过亚硝酸盐[7]，它通过破坏线粒体的电子转移。巯基集团的氧化和脂质过氧化导致细胞毒性。过亚硝酸盐还可降解为毒性更大的羟自由基，从而造成不可逆的细胞损伤。
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魏立基等[8]在小鼠复制的肠型放射病模型中，发现照后48、72小时肠壁cNOS活性明显提高，且与受照小鼠肠腔扩张、肠壁充血、肠粘膜损伤等病理改变呈正相关。我们在实验中不仅观察到cNOS活性被诱导，而且还发现iNOS活性是抑制的，关于其抑制的病理生理学意义，尚待进一步探讨。众所周所，肠绒毛上皮的病理改变与肠隐窝细胞的损伤和修复有密切的关系。提高辐射后肠隐窝细胞的存活率是治疗肠型放射病的有效途径。本研究证明：NO参与了IEC\|6细胞的辐射损伤，NO抑制剂对小肠上皮细胞具有辐射防护作用。
参考文献
1 Voevodskaya NV and Vanin AF.Gamma\|irradiation potentiates L\|arginline\|dependent nitric oxside formation in mice.Biochem Biophy Res Commu,1992,186:1423.
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2 Liebamann J,Deluca AM,Coffin D,et al.In vivo radiation protection by nitric oxide modulation.Cancer Res,1994,54:3365.
3 王吉村，莫简，孙长凯等.组织及组织液中一氧化氮的荧光分光光度法检测.第四军医大学学报，1995，16：463.
4 Dawson TM,Bredt DS,Fotuhi M,et al.Nitric oxide synthase and neuronal NADPH\|diaphorase are identical in brain and peripheral tissue.Proc Natl Acad Sci USA,1991,88:7797.
5 Kanwar S,Tepperman BL,Payne D,et al.Time course of nitric oxide production and epithelial dysfunction during ischemia/reperfusion of the feline small intestine,Circ Shock,1994,42:135
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6 Tepperman BL,Brown JF,Korolkiewicz R,et al.Nitric oxide synthase activity.viability and cyclic GMP levels in rat colonic epithelial cells,effect of endotoxin changes.J Pharmacol Exp Ther,1994,271:1477.
7 Ischiropoulos H,Zhu L,Chen J,et al.Peroxynitrite mediated tyrosine nitration catalysed by superoxide dismutase.Arch Biochem Biophys,1992,298:431.
8 魏立春，郭鹞.肠型放射病时小肠壁一氧化氮合酶的动态分布.第四军医大学学报，1995，16(1)：13.
(收稿：1997-01-07 修回：1997-09-01), http://www.100md.com
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关键词：硝基左旋精氨酸甲基酯；小肠；上皮细胞；一氧化氮；辐射
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目的 探讨硝基左旋精氨酸甲基酯(L\|NAME)对小肠上皮细胞辐射防护的机理。方法 实验用大鼠IEC\|6细胞，60Co\|γ射线照射；荧光分光光度法测定培养液上清中一氧化氮(NO)含量；NADPH黄递酶组化法(ND组化法)和免疫细胞化学法观察一氧化氮合酶(NOS)活性变化；MTT法检测细胞的生存力。结果 IEC\|6细胞经射照射后，其培养液上清中NO含量明显增加，细胞内结构型一氧化氮合酶(nNOS)活性升高，诱导型一氧化氮合酶(iNOS)活性降低，L\|NAME能明显提高细胞的生存力，NO底物\|左旋精氨酸(L\|Arg)部分逆转其作用。结论 NO参与了IEC\|6细胞的辐射损伤，L\|NAME对IEC\|6细胞具有辐射防护作用。
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Effect of L\|NAME on radiation\|induced IEC\|6 cell injury Ding Guirong Guo Yao Department of Radiation Medicine,The Military Medical University.Xian 710032 China.
Objective To study the effect of L\|NAME on radiation\|induced injury of small intestinal epithelial cells\|6(IEC\|6).Methods Rat IEC\|6 cells were irradiated with 60Co\|rays.The content of nitric oxide(NO) in media supernatant of IEC\|6 cells was measured by fluorometric method nitric oxide synthase (NOS) activity was observed by histochemistry of NADPH\|diaphase and immunocytochemistry.Cell viability was evaluated by method of MTT.Results NO generation by IEC\|6 cells was significantly increased after irradiation.The assay of nNOS activity showed that it was stimulated.iNOS activity was inhibited.L\|NAME was able to increase cell viability which had been reduced by irradiation,but it was reversed partly by pretreatment with NO substrsate\|L\|Arg.Conclusion NO was involved in IEC\|6 cell injury induced by radiation and L\|NAME could provide protective effect on it.
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Key words L\|NAME Small intestines Epithelial cells Nitric Oxide Radiation
已知NO(nitric oxide)是一种重要的细胞内信息分子，调节免疫功能、血管扩张和神经传递，它在维持血管完整性方面也起着重要作用。小肠作为辐射敏感器官，其损伤机理及治疗一直是放射医学中广为关注的问题。近来有文献报道[1，2]，γ射线照射小鼠后，其肝、肠等器官NO合成增加，用NO抑制剂预处理小鼠，可使其半数致死剂量明显提高，提示NO抑制剂具有辐射防护作用。本实验从γ射线照射后培养肠上皮NO含量测定、NOS活性检测及硝基左旋精氨酸甲基酯(L\|NAME)对细胞生存力的影响三个方面探讨L\|NAME对小肠上皮辐射防护的机理。
1 材料和方法
1.1 材料：IEC\|6细胞株为大鼠小肠上皮细胞株，由英国Paterson肿瘤研究所上皮生物室提供；NO检测试剂盒由本校化学教研室提供；链霉素抗生物素蛋白—过氧化酶免疫组化试剂盒(SP)为福州迈新生物技术有限公司产品；iNOS一抗为Santa Cruz公司产品。
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1.2 细胞培养：在含10%新生牛血清的DMEM培养体系中培养。每升培养液加青霉素10万U，链霉素100mg,NaHCO\-3 3.7g，胰岛素250U，0.02%EDTA消化细胞后传代，5%CO\-2恒温孵箱中培养。
1.3 照射：将细胞传代于培养板或培养皿中，用60Coγ射线照射，源距45cm，剂量率1.426Gy/min，吸收剂量8Gy，室温下进行。
1.4 IEC\|6细胞照射后培养上清中NO含量测定：将细胞消化传代于24孔培养板中(1.2×10\+4细胞/孔)，37℃孵育16～24小时后8Gyγ射线一次性照射，照毕立即换用新鲜培养液培养，分别于照后24，48和72小时培养上清按本校建立的NO检测方法[3]，检测NO\+-\-2含量，间接反应NO的生成情况。
1.5 IEC\|6细胞NOS活性检测：将传代细胞接种于预置有盖玻片的培养皿中培养，待细胞即将长满时，把长有细胞的盖玻片取出，用0.01%mol/L PBS冲洗后，4%多聚甲醛固定15分钟。ND组化反应液由β-NADPH(1mg/ml Sigma)和NBT(0.5mg/ml Sigma)组成，0.03%Triton x\|100配制(pH8.0)，将标本放入反应液中37℃孵育1小时，0.01mol/L PBS漂洗(5分钟×3)终止反应。iNOS免疫细胞化学染色，按试剂盒说明进行，DAB呈色。以上两反应完毕后，均酒精逐级脱水，二甲苯透明，中性树脂封固，镜下观察并照相。
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1.6 L\|NAME对照射细胞生存力的影响：将细胞传代于96孔培样板中(200细胞/孔)，孵育24小时，8Gyγ射线照射，照毕立即更换分别含有下列物质的新鲜培养液：L\|NAME(5×10-4mol/L),L\|NAME(5×10-4mol/L)加L\|Arg(5×10-3mol/L)，继续培养48小时后，加MTT20μl/孔(5mg/ml Sigma)，37℃孵育4小时，吸掉上清，加二甲基亚砜150μl/孔，振荡10分钟，在酶联免疫检测仪上测定570nm处OD值。
2 结果
2.1 细胞照射后培养液上清中NO含量变化
IEC\|6细胞经γ射线照射后，培养液上清中NO\+-\-2含量照后24小时为0.989±0.105pmol/10\+4cell,照后48小时为1.421±0.287pmol/10\+4cell,照后72小时为1.353±0.192pmol/10\+4cell,对照组为0.666±0.195pmol/10\+4cell。照后48、72小时培养上清中NO含量较对照组明显增加(P<0.05)。
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2.2 γ射线照射后IEC\|6细胞NOS活性变化
资料已证明NADPH黄递酶就是cNOS[4]，因此用ND组化法来观察cNOS的分布及活性已成为一种可靠而简便的方法。在本实验中可见cNOS位于IEC\|6细胞胞浆内，围绕胞核分布，阳性产物为蓝色颗粒状沉淀，胞核不着色(见图1)。iNOS免疫反应产物为棕色颗粒状沉淀，亦位为于胞浆，胞核周围着色较深，核不着色(见图3)。8Gyγ射线照射后，cNOS阳性产物着色加深，且有浓集现象(见图2)，iNOS免疫反应产物则着色变浅(见图4)。
2.3 L\|NAME对受照细胞生存力的影响
MTT法测定结果，单照组吸光度(A值)0.032±0.011，L\|NAME组的A值为0.104±0.027，L\|NAME加L\|Arg组A值0.071±0.011。同单照组相比，L\|NAME明显提高了IEC\|6细胞的生存力(P<0.01)，L\|Arg部分逆转了其作用(P<0.05)。
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3 讨论
实验结果表明培养的IEC\|6细胞具有钙依赖性的cNOS活性和钙非依赖性的iNOD活性。γ射线照射可使cNOS活性增加，iNOS活性降低，由于cNOS活性的增加大于iNOS活性的降低，从而导致了细胞释放NO增多，而NO与照射细胞的生存力密切相关。在细胞受照后立即给予NOS抑制剂L\|NAME，能明显提高细胞生存力，加入NO底物L\|Arg则部分逆转其作用。由此可见，NO参与了IEC\|6细胞的辐射损伤，如能抑制NO过量生成，则对细胞具有辐射保护作用。
资料表明，cNOS催化生成的NO具有神经递质和细胞信使的功能。在肠道，它通过抑制白细胞粘附和维持内脏血流发挥其保护作用。由iNOS催化生成的NO主要参与炎症及免疫应答过程，肠粘膜iNOS的表达可能是建立针对肠腔细菌的宿主化学屏障的重要方式。在机体正常状态下，cNOS和iNOS保持适当的活性水平，无论二者活性过高或过低对机体都是有害的[5，6]。在本实验中，由于照射后cNOS和iNOS活性的变化，导致NO释放增加。过量生成的NO与超氧可以生成一种高度细胞毒性氧化物—过亚硝酸盐[7]，它通过破坏线粒体的电子转移。巯基集团的氧化和脂质过氧化导致细胞毒性。过亚硝酸盐还可降解为毒性更大的羟自由基，从而造成不可逆的细胞损伤。
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魏立基等[8]在小鼠复制的肠型放射病模型中，发现照后48、72小时肠壁cNOS活性明显提高，且与受照小鼠肠腔扩张、肠壁充血、肠粘膜损伤等病理改变呈正相关。我们在实验中不仅观察到cNOS活性被诱导，而且还发现iNOS活性是抑制的，关于其抑制的病理生理学意义，尚待进一步探讨。众所周所，肠绒毛上皮的病理改变与肠隐窝细胞的损伤和修复有密切的关系。提高辐射后肠隐窝细胞的存活率是治疗肠型放射病的有效途径。本研究证明：NO参与了IEC\|6细胞的辐射损伤，NO抑制剂对小肠上皮细胞具有辐射防护作用。
参考文献
1 Voevodskaya NV and Vanin AF.Gamma\|irradiation potentiates L\|arginline\|dependent nitric oxside formation in mice.Biochem Biophy Res Commu,1992,186:1423.
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2 Liebamann J,Deluca AM,Coffin D,et al.In vivo radiation protection by nitric oxide modulation.Cancer Res,1994,54:3365.
3 王吉村，莫简，孙长凯等.组织及组织液中一氧化氮的荧光分光光度法检测.第四军医大学学报，1995，16：463.
4 Dawson TM,Bredt DS,Fotuhi M,et al.Nitric oxide synthase and neuronal NADPH\|diaphorase are identical in brain and peripheral tissue.Proc Natl Acad Sci USA,1991,88:7797.
5 Kanwar S,Tepperman BL,Payne D,et al.Time course of nitric oxide production and epithelial dysfunction during ischemia/reperfusion of the feline small intestine,Circ Shock,1994,42:135
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6 Tepperman BL,Brown JF,Korolkiewicz R,et al.Nitric oxide synthase activity.viability and cyclic GMP levels in rat colonic epithelial cells,effect of endotoxin changes.J Pharmacol Exp Ther,1994,271:1477.
7 Ischiropoulos H,Zhu L,Chen J,et al.Peroxynitrite mediated tyrosine nitration catalysed by superoxide dismutase.Arch Biochem Biophys,1992,298:431.
8 魏立春，郭鹞.肠型放射病时小肠壁一氧化氮合酶的动态分布.第四军医大学学报，1995，16(1)：13.
(收稿：1997-01-07 修回：1997-09-01), http://www.100md.com