COL7A1基因在痒疹样大疱性表皮松解症家系中的突变研究
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37c医学网
作者：陈喜雪 李冠群 朱学骏 杨学英 何勤
单位：陈喜雪(北京医科大学第一医院皮肤科100034)；李冠群(北京医科大学第一医院皮肤科100034)；朱学骏(北京医科大学第一医院皮肤科100034)；杨学英(贵阳医学院)；何勤(贵阳医学院)
关键词：表皮松解；大疱性；胶原；基因；突变
中华医学杂志001121
【摘要】 目的 了解一个痒疹样大疱性表皮松解症家系中的基因突变情况。方法 采用聚合酶链反应(PCR)，DNA直接测序以及等位基因特异引物的多重PCR方法，对一个痒疹样大疱性表皮松解症家系40人(其中患者23例)进行基因突变情况检测。结果 该家系中患者存在COL7A1上G6100A的突变导致VII型胶原的2034位的甘氨酸被精氨酸替代，而对照的健康人不存在此突变。结论 G2034R突变是引起该家系临床病变的特异突变，不是多态性变化。
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Study on COL7A1 gene mutation in a epidermolysis bullosa pruriginosa family
CHEN Xixue LI Guanqun ZHU Xuejun
(Department of Dermatology, The First Hospital of Beijing University, Beijing 100034, China)
【Abstract】 Objective To identify gene mutation of a epidermolysis bullosa pruriginosa family. Methods Polymerase chain reaction (PCR), DNA squencing, multiplex PCR using allele-specific oligonucleotide primers. Results A G6100A transition of COL7A1 was found in patients, resulting in G2034R substitution in type VⅡ collagen. The mutation was not found in control normal individuals. Conclusion The mutation of G2034R is the underlying cause of epidermolysis bullosa pruriginosa in this family, not common polymorphism.
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【Key words】 Epidermolysis bullosa； Collagen； Gene； Mutation
营养不良型大疱性表皮松解症(DEB)是以皮肤、粘膜脆性增加，容易出现水疱大疱的遗传性皮肤病。DEB是由于编码基底膜下带锚状纤维的主要组成成分——Ⅶ型胶原的基因COL7A1发生突变，导致锚状纤维在数量和质量产生异常而形成的。痒疹样大疱型表皮松解症是DEB中一种少见的显性遗传的临床亚型。本研究中，我们应用分子生物学技术对一个痒疹样大疱型表皮松解症的家系进行了基因突变的检测。
对象和方法
一、对象
贵州省贵阳市的一个痒疹样大疱性表皮松解症家系。家系4代现有40人，患者23人，其中男10人，女13人，家系图见图1。家系中的患者出生时均为轻度摩擦后出现水疱、大疱、糜烂。随着年龄增长，至成年后，主要的皮损为分布于四肢伸侧的痒疹样丘疹、结节、肥厚斑块伴有剧烈的瘙痒，极难发现水疱和糜烂,伴不同程度的甲板增厚。选择20例在我院体检的健康人及2例已在我科确诊为其他家系的DEB患者作为对照。
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图1 痒疹样大疱性表皮松解症家系图
二、方法
1.对皮损组织进行组织病理学检查，HE染色；作透射电镜检查；对Ⅶ型胶原作荧光抗体(LH7：2)间接免疫荧光检查。
2.基因组DNA的提取：取家系中6例患者、2名健康者及取对照组20名健康人和2例其他家系DEB患者的外周血10 ml(2%依地酸钠抗凝)，常规低渗法溶血，酚-氯仿抽提。
3.聚合酶链反应(PCR)扩增COL7A1：引物序列及反应体系：引物1：上游引物5′GGGTGTA-GCTGTACAGCCAC3′，下游引物5′CCCTCTTCC-CTCACTCTCCT3′，扩增73外显子，扩增片段287 bp。引物2：上游引物5′GCCTGACTGGACCTACTGGA3′，下游引物5′CTGCCTGTCGACCCTTGACC3′扩增85外显子,扩增片段258 bp。 引物3：上游引物5′CCAGGAGAGTGAGGGAAGAG3′，下游引物5′TAGGGTCAGAAATTCCAGGG3′，扩增74，75外显子，扩增片段370 bp。
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反应体系和条件：25 μl体系,上、下游引物各25 pmol，dNTP 0.5 μl(5 mmol/L)，MgCl2 1 μl(25 mmol/L)，Taq酶0.25 μl(5 U/μl)，模板DNA适量(100 ng左右)，94℃1 min，60℃1 min，72℃1 min，共35个循环。20 g/L琼脂糖凝胶电泳检查PCR产物 (溴化乙锭染色)。
4.PCR产物DNA直接测序：将家系中的一例患者、一名健康者的PCR产物用ABI373型DNA全自动测序仪测序。
5.多重PCR：两对引物在同一扩增体系下进行PCR扩增反应。引物1：上游引物5′GGGTGTAGCTGTACAGCCAC3，下游引物5′CCAGGCTTTCCAGGCTCCCT3′，根据突变位点设计的等位基因特异引物，当模板存在G6100A的突变时，可扩增出187 bp的产物。引物2：上游引物5′GGGTGTAGCTGTACAGCCAC3′下游引物5′CCCTCTTCCCTCACTCTCCT3′，此引物与扩增exon73的引物相同，在反应体系中作为对照，当反应成功时，所有模板均可扩增出287 bp的产物。扩增体系和条件：25 μl体系, 上游引物1：18.75 pmol，下游引物1：25 pmol；上游引物2：18.75 pmol，下游引物2：25 pmol，dNTP 0.5 μl(5 mmol/L)，MgCl2 1.5 μl(25 mmol/L) ，Taq酶0.5 μl(5 U/μl),模板DNA适量,94℃1 min，62℃1 min，72℃1 min，共35个循环。
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结果
一、形态学改变
大疱性表皮松解症的组织病理学表现为表皮下大疱，超微结构为致密板下带裂隙，锚状纤维部分减少；Ⅶ型胶原单克隆抗体线样沉积于基底膜带。
二、PCR扩增
引物1扩增出287 bp片段，(图2)它包括Ⅶ胶原基因第73外显子的全部及部分侧翼序列，编码部分中心三螺旋区。引物2扩增出258 bp片段，它包括Ⅶ型胶原基因第85外显子的全部及部分侧翼序列，编码部分中心三螺旋区。引物3扩增出370 bp片段，它包括Ⅶ型胶原基因第74，75外显子的全部及部分侧翼序列，编码部分中心三螺旋区。
M：DNA标记物(PGEM7Zf(+)/HaeⅢ)；1、2：家系中健康人；3～8：家系中患者
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图2 Exon73的扩增产物
三、PCR产物DNA直接测序
家系中患者的COL7A1的Exon73上发生点突变(图3)，导致第6 100位的鸟嘌呤突变为腺嘌呤，这一突变使得密码子GGG→AGG，从而导致2 034位的氨基酸从甘氨酸(G)→精氨酸(R)。
图3 DNA测序结果，G→A的碱基置换
四、多重PCR
家系中的患者扩增出287 bp DNA扩增片段，同时也扩增出187 bp的DNA扩增片段(图4)。在相同的反应体系和反应条件下，家系中的健康者、对照组的20名健康人以及2例与家系无血缘关系的DEB患者均只扩增出287 bp的DNA扩增片段，没有扩增出187 bp的DNA扩增片段。
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注：M：DNA标记物(PGEM7Zf(+)/HaeⅢ)；1、2：家系中健康人；3～8家系中患者
图4 等位基因特异引物的多重PCR
讨论
本研究显示，痒疹样大疱性表皮松解症家系中的患者出生时即出现水疱、糜烂，成人后又表现为痒疹样的丘疹、结节伴剧烈瘙痒，有典型的痒疹样大疱性表皮松解症的临床表现[1]，而且组织病理、超微结构也符合此诊断。家系的遗传方式是常染色体显性遗传，患者的锚状纤维部分减少及免疫荧光的结果与国外的对显性遗传DEB(DDEB)的研究结果一致[2]。由于DDEB的突变位点多位于73，74，75，85外显子，所以选择引物扩增这些区域。PCR产物测序的结果表明，家系中的患者存在COL7A1上6100位碱基G→A的点突变，导致了G2034R的氨基酸替代。
Ⅶ型胶原中心三螺旋胶原区的结构是特征性的连续Gly-Xaa-Yaa结构。迄今为止，各型DDEB除新生儿暂时性大疱性表皮松解症外，突变方式均为错义突变引起的Gly置换。胶原区Gly-Xaa-Yaa结构中的甘氨酸对于胶原分子的结构是至关重要的。只有当Gly被其他种类的氨基酸替代时，这种Gly-Xaa-Yaa结构才被改变。该家系中的G2034R这一错义突变影响了Ⅶ胶原中心三螺旋区24个连续的Gly-Xaa-Yaa结构，使2022位到2093位的氨基酸结构不稳定。含有这一突变的多肽长度没有缩短，但甘氨酸被替代有可能改变了三螺旋结构的稳定性，使Ⅶ型胶原分子易被蛋白水解酶降解，不能形成锚状纤维。虽然这种突变没有引起多肽分子的巨大变化，但Ⅶ型胶原是同源三聚体[proα(Ⅶ)3][3]，若突变与正常基因的表达相同，那么仅有1/8的胶原分子完全由正常的多肽组成，进而在形成Ⅶ胶原二聚体时则仅有1/64是完全由正常多肽形成的。
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为了证实所检测到的突变是引起病变的特异突变，必须证实家系中的患者均携带此突变，而家系中的健康者以及对照组健康人均无此突变。在本实验中，DNA直接测序发现家系中的患者发生了73外显子6100位碱基G→A的碱基置换。设计的等位基因特异引物的下游引物3′末端碱基为T，只能与突变的碱基A相配，上游引物与扩增73外显子的上游引物相同。这对引物只有当模板存在6100位G→A突变时才可扩增出187 bp片段，并同时采用了多重PCR的技术。将两对引物在同一PCR体系中扩增，一对是等位基因特异引物；另一对是扩增73外显子的引物。 家系中的患者DNA为模板时，多重PCR可以同时扩增出287 bp 和187bp两条片段，说明这些患者均存在73外显子6100位G→A 的碱基置换；而家系中的健康者、健康对照者及2例非该家系的DEB患者DNA为模板时，多重PCR可以扩增出287 bp 的片段，说明PCR反应是成功的，但是无187bp的扩增片段，证明没有发生6100位G→A 的碱基置换。说明，我们通过DNA直接测序发现的点突变是导致该家系临床病变的特异性突变，而不是由于个体或家系之间的基因多态性，也不是PCR过程中碱基错配或测序误差所引起的。特异引物参与的多重PCR为基因产前诊断提供了快速、经济检测突变的方法。
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基金项目：中华医学会诺华医学基金资助项目
参考文献
1，McGrath JA, Schofield OM, Eady RA, et al. Epidermolysis bullosa pruriginosa: dystrophic epidermolysis bullosa with distinctive clinicopathological features. Br J Dermatol, 1994,130: 617-625.
2，Heagerty AH, Kennedy AR, Leigh IM, et al. Identification of an epidermal basement membrane defect in recessive forms of dystrophic epidermolysis bullosa by LH 7:2 monoclonal antibody: use in diagnosis. Br J Dermatol, 1986,115: 125-131.
3，Burgeson RE. Type Ⅶ collagen, anchoring fibrils, and epidermolysis bullosa. J Invest Dermatol, 1993,101: 252-255.
(收稿日期：1999-11-26), 百拇医药
单位：陈喜雪(北京医科大学第一医院皮肤科100034)；李冠群(北京医科大学第一医院皮肤科100034)；朱学骏(北京医科大学第一医院皮肤科100034)；杨学英(贵阳医学院)；何勤(贵阳医学院)
关键词：表皮松解；大疱性；胶原；基因；突变
中华医学杂志001121
【摘要】 目的 了解一个痒疹样大疱性表皮松解症家系中的基因突变情况。方法 采用聚合酶链反应(PCR)，DNA直接测序以及等位基因特异引物的多重PCR方法，对一个痒疹样大疱性表皮松解症家系40人(其中患者23例)进行基因突变情况检测。结果 该家系中患者存在COL7A1上G6100A的突变导致VII型胶原的2034位的甘氨酸被精氨酸替代，而对照的健康人不存在此突变。结论 G2034R突变是引起该家系临床病变的特异突变，不是多态性变化。
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Study on COL7A1 gene mutation in a epidermolysis bullosa pruriginosa family
CHEN Xixue LI Guanqun ZHU Xuejun
(Department of Dermatology, The First Hospital of Beijing University, Beijing 100034, China)
【Abstract】 Objective To identify gene mutation of a epidermolysis bullosa pruriginosa family. Methods Polymerase chain reaction (PCR), DNA squencing, multiplex PCR using allele-specific oligonucleotide primers. Results A G6100A transition of COL7A1 was found in patients, resulting in G2034R substitution in type VⅡ collagen. The mutation was not found in control normal individuals. Conclusion The mutation of G2034R is the underlying cause of epidermolysis bullosa pruriginosa in this family, not common polymorphism.
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【Key words】 Epidermolysis bullosa； Collagen； Gene； Mutation
营养不良型大疱性表皮松解症(DEB)是以皮肤、粘膜脆性增加，容易出现水疱大疱的遗传性皮肤病。DEB是由于编码基底膜下带锚状纤维的主要组成成分——Ⅶ型胶原的基因COL7A1发生突变，导致锚状纤维在数量和质量产生异常而形成的。痒疹样大疱型表皮松解症是DEB中一种少见的显性遗传的临床亚型。本研究中，我们应用分子生物学技术对一个痒疹样大疱型表皮松解症的家系进行了基因突变的检测。
对象和方法
一、对象
贵州省贵阳市的一个痒疹样大疱性表皮松解症家系。家系4代现有40人，患者23人，其中男10人，女13人，家系图见图1。家系中的患者出生时均为轻度摩擦后出现水疱、大疱、糜烂。随着年龄增长，至成年后，主要的皮损为分布于四肢伸侧的痒疹样丘疹、结节、肥厚斑块伴有剧烈的瘙痒，极难发现水疱和糜烂,伴不同程度的甲板增厚。选择20例在我院体检的健康人及2例已在我科确诊为其他家系的DEB患者作为对照。
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图1 痒疹样大疱性表皮松解症家系图
二、方法
1.对皮损组织进行组织病理学检查，HE染色；作透射电镜检查；对Ⅶ型胶原作荧光抗体(LH7：2)间接免疫荧光检查。
2.基因组DNA的提取：取家系中6例患者、2名健康者及取对照组20名健康人和2例其他家系DEB患者的外周血10 ml(2%依地酸钠抗凝)，常规低渗法溶血，酚-氯仿抽提。
3.聚合酶链反应(PCR)扩增COL7A1：引物序列及反应体系：引物1：上游引物5′GGGTGTA-GCTGTACAGCCAC3′，下游引物5′CCCTCTTCC-CTCACTCTCCT3′，扩增73外显子，扩增片段287 bp。引物2：上游引物5′GCCTGACTGGACCTACTGGA3′，下游引物5′CTGCCTGTCGACCCTTGACC3′扩增85外显子,扩增片段258 bp。 引物3：上游引物5′CCAGGAGAGTGAGGGAAGAG3′，下游引物5′TAGGGTCAGAAATTCCAGGG3′，扩增74，75外显子，扩增片段370 bp。
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反应体系和条件：25 μl体系,上、下游引物各25 pmol，dNTP 0.5 μl(5 mmol/L)，MgCl2 1 μl(25 mmol/L)，Taq酶0.25 μl(5 U/μl)，模板DNA适量(100 ng左右)，94℃1 min，60℃1 min，72℃1 min，共35个循环。20 g/L琼脂糖凝胶电泳检查PCR产物 (溴化乙锭染色)。
4.PCR产物DNA直接测序：将家系中的一例患者、一名健康者的PCR产物用ABI373型DNA全自动测序仪测序。
5.多重PCR：两对引物在同一扩增体系下进行PCR扩增反应。引物1：上游引物5′GGGTGTAGCTGTACAGCCAC3，下游引物5′CCAGGCTTTCCAGGCTCCCT3′，根据突变位点设计的等位基因特异引物，当模板存在G6100A的突变时，可扩增出187 bp的产物。引物2：上游引物5′GGGTGTAGCTGTACAGCCAC3′下游引物5′CCCTCTTCCCTCACTCTCCT3′，此引物与扩增exon73的引物相同，在反应体系中作为对照，当反应成功时，所有模板均可扩增出287 bp的产物。扩增体系和条件：25 μl体系, 上游引物1：18.75 pmol，下游引物1：25 pmol；上游引物2：18.75 pmol，下游引物2：25 pmol，dNTP 0.5 μl(5 mmol/L)，MgCl2 1.5 μl(25 mmol/L) ，Taq酶0.5 μl(5 U/μl),模板DNA适量,94℃1 min，62℃1 min，72℃1 min，共35个循环。
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结果
一、形态学改变
大疱性表皮松解症的组织病理学表现为表皮下大疱，超微结构为致密板下带裂隙，锚状纤维部分减少；Ⅶ型胶原单克隆抗体线样沉积于基底膜带。
二、PCR扩增
引物1扩增出287 bp片段，(图2)它包括Ⅶ胶原基因第73外显子的全部及部分侧翼序列，编码部分中心三螺旋区。引物2扩增出258 bp片段，它包括Ⅶ型胶原基因第85外显子的全部及部分侧翼序列，编码部分中心三螺旋区。引物3扩增出370 bp片段，它包括Ⅶ型胶原基因第74，75外显子的全部及部分侧翼序列，编码部分中心三螺旋区。
M：DNA标记物(PGEM7Zf(+)/HaeⅢ)；1、2：家系中健康人；3～8：家系中患者
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图2 Exon73的扩增产物
三、PCR产物DNA直接测序
家系中患者的COL7A1的Exon73上发生点突变(图3)，导致第6 100位的鸟嘌呤突变为腺嘌呤，这一突变使得密码子GGG→AGG，从而导致2 034位的氨基酸从甘氨酸(G)→精氨酸(R)。
图3 DNA测序结果，G→A的碱基置换
四、多重PCR
家系中的患者扩增出287 bp DNA扩增片段，同时也扩增出187 bp的DNA扩增片段(图4)。在相同的反应体系和反应条件下，家系中的健康者、对照组的20名健康人以及2例与家系无血缘关系的DEB患者均只扩增出287 bp的DNA扩增片段，没有扩增出187 bp的DNA扩增片段。
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注：M：DNA标记物(PGEM7Zf(+)/HaeⅢ)；1、2：家系中健康人；3～8家系中患者
图4 等位基因特异引物的多重PCR
讨论
本研究显示，痒疹样大疱性表皮松解症家系中的患者出生时即出现水疱、糜烂，成人后又表现为痒疹样的丘疹、结节伴剧烈瘙痒，有典型的痒疹样大疱性表皮松解症的临床表现[1]，而且组织病理、超微结构也符合此诊断。家系的遗传方式是常染色体显性遗传，患者的锚状纤维部分减少及免疫荧光的结果与国外的对显性遗传DEB(DDEB)的研究结果一致[2]。由于DDEB的突变位点多位于73，74，75，85外显子，所以选择引物扩增这些区域。PCR产物测序的结果表明，家系中的患者存在COL7A1上6100位碱基G→A的点突变，导致了G2034R的氨基酸替代。
Ⅶ型胶原中心三螺旋胶原区的结构是特征性的连续Gly-Xaa-Yaa结构。迄今为止，各型DDEB除新生儿暂时性大疱性表皮松解症外，突变方式均为错义突变引起的Gly置换。胶原区Gly-Xaa-Yaa结构中的甘氨酸对于胶原分子的结构是至关重要的。只有当Gly被其他种类的氨基酸替代时，这种Gly-Xaa-Yaa结构才被改变。该家系中的G2034R这一错义突变影响了Ⅶ胶原中心三螺旋区24个连续的Gly-Xaa-Yaa结构，使2022位到2093位的氨基酸结构不稳定。含有这一突变的多肽长度没有缩短，但甘氨酸被替代有可能改变了三螺旋结构的稳定性，使Ⅶ型胶原分子易被蛋白水解酶降解，不能形成锚状纤维。虽然这种突变没有引起多肽分子的巨大变化，但Ⅶ型胶原是同源三聚体[proα(Ⅶ)3][3]，若突变与正常基因的表达相同，那么仅有1/8的胶原分子完全由正常的多肽组成，进而在形成Ⅶ胶原二聚体时则仅有1/64是完全由正常多肽形成的。
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为了证实所检测到的突变是引起病变的特异突变，必须证实家系中的患者均携带此突变，而家系中的健康者以及对照组健康人均无此突变。在本实验中，DNA直接测序发现家系中的患者发生了73外显子6100位碱基G→A的碱基置换。设计的等位基因特异引物的下游引物3′末端碱基为T，只能与突变的碱基A相配，上游引物与扩增73外显子的上游引物相同。这对引物只有当模板存在6100位G→A突变时才可扩增出187 bp片段，并同时采用了多重PCR的技术。将两对引物在同一PCR体系中扩增，一对是等位基因特异引物；另一对是扩增73外显子的引物。 家系中的患者DNA为模板时，多重PCR可以同时扩增出287 bp 和187bp两条片段，说明这些患者均存在73外显子6100位G→A 的碱基置换；而家系中的健康者、健康对照者及2例非该家系的DEB患者DNA为模板时，多重PCR可以扩增出287 bp 的片段，说明PCR反应是成功的，但是无187bp的扩增片段，证明没有发生6100位G→A 的碱基置换。说明，我们通过DNA直接测序发现的点突变是导致该家系临床病变的特异性突变，而不是由于个体或家系之间的基因多态性，也不是PCR过程中碱基错配或测序误差所引起的。特异引物参与的多重PCR为基因产前诊断提供了快速、经济检测突变的方法。
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参考文献
1，McGrath JA, Schofield OM, Eady RA, et al. Epidermolysis bullosa pruriginosa: dystrophic epidermolysis bullosa with distinctive clinicopathological features. Br J Dermatol, 1994,130: 617-625.
2，Heagerty AH, Kennedy AR, Leigh IM, et al. Identification of an epidermal basement membrane defect in recessive forms of dystrophic epidermolysis bullosa by LH 7:2 monoclonal antibody: use in diagnosis. Br J Dermatol, 1986,115: 125-131.
3，Burgeson RE. Type Ⅶ collagen, anchoring fibrils, and epidermolysis bullosa. J Invest Dermatol, 1993,101: 252-255.
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