六亚甲基双乙酰胺对Mc3的转移抑制作用
http://www.100md.com
37c医学网
作者：吴军正 陈建元 李峰 王晓岚
单位：吴军正 陈建元 李峰(西安第四军医大学口腔医学院 710032)；王晓岚(解放军36141部队医院)
关键词：六亚甲基双乙酰胺；涎腺；粘液表皮样癌；肿瘤转移
实用口腔医学杂志000501
〔摘要〕 目的：研究六亚甲基双乙酰胺(HMBA)对涎腺粘液表皮样癌高转移细胞Mc3恶性表型的影响。方法：采用MTT法、细胞计数法、克隆形成法、流式细胞术及癌细胞裸鼠尾静脉注射法(每只鼠106个细胞)研究HMBA对Mc3细胞生长以及转移力的抑制作用。结果：HMBA在1 mmol/L时对Mc3细胞生长抑制率为36%，作用于Mc3细胞5 d后对照组和处理组细胞倍增时间(h)分别为20.8和23.5，S细胞比例(%)为24.5和23.0。野生型P53蛋白表达率(%)为24.0和99.7，nm23-H1蛋白表达率(%)为99.9和98.9，克隆形成率(%)为23.5和16.0，在裸鼠肺表面转移结节数为139±61和83±37。结论：HMBA可抑制Mc3细胞的转移力，其机制可能与诱导分化作用有关。
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中图分类号：R73-37 文献标识码：A 文章编号：1001-3733(2000)05-0335-03
Inhibition of the metastatic potential of mucoepidermoid carcinoma Mc3 cells by hexamethylene bisacetamide
Wu Junzheng Chen Jianyuan Li Feng
(Department of Oral Biology,Stomatological College, Fourth Military Medical University, Xi'an 710032)
〔Abstract〕Objective: To study the effects of hexamethylene bisacetamide(HMBA) on the metastatic potential of mucoepidermoid carcinoma Mc3 cells. Methods: The effects of HMBA on the metastatic potential of Mc3 cells were studied with MTT assay, cell counting, flow cytometry and tail vein injection of the cells into nude mice(106 for each).Results: At the dose of 0.001 6～1 mmol/L HMBA inhibited Mc3 cell growth by 6.7%～36.1% in a dose dependant way. After the cells had been treated with 1 mmol/L of HMBA for 5 d the doubling time of the cells was 23.5 h, the percentage of S-phase cell 23.0%, that of wild type P53 protein expression 99.7%, nm23-H1 98.9%, clonogenecity 16.0%, number of metastatic foci on lung surface 83±37, respectively; while those of untreated cells were 20.8 h, 24.5%, 24.0%,99.9%,23.5% and 139±61 respectively.Conclusion: HMBA may inhibit the metastatic potential of Mc3 cells and the effects may be related to differentiation induction.
, 百拇医药
Key words Hexamethylene bisacetamide; Salivary glands; Mucoepidermoid carcinoma; neoplasm metastasis
六亚甲基双乙酰胺(HMBA)是研究较为广泛的分化诱导剂之一，它不仅能逆转肿瘤细胞的恶性表型，而且与辐射疗法、化学疗法联合运用具有协同效应〔1，2〕。最近我们从人粘液表皮样癌细胞系MEC-1中分离筛选出高转移细胞株Mc3〔3〕，实验研究发现HMBA可抑制Mc3细胞的增殖速度及转移力，现报道如下。
1 材料和方法
1.1 细胞株
人粘液表皮样癌高转移株Mc3由吴军正等建立，培养条件与母细胞系MEC-1相同〔3〕。
, 百拇医药
1.2 药物HMBA
购自中国科学院兰州化学物理研究所。
1.3 实验动物
裸小鼠BALB/cpbi-nu系由中国药品生物检定所动物繁育场提供。
1.4 主要试剂
抗野生型P53蛋白单克隆抗体，P53(鼠抗人基因重组单克隆抗体DO-1，工作浓度1∶200)购自美国Santa Cruz Biotechnology Ins,抗nm23-H1蛋白单克隆抗体(鼠抗人基因重组单克隆抗体Ab-1，工作浓度1∶100)购自美国Oncogene Science,羊抗鼠荧光标记抗体为美国Jackso Immuno Laboratories Ins.产品。
1.5 细胞增殖抑制试验
, 百拇医药
按常规MTT法在96孔板中进行〔4〕，HMBA的测试浓度范围为0.001 6～1 mmol/L，每组6孔，实验重复3次，取平均值作图。
1.6 细胞预处理
用1 mmol/L HMBA作用于Mc3细胞5 d，然后除去药物，并以未经药物处理的细胞为对照，进行以下试验。
1.7 细胞生长曲线测定
用细胞计数法在24孔培养板中进行，每孔接种104个细胞，培养8 d，每天取3孔计数，实验进行两次取平均数绘制生长曲线，计算对数生长期细胞群体倍增时间〔4〕。
1.8 细胞周期测定
常规制备样品，经DNA荧光染料(PI)染色后，用流式细胞仪及其相应软件测定分析〔4〕。
, 百拇医药
1.9 野生型P53和nm23-H1蛋白表达阳性率测定
消化收集对数生长期细胞107个，按免疫荧光法染色，用流式细胞仪测定荧光着色阳性率〔4〕。
1.10 克隆形成率测定
用软琼脂克隆形成法24孔培养板中进行〔4〕，底层为含φ=20%胎牛血清和φ=0.4%琼脂的培养液，上层培养液中含琼脂0.25%和200个细胞，每组8孔，培养2周，倒置显微镜下计数克隆数，每个集落细胞数大于或等于50时定为1个克隆。
1.11 细胞在裸鼠肺表面的转移结节形成率
将细胞充分消化悬浮于无血清培养液中，通过尾静脉给每只鼠注射106个细胞(0.2 ml悬液)，每组5只，8周后脱颈法处死，切取肺脏，计数肺表面转移结节。
, 百拇医药
2 结 果
2.1 HMBA对Mc3细胞的增殖抑制作用
HMBA对Mc3细胞呈现浓度依赖性增殖抑制效应，在测试浓度范围内作用较弱(图1)。
2.2 HMBA预处理后Mc3细胞倍增时间和细胞周期的变化
对照组和处理组细胞生长曲线见图2。群体倍增时间分别为20.8 h和23.5 h。细胞周期变化见表1。
图1 HMBA对Mc3细胞增殖抑制作用
图2 HMBA处理后Mc3细胞的生长曲线
, 百拇医药
表1 HMBA对Mc3细胞周期的影响* 组别
细胞周期分布(%)
G1
S
G2+M
对照
67.7
24.5
7.8
HMBA
68.6
17.8
, 百拇医药
13.6
*n>10 000
2.3 HNBA对Mc3细胞野生型P53和nm23-H1蛋白表达率的影响(见表2)。表2 HMBA对Mc3细胞2种蛋白表达率的影响* 组别
阳性率(%)
野生型P53
nm23-H1
对照
24.0
99.9
HNBA
99.7
, http://www.100md.com
98.9
*n>10 000
2.4 HMBA对Mc3细胞克隆形成率的影响(见表3)。表3 HMBA对Mc3细胞克隆形成率的影响 组别
各孔克隆计数
±s
%
对照
56 45 41 35 50 56 44 48
47±7
23.5
HMBA
, 百拇医药
23 38 29 47 42 22 32 18
32±10
16.0
2.5 HMBA对Mc3细胞转移力的影响(见表4)。表4 Mc3细胞在裸鼠肺表面的转移结节数
组别
每只裸鼠转移结节数±s
对照
158 83 71 215 169
139±61
HMBA
, 百拇医药
145 82 50 61 78
83±37
3 讨 论
肿瘤转移是一个多因素、多步骤、极为复杂的过程，其机制尚未完全阐明。近年来的研究表明肿瘤转移与瘤细胞的分化状态有关。一些具有诱导分化作用的物质，如维甲酸(RA)、二甲基亚矾(DMSD)、HMBA等以及某些扶正祛邪的中药或中药提取物(如单参酮)可逆转高转移癌细胞的恶性表型，抑制癌转移〔5〕。
本研究中发现HMBA对人涎腺粘液表皮样癌高转移细胞Mc3有一定增殖抑制作用，浓度为0.001 6 mmol/L时对Mc3细胞的抑制率为6.7%，浓度升高625倍达1 mmol/L时抑制率仅为36.1%。在这一浓度范围内未表现出明显的细胞毒性作用(未达到50%抑制)。50%抑制浓度(IC50)是表达药物细胞毒性的单位，一般细胞毒性药往往在一个浓度相差10～100倍的区间使增殖抑制率达到50%以上。1～5 mmol/L是普遍认可的HMBA的诱导分化浓度。药理学研究证明HMBA在血浆中的稳态浓度为1～2 mmol/L〔2〕。本研究采用了1 mmol/L作用于Mc3细胞5 d，然后除去药物再进行有关试验，发现HMBA使得Mc3细胞增殖速度减缓，倍增时间延长，G1期细胞比例增加但幅度较小，S期细胞明显减少，而G2+M期明显增加，即HMBA可使部分细胞阻滞在G2期，致使细胞倍增时间延长。
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在双层软脂培养系统中，细胞呈单独悬浮状，既不贴壁，也不与其他细胞接触，因此可用于细胞克隆筛选或测试单个细胞的增殖能力。以往的研究发现体外试验中癌细胞的克隆形成率与体内试验中癌细胞的转移力有较好相关性〔3〕。本研究中发现Mc3细胞经HMBA预处理后克隆形成率下降了32%，在裸鼠体内的转移力下降了40%。体内外试验均证明HMBA预处理过程使得Mc3细胞的转移力受到了抑制。
p53基因是一个抑癌基因，也是一个转移抑制基因。以往的研究已证实Mc3细胞的高转移性与P53低表达有关〔3〕。本研究发现HMBA预处理后Mc3细胞野生型P53蛋白表达率明显升高，这可能是HMBA减缓Mc3细胞增殖、抑制其转移的分子机制之一。nm23-H1也是一个癌转移抑制基因，对乳腺癌、肺癌等多种癌转移有抑制作用，但也有报道表明它有促使癌转移的功能〔7，8〕。本研究的结果显示HMBA预处理后Mc3细胞转移力下降，但nm23-H1蛋白表达率下降了1%，其原因是由于该基因对Mc3细胞转移有正向调节作用、或是由于群体表达率下降但个体细胞内表达增强、或是其蛋白功能状态变化，这些都是有待继续探讨的问题。
, http://www.100md.com
本课题为陕西省自然科学基金资助项目 99SM32
参考文献
1，司徒镇强,吴军正,贾保军,等.分化诱导剂HMBA与丝裂霉素或顺铂联合应用对耐药MEC-1细胞的作用.实用口腔医学杂志,1994,10(1):46
2，刘斌,司徒镇强,吴军正,等.HMBA联合辐射对人体粘液表皮样癌MEC-1细胞的抑制作用.实用口腔医学杂志,1995,11(2):136
3，Wu JZ,Situ ZQ,Liu ZB,et al.Selection and characterization of a highly metastatic cel l clone from mucoepidermoid carcinoma cell line derived from human salivary gland.Chin J Dent Res,1998,1(1):71
, 百拇医药
4，司徒镇强,吴军正主编.细胞培养.西安:世界图书出版公司,1996.181
5，张志谦,林仲翔,吕有勇,等.高转移人肺癌表型去恶化研究.中华肿瘤杂志,1994,16(2):88
6，Carmichael J,Metchell JB,DeGraff WG,et al.Chemosensitivity testing of human lung cancer cell lines using the MTT assay.Br J Cancer,1988,57(3):540
7，Jiang WG,Puntis MC,Hallett MB.Molecular and cellular basis of cancer invasion and metastasis:Implication for treatment.Br J Surg,1994,81(11):1576
8，Duenas-Gonzalez A,Abad-Hernandex MM,Garcia-Mata J,et al .Analysis of nm23-H1 expression in breast cancer.Correlation with p53 expression and clinicopathologic findings. Cancer Lett,1996,101(2):137
(收稿：1999-10-20), 百拇医药
单位：吴军正 陈建元 李峰(西安第四军医大学口腔医学院 710032)；王晓岚(解放军36141部队医院)
关键词：六亚甲基双乙酰胺；涎腺；粘液表皮样癌；肿瘤转移
实用口腔医学杂志000501
〔摘要〕 目的：研究六亚甲基双乙酰胺(HMBA)对涎腺粘液表皮样癌高转移细胞Mc3恶性表型的影响。方法：采用MTT法、细胞计数法、克隆形成法、流式细胞术及癌细胞裸鼠尾静脉注射法(每只鼠106个细胞)研究HMBA对Mc3细胞生长以及转移力的抑制作用。结果：HMBA在1 mmol/L时对Mc3细胞生长抑制率为36%，作用于Mc3细胞5 d后对照组和处理组细胞倍增时间(h)分别为20.8和23.5，S细胞比例(%)为24.5和23.0。野生型P53蛋白表达率(%)为24.0和99.7，nm23-H1蛋白表达率(%)为99.9和98.9，克隆形成率(%)为23.5和16.0，在裸鼠肺表面转移结节数为139±61和83±37。结论：HMBA可抑制Mc3细胞的转移力，其机制可能与诱导分化作用有关。
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中图分类号：R73-37 文献标识码：A 文章编号：1001-3733(2000)05-0335-03
Inhibition of the metastatic potential of mucoepidermoid carcinoma Mc3 cells by hexamethylene bisacetamide
Wu Junzheng Chen Jianyuan Li Feng
(Department of Oral Biology,Stomatological College, Fourth Military Medical University, Xi'an 710032)
〔Abstract〕Objective: To study the effects of hexamethylene bisacetamide(HMBA) on the metastatic potential of mucoepidermoid carcinoma Mc3 cells. Methods: The effects of HMBA on the metastatic potential of Mc3 cells were studied with MTT assay, cell counting, flow cytometry and tail vein injection of the cells into nude mice(106 for each).Results: At the dose of 0.001 6～1 mmol/L HMBA inhibited Mc3 cell growth by 6.7%～36.1% in a dose dependant way. After the cells had been treated with 1 mmol/L of HMBA for 5 d the doubling time of the cells was 23.5 h, the percentage of S-phase cell 23.0%, that of wild type P53 protein expression 99.7%, nm23-H1 98.9%, clonogenecity 16.0%, number of metastatic foci on lung surface 83±37, respectively; while those of untreated cells were 20.8 h, 24.5%, 24.0%,99.9%,23.5% and 139±61 respectively.Conclusion: HMBA may inhibit the metastatic potential of Mc3 cells and the effects may be related to differentiation induction.
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Key words Hexamethylene bisacetamide; Salivary glands; Mucoepidermoid carcinoma; neoplasm metastasis
六亚甲基双乙酰胺(HMBA)是研究较为广泛的分化诱导剂之一，它不仅能逆转肿瘤细胞的恶性表型，而且与辐射疗法、化学疗法联合运用具有协同效应〔1，2〕。最近我们从人粘液表皮样癌细胞系MEC-1中分离筛选出高转移细胞株Mc3〔3〕，实验研究发现HMBA可抑制Mc3细胞的增殖速度及转移力，现报道如下。
1 材料和方法
1.1 细胞株
人粘液表皮样癌高转移株Mc3由吴军正等建立，培养条件与母细胞系MEC-1相同〔3〕。
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1.2 药物HMBA
购自中国科学院兰州化学物理研究所。
1.3 实验动物
裸小鼠BALB/cpbi-nu系由中国药品生物检定所动物繁育场提供。
1.4 主要试剂
抗野生型P53蛋白单克隆抗体，P53(鼠抗人基因重组单克隆抗体DO-1，工作浓度1∶200)购自美国Santa Cruz Biotechnology Ins,抗nm23-H1蛋白单克隆抗体(鼠抗人基因重组单克隆抗体Ab-1，工作浓度1∶100)购自美国Oncogene Science,羊抗鼠荧光标记抗体为美国Jackso Immuno Laboratories Ins.产品。
1.5 细胞增殖抑制试验
, 百拇医药
按常规MTT法在96孔板中进行〔4〕，HMBA的测试浓度范围为0.001 6～1 mmol/L，每组6孔，实验重复3次，取平均值作图。
1.6 细胞预处理
用1 mmol/L HMBA作用于Mc3细胞5 d，然后除去药物，并以未经药物处理的细胞为对照，进行以下试验。
1.7 细胞生长曲线测定
用细胞计数法在24孔培养板中进行，每孔接种104个细胞，培养8 d，每天取3孔计数，实验进行两次取平均数绘制生长曲线，计算对数生长期细胞群体倍增时间〔4〕。
1.8 细胞周期测定
常规制备样品，经DNA荧光染料(PI)染色后，用流式细胞仪及其相应软件测定分析〔4〕。
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1.9 野生型P53和nm23-H1蛋白表达阳性率测定
消化收集对数生长期细胞107个，按免疫荧光法染色，用流式细胞仪测定荧光着色阳性率〔4〕。
1.10 克隆形成率测定
用软琼脂克隆形成法24孔培养板中进行〔4〕，底层为含φ=20%胎牛血清和φ=0.4%琼脂的培养液，上层培养液中含琼脂0.25%和200个细胞，每组8孔，培养2周，倒置显微镜下计数克隆数，每个集落细胞数大于或等于50时定为1个克隆。
1.11 细胞在裸鼠肺表面的转移结节形成率
将细胞充分消化悬浮于无血清培养液中，通过尾静脉给每只鼠注射106个细胞(0.2 ml悬液)，每组5只，8周后脱颈法处死，切取肺脏，计数肺表面转移结节。
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2 结 果
2.1 HMBA对Mc3细胞的增殖抑制作用
HMBA对Mc3细胞呈现浓度依赖性增殖抑制效应，在测试浓度范围内作用较弱(图1)。
2.2 HMBA预处理后Mc3细胞倍增时间和细胞周期的变化
对照组和处理组细胞生长曲线见图2。群体倍增时间分别为20.8 h和23.5 h。细胞周期变化见表1。
图1 HMBA对Mc3细胞增殖抑制作用
图2 HMBA处理后Mc3细胞的生长曲线
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表1 HMBA对Mc3细胞周期的影响* 组别
细胞周期分布(%)
G1
S
G2+M
对照
67.7
24.5
7.8
HMBA
68.6
17.8
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13.6
*n>10 000
2.3 HNBA对Mc3细胞野生型P53和nm23-H1蛋白表达率的影响(见表2)。表2 HMBA对Mc3细胞2种蛋白表达率的影响* 组别
阳性率(%)
野生型P53
nm23-H1
对照
24.0
99.9
HNBA
99.7
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*n>10 000
2.4 HMBA对Mc3细胞克隆形成率的影响(见表3)。表3 HMBA对Mc3细胞克隆形成率的影响 组别
各孔克隆计数
±s%
对照
56 45 41 35 50 56 44 48
47±7
23.5
HMBA
, 百拇医药
23 38 29 47 42 22 32 18
32±10
16.0
2.5 HMBA对Mc3细胞转移力的影响(见表4)。表4 Mc3细胞在裸鼠肺表面的转移结节数
组别
每只裸鼠转移结节数
±s对照
158 83 71 215 169
139±61
HMBA
, 百拇医药
145 82 50 61 78
83±37
3 讨 论
肿瘤转移是一个多因素、多步骤、极为复杂的过程，其机制尚未完全阐明。近年来的研究表明肿瘤转移与瘤细胞的分化状态有关。一些具有诱导分化作用的物质，如维甲酸(RA)、二甲基亚矾(DMSD)、HMBA等以及某些扶正祛邪的中药或中药提取物(如单参酮)可逆转高转移癌细胞的恶性表型，抑制癌转移〔5〕。
本研究中发现HMBA对人涎腺粘液表皮样癌高转移细胞Mc3有一定增殖抑制作用，浓度为0.001 6 mmol/L时对Mc3细胞的抑制率为6.7%，浓度升高625倍达1 mmol/L时抑制率仅为36.1%。在这一浓度范围内未表现出明显的细胞毒性作用(未达到50%抑制)。50%抑制浓度(IC50)是表达药物细胞毒性的单位，一般细胞毒性药往往在一个浓度相差10～100倍的区间使增殖抑制率达到50%以上。1～5 mmol/L是普遍认可的HMBA的诱导分化浓度。药理学研究证明HMBA在血浆中的稳态浓度为1～2 mmol/L〔2〕。本研究采用了1 mmol/L作用于Mc3细胞5 d，然后除去药物再进行有关试验，发现HMBA使得Mc3细胞增殖速度减缓，倍增时间延长，G1期细胞比例增加但幅度较小，S期细胞明显减少，而G2+M期明显增加，即HMBA可使部分细胞阻滞在G2期，致使细胞倍增时间延长。
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在双层软脂培养系统中，细胞呈单独悬浮状，既不贴壁，也不与其他细胞接触，因此可用于细胞克隆筛选或测试单个细胞的增殖能力。以往的研究发现体外试验中癌细胞的克隆形成率与体内试验中癌细胞的转移力有较好相关性〔3〕。本研究中发现Mc3细胞经HMBA预处理后克隆形成率下降了32%，在裸鼠体内的转移力下降了40%。体内外试验均证明HMBA预处理过程使得Mc3细胞的转移力受到了抑制。
p53基因是一个抑癌基因，也是一个转移抑制基因。以往的研究已证实Mc3细胞的高转移性与P53低表达有关〔3〕。本研究发现HMBA预处理后Mc3细胞野生型P53蛋白表达率明显升高，这可能是HMBA减缓Mc3细胞增殖、抑制其转移的分子机制之一。nm23-H1也是一个癌转移抑制基因，对乳腺癌、肺癌等多种癌转移有抑制作用，但也有报道表明它有促使癌转移的功能〔7，8〕。本研究的结果显示HMBA预处理后Mc3细胞转移力下降，但nm23-H1蛋白表达率下降了1%，其原因是由于该基因对Mc3细胞转移有正向调节作用、或是由于群体表达率下降但个体细胞内表达增强、或是其蛋白功能状态变化，这些都是有待继续探讨的问题。
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本课题为陕西省自然科学基金资助项目 99SM32
参考文献
1，司徒镇强,吴军正,贾保军,等.分化诱导剂HMBA与丝裂霉素或顺铂联合应用对耐药MEC-1细胞的作用.实用口腔医学杂志,1994,10(1):46
2，刘斌,司徒镇强,吴军正,等.HMBA联合辐射对人体粘液表皮样癌MEC-1细胞的抑制作用.实用口腔医学杂志,1995,11(2):136
3，Wu JZ,Situ ZQ,Liu ZB,et al.Selection and characterization of a highly metastatic cel l clone from mucoepidermoid carcinoma cell line derived from human salivary gland.Chin J Dent Res,1998,1(1):71
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4，司徒镇强,吴军正主编.细胞培养.西安:世界图书出版公司,1996.181
5，张志谦,林仲翔,吕有勇,等.高转移人肺癌表型去恶化研究.中华肿瘤杂志,1994,16(2):88
6，Carmichael J,Metchell JB,DeGraff WG,et al.Chemosensitivity testing of human lung cancer cell lines using the MTT assay.Br J Cancer,1988,57(3):540
7，Jiang WG,Puntis MC,Hallett MB.Molecular and cellular basis of cancer invasion and metastasis:Implication for treatment.Br J Surg,1994,81(11):1576
8，Duenas-Gonzalez A,Abad-Hernandex MM,Garcia-Mata J,et al .Analysis of nm23-H1 expression in breast cancer.Correlation with p53 expression and clinicopathologic findings. Cancer Lett,1996,101(2):137
(收稿：1999-10-20), 百拇医药