c-myc反义寡核苷酸对粘液表皮样癌细胞生长的抑制作用
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37c医学网
作者：王石光 司徒镇强 吴军正 刘斌
单位：王石光(广州军区广州总医院口腔科 510010)；司徒镇强 吴军正 刘斌(第四军医大学口腔医学院)
关键词：粘液表皮样癌；myc基因；反义寡核苷酸类
实用口腔医学杂志000520
〔摘要〕 目的：探讨c-myc基因的反义寡核苷酸(ASODN)在涎腺粘液表皮 样癌基因治疗中的 作用。方法：人工合成与c-myc基因第二外显子翻译起 始区序列互补的寡核苷酸，处理培养 的人涎腺粘液表皮样癌MEC-1细胞。应用MTT比色法观察其对细胞增殖的影响；流式细胞仪 检 测对细胞周期的影响；并采用免疫组化法检测C-MYC蛋白的表达。结果：c-myc反义寡核苷酸 能抑制粘液表皮样癌MEC-1细胞的增殖，抑制作用具有浓度及时间依赖性。50%抑制浓度(IC 50)为8.2 μmol/L。用浓度为10 μmol/L的c-myc ASODN处理72 h，对MEC-1细 胞的抑 制率达59%。c-myc ASODN抑制MEC-1细胞从G1期进入S期；并能抑制C-MYC蛋白的表 达。结论：c-myc反义寡核苷酸对粘液表皮样癌MEC-1细胞有特异性抑制 作用。
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中图分类号：R739.87 文献标识码：A 文章编号：1001-3733(2000)05-0391-03
In vitro inhibitary effects of antisense oligodeoxynucleotides of c-myc gene on mucoepidermoid carcinoma MEC-1 cells
Wang Shiguang Situ Zhenqiang Wu Junzheng
(Department of Dentistry,General Hospital of Guangzhou Military District,Guangzhou 510010)
〔Abstract〕Objective:To investigate the effects of antisense oligode oxynucleoti des (ASODN) of c-myc gene on the growth of human mucoepidermoid carcinoma M EC- 1 cells.Methods:From translation initiation region of seco nd extron of human c-myc gene,15-Mer antisense (ASODN),sense,and mismatche d oligonucleotides were sy nthesized and modified with phosphorothioate.Mucoepidermoid carcinoma MEC-1 cel ls derived from human salivary gland were treated with c-myc ASODN at vario us c oncentrations.The influence of c-myc ASODN on cell growth and cell cycle di stri bution were analysed with MTT assay and flow-cytometry,respectively.C-MYC prot ein expression was detected with immunohistochemical staining.Results :c-myc ASO DN inhibited MEC-1 cell growth in a dose-and time-dependent manner.The IC 50 value was 8.2 μmol/L.The growth of MEC-1 decreased by 59% when coculture d with 10 μmol/L ASODN for 72 h.c-myc ASODN could increase the cell number i n G1 phase and decrease that in S phase and reduce the C-MYC protein expressi on .Conclusion:c-myc ASODN can inhibit the growth of muc oepidermoid carcinoma MEC-1 cells.
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Key words Mucoepidermoid carcinoma;myc genes;Antisense oligonucl eotides
c-myc基因是一种与细胞增殖、分化和调亡密切相关的原癌基因。已发现在粘液表 皮样 癌细胞MEC-1细胞中有c-myc基因的扩增〔1〕。为了探讨反义基因片段在粘液表 皮样 癌治疗的可能性，我们以MEC-1细胞为体外模型，初步研究了c-myc基因反义寡核苷酸( ASODN)对其生长的抑制作用。现报道如下。
1 材料与方法
1.1 细胞系
人粘液表皮样癌细胞系MEC-1(第四军医大学口腔医学院建立)，在37 ℃、φ(CO2)=5%及饱和湿度条件下，用含φ=10%的胎牛血清的RPMI 1640培养液培养。
, 百拇医药
1.2 寡核苷酸(ODN)的合成和序列
根据c-myc基因第二外显子翻译起始区序列设计ODN，由加拿大上海 Sangong公司合成并行全硫代磷酸化修饰。正义(sense)序列5'-ATG CCC CTC AAC GTT-3'( SODN)；反义(antisense)序列5'-AAC GTT GAG GGG CAT-3'；错配(mismatch)序列5'-CAC GTG GAG TGG CAT-3'(MODN)。
1.3 ODN对细胞的量效曲线、时效曲线测定
取对数生长期MEC-1细胞接种于96孔培养板 ，每孔接种细胞2×103个/0.1 ml。常规培养至次日，对照组每孔加培养液0.1 ml ，处理组分别加入含有不同浓度(用新鲜培养液倍比稀释)的c-myc反义、正义及错配OD N(使 各组终浓度分别为2.5、5、10、20 μmol/L)培养液0.1 ml。每种ODN的各种浓度分别设4个 孔， 对照组设8个孔。继续在上述常规下培养72 h，行MTT法测定光吸收值(A)〔2〕。以 对照组为100%，计算出各组A值百分比。实验重复3次。用EXCEL软件绘制剂量-效应曲线。
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另外，取3块96孔板，每孔接种细胞2×103个/0.1 ml。次日行实验处理，对照组每 孔加培养液0.1 ml，处理组分ASODN组、SODN组及MODN组，各组终浓度均为10 μmol/L，每 组4 孔。分别于24、48、72 h各取一块板，测A值。实验重复3次，绘制时间-效应曲线。
1.4 流式细胞仪测定细胞周期
设对照组及ASODN处理组。接种对数生长期细胞于25 ml培 养瓶内。24 h后，处理组加入c-myc ASODN，使终浓度为10 μmol/L。ASODN处理7 2 h后，各组细胞以2.5 g/L胰酶消化，按常规流式细胞术测定细胞周期。
1.5 免疫细胞化学染色
取对数生长期细胞接种于事先放置有小玻片的小培养皿中，常规培养24 h后，加入 c-myc ASODN(终浓度为 10 μmol/L)。72 h后，按常规ABC免疫组化法染色(ABC试 剂盒为美国V ectuo公司产品；c-myc单抗购自华美生物工程公司，工作浓度1∶50)，光镜下观察。 结果判定： 未着色的细胞定为阴性细胞，阳性细胞核呈棕黄色，边界清楚，胞浆无染色。在油镜下取随 机视野连续不遗漏计数500个细胞，计数C-MYC蛋白表达阳性率。
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2 结 果
2.1 3种ODN对细胞抑制作用的剂量-效应曲线
见图1。50%抑制浓度(IC50)为 8.2 μmol/L。
2.2 3种ODN对细胞抑制作用的时间-效应曲线
见图2。
2.3 c-myc ASODN对细胞周期的影响
见表1。
2.4 免疫细胞化学检测C-MYC蛋白表达
对照组MEC-1细胞，用免疫细胞化学染色后镜检发现，约63%的细胞核明显染色，说明细胞 有明显的C-MYC蛋白表达。而ASODN处理组细胞阳性率为21%，且胞核着色较淡。
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图1 3种寡核苷酸对MEC-1细胞作用的剂量-效应曲线
图2 3种寡核苷酸对MEC-1细胞作用的时间-效应曲线
表1 ASODN对细胞周期的影响 实验分组
各期细胞数(%)
G1
S
G2
对照
47.2
38.1
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14.6
ASODN
67.2
21.2
11.6
3 讨 论
作为一种新的可能的治疗手段，基因治疗日益受到关注。基因的反义寡核苷酸(ASODN)具有 封闭(抑制)特定有害基因表达的作用，因而ASODN治疗成为近年来发展起来的基因治疗的一 项重要技术。c-myc基因作为生长因子的“即刻早期反应基因”，其产物是参与细胞周 期调 控的最重要的转录因子，是细胞由G1期进入S期所必需的〔3〕。c-myc基因的 过度 表达，可以改变细胞内的基因调控，使细胞易于转化为恶性表型，其它癌基因的活化或抗癌 基因的失活均可加速肿瘤的发生〔4〕。在粘液表皮样癌MEC-1细胞中有c-myc 基因 的扩增，提示c-myc基因可能与粘液表皮样癌的发生〔5〕有关。因此，通过阻 断c-myc基 因的表达，有可能逆转肿瘤细胞的恶性增殖过程。Watson等〔5〕利用c-myc AS ODN抑 制乳腺癌c-myc表达，从而使乳腺癌细胞的生长受到明显的抑制。Cerutti等〔6〕 用c-myc有效地抑制了7株有c-myc高表达的甲状腺癌细胞的生长，细胞内c- myc的表达越高，ASO DN的抑制作用越强。
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本研究设计合成了与c-myc基因第二外显子翻译起始区序列互补的15聚反义寡核苷酸( 同时设 计合成SODN、MODN作对照)，并行硫代磷酸化修饰，观察了其对人粘液表皮样癌MEC-1细胞 的影响。实验结果显示，经c-myc ASODN作用，细胞中C-MYC蛋白产物表达受到一 定程度的抑 制，与此相伴随，细胞增殖被抑制。抑制作用随ASODN浓度增加和作用时间的延长而增强， 有剂量依赖和时间依赖关系。用浓度为10 μmol/L的c-myc ASODN处理72 h，可使MEC -1细 胞的抑制率达59%，而SODN及MODN对MEC-1细胞的抑制率很低。表明c-myc ASODN具有 良好 的序列特异性抑制作用，而SODN及MODN只具有对MEC-1细胞的非特异性作用，且作用不明 显。流式细胞仪能迅速分析细胞群中各细胞周期时相的组成，其中S期百分率常作为比较细 胞增殖活性的指标。结果显示，经ASODN作用后的MEC-1细胞，G1期细胞数明显增多，S期 细胞数明显减少，提示c-myc ASODN可有效地延缓细胞由G1期向S期的过渡。表明 c-myc AS ODN具有细胞周期特异性抑制细胞增殖的作用。以上结果提示c-myc ASODN是一种MEC- 1细 胞的生长抑制剂，推测在将来治疗粘液表皮样癌中，c-myc基因有可能成为ASODN基因 治疗策略中的许多靶(目的)基因中的一员。
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参考文献
1，司徒镇强，吴军正，薛辉.口腔颌面部癌瘤细胞系c-myc、c-Ha -ras癌基因扩增的研究.实用口腔医学杂志，1992，8：116
2，吴军正，司徒镇强，刘斌.MTT试验及其在抗癌中药筛选中的应用.中华口腔医学杂志，199 2，27：373
3，Hunter T.Oncoprotein networks.Cell,1997,88:333
4，Evan GI,Wyllie AH,Glibert CS,et al.Induction of apoptosis in fibroblasts b y c-myc protein.Cell,1992,69:119
5，Watson PH,Pon RT,Shiu RP.Inhibition of c-myc expression by phosphothioate ant i sense oligonucltide identifies a critical role for c-myc in the growth of human breast cancer.Cancer Res,1991,51:3996
6，Cerutti J,Trapasso F,Battaglia,C,et al.Block of c-myc expression by antis ense oligonucleotides inhibits proliferation of human thyroid carcinoma cell lines.Cl in Cancer Res,1996,2:119
(收稿：2000-04-19), 百拇医药
单位：王石光(广州军区广州总医院口腔科 510010)；司徒镇强 吴军正 刘斌(第四军医大学口腔医学院)
关键词：粘液表皮样癌；myc基因；反义寡核苷酸类
实用口腔医学杂志000520
〔摘要〕 目的：探讨c-myc基因的反义寡核苷酸(ASODN)在涎腺粘液表皮 样癌基因治疗中的 作用。方法：人工合成与c-myc基因第二外显子翻译起 始区序列互补的寡核苷酸，处理培养 的人涎腺粘液表皮样癌MEC-1细胞。应用MTT比色法观察其对细胞增殖的影响；流式细胞仪 检 测对细胞周期的影响；并采用免疫组化法检测C-MYC蛋白的表达。结果：c-myc反义寡核苷酸 能抑制粘液表皮样癌MEC-1细胞的增殖，抑制作用具有浓度及时间依赖性。50%抑制浓度(IC 50)为8.2 μmol/L。用浓度为10 μmol/L的c-myc ASODN处理72 h，对MEC-1细 胞的抑 制率达59%。c-myc ASODN抑制MEC-1细胞从G1期进入S期；并能抑制C-MYC蛋白的表 达。结论：c-myc反义寡核苷酸对粘液表皮样癌MEC-1细胞有特异性抑制 作用。
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中图分类号：R739.87 文献标识码：A 文章编号：1001-3733(2000)05-0391-03
In vitro inhibitary effects of antisense oligodeoxynucleotides of c-myc gene on mucoepidermoid carcinoma MEC-1 cells
Wang Shiguang Situ Zhenqiang Wu Junzheng
(Department of Dentistry,General Hospital of Guangzhou Military District,Guangzhou 510010)
〔Abstract〕Objective:To investigate the effects of antisense oligode oxynucleoti des (ASODN) of c-myc gene on the growth of human mucoepidermoid carcinoma M EC- 1 cells.Methods:From translation initiation region of seco nd extron of human c-myc gene,15-Mer antisense (ASODN),sense,and mismatche d oligonucleotides were sy nthesized and modified with phosphorothioate.Mucoepidermoid carcinoma MEC-1 cel ls derived from human salivary gland were treated with c-myc ASODN at vario us c oncentrations.The influence of c-myc ASODN on cell growth and cell cycle di stri bution were analysed with MTT assay and flow-cytometry,respectively.C-MYC prot ein expression was detected with immunohistochemical staining.Results :c-myc ASO DN inhibited MEC-1 cell growth in a dose-and time-dependent manner.The IC 50 value was 8.2 μmol/L.The growth of MEC-1 decreased by 59% when coculture d with 10 μmol/L ASODN for 72 h.c-myc ASODN could increase the cell number i n G1 phase and decrease that in S phase and reduce the C-MYC protein expressi on .Conclusion:c-myc ASODN can inhibit the growth of muc oepidermoid carcinoma MEC-1 cells.
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Key words Mucoepidermoid carcinoma;myc genes;Antisense oligonucl eotides
c-myc基因是一种与细胞增殖、分化和调亡密切相关的原癌基因。已发现在粘液表 皮样 癌细胞MEC-1细胞中有c-myc基因的扩增〔1〕。为了探讨反义基因片段在粘液表 皮样 癌治疗的可能性，我们以MEC-1细胞为体外模型，初步研究了c-myc基因反义寡核苷酸( ASODN)对其生长的抑制作用。现报道如下。
1 材料与方法
1.1 细胞系
人粘液表皮样癌细胞系MEC-1(第四军医大学口腔医学院建立)，在37 ℃、φ(CO2)=5%及饱和湿度条件下，用含φ=10%的胎牛血清的RPMI 1640培养液培养。
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1.2 寡核苷酸(ODN)的合成和序列
根据c-myc基因第二外显子翻译起始区序列设计ODN，由加拿大上海 Sangong公司合成并行全硫代磷酸化修饰。正义(sense)序列5'-ATG CCC CTC AAC GTT-3'( SODN)；反义(antisense)序列5'-AAC GTT GAG GGG CAT-3'；错配(mismatch)序列5'-CAC GTG GAG TGG CAT-3'(MODN)。
1.3 ODN对细胞的量效曲线、时效曲线测定
取对数生长期MEC-1细胞接种于96孔培养板 ，每孔接种细胞2×103个/0.1 ml。常规培养至次日，对照组每孔加培养液0.1 ml ，处理组分别加入含有不同浓度(用新鲜培养液倍比稀释)的c-myc反义、正义及错配OD N(使 各组终浓度分别为2.5、5、10、20 μmol/L)培养液0.1 ml。每种ODN的各种浓度分别设4个 孔， 对照组设8个孔。继续在上述常规下培养72 h，行MTT法测定光吸收值(A)〔2〕。以 对照组为100%，计算出各组A值百分比。实验重复3次。用EXCEL软件绘制剂量-效应曲线。
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另外，取3块96孔板，每孔接种细胞2×103个/0.1 ml。次日行实验处理，对照组每 孔加培养液0.1 ml，处理组分ASODN组、SODN组及MODN组，各组终浓度均为10 μmol/L，每 组4 孔。分别于24、48、72 h各取一块板，测A值。实验重复3次，绘制时间-效应曲线。
1.4 流式细胞仪测定细胞周期
设对照组及ASODN处理组。接种对数生长期细胞于25 ml培 养瓶内。24 h后，处理组加入c-myc ASODN，使终浓度为10 μmol/L。ASODN处理7 2 h后，各组细胞以2.5 g/L胰酶消化，按常规流式细胞术测定细胞周期。
1.5 免疫细胞化学染色
取对数生长期细胞接种于事先放置有小玻片的小培养皿中，常规培养24 h后，加入 c-myc ASODN(终浓度为 10 μmol/L)。72 h后，按常规ABC免疫组化法染色(ABC试 剂盒为美国V ectuo公司产品；c-myc单抗购自华美生物工程公司，工作浓度1∶50)，光镜下观察。 结果判定： 未着色的细胞定为阴性细胞，阳性细胞核呈棕黄色，边界清楚，胞浆无染色。在油镜下取随 机视野连续不遗漏计数500个细胞，计数C-MYC蛋白表达阳性率。
, http://www.100md.com
2 结 果
2.1 3种ODN对细胞抑制作用的剂量-效应曲线
见图1。50%抑制浓度(IC50)为 8.2 μmol/L。
2.2 3种ODN对细胞抑制作用的时间-效应曲线
见图2。
2.3 c-myc ASODN对细胞周期的影响
见表1。
2.4 免疫细胞化学检测C-MYC蛋白表达
对照组MEC-1细胞，用免疫细胞化学染色后镜检发现，约63%的细胞核明显染色，说明细胞 有明显的C-MYC蛋白表达。而ASODN处理组细胞阳性率为21%，且胞核着色较淡。
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图1 3种寡核苷酸对MEC-1细胞作用的剂量-效应曲线
图2 3种寡核苷酸对MEC-1细胞作用的时间-效应曲线
表1 ASODN对细胞周期的影响 实验分组
各期细胞数(%)
G1
S
G2
对照
47.2
38.1
, 百拇医药
14.6
ASODN
67.2
21.2
11.6
3 讨 论
作为一种新的可能的治疗手段，基因治疗日益受到关注。基因的反义寡核苷酸(ASODN)具有 封闭(抑制)特定有害基因表达的作用，因而ASODN治疗成为近年来发展起来的基因治疗的一 项重要技术。c-myc基因作为生长因子的“即刻早期反应基因”，其产物是参与细胞周 期调 控的最重要的转录因子，是细胞由G1期进入S期所必需的〔3〕。c-myc基因的 过度 表达，可以改变细胞内的基因调控，使细胞易于转化为恶性表型，其它癌基因的活化或抗癌 基因的失活均可加速肿瘤的发生〔4〕。在粘液表皮样癌MEC-1细胞中有c-myc 基因 的扩增，提示c-myc基因可能与粘液表皮样癌的发生〔5〕有关。因此，通过阻 断c-myc基 因的表达，有可能逆转肿瘤细胞的恶性增殖过程。Watson等〔5〕利用c-myc AS ODN抑 制乳腺癌c-myc表达，从而使乳腺癌细胞的生长受到明显的抑制。Cerutti等〔6〕 用c-myc有效地抑制了7株有c-myc高表达的甲状腺癌细胞的生长，细胞内c- myc的表达越高，ASO DN的抑制作用越强。
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本研究设计合成了与c-myc基因第二外显子翻译起始区序列互补的15聚反义寡核苷酸( 同时设 计合成SODN、MODN作对照)，并行硫代磷酸化修饰，观察了其对人粘液表皮样癌MEC-1细胞 的影响。实验结果显示，经c-myc ASODN作用，细胞中C-MYC蛋白产物表达受到一 定程度的抑 制，与此相伴随，细胞增殖被抑制。抑制作用随ASODN浓度增加和作用时间的延长而增强， 有剂量依赖和时间依赖关系。用浓度为10 μmol/L的c-myc ASODN处理72 h，可使MEC -1细 胞的抑制率达59%，而SODN及MODN对MEC-1细胞的抑制率很低。表明c-myc ASODN具有 良好 的序列特异性抑制作用，而SODN及MODN只具有对MEC-1细胞的非特异性作用，且作用不明 显。流式细胞仪能迅速分析细胞群中各细胞周期时相的组成，其中S期百分率常作为比较细 胞增殖活性的指标。结果显示，经ASODN作用后的MEC-1细胞，G1期细胞数明显增多，S期 细胞数明显减少，提示c-myc ASODN可有效地延缓细胞由G1期向S期的过渡。表明 c-myc AS ODN具有细胞周期特异性抑制细胞增殖的作用。以上结果提示c-myc ASODN是一种MEC- 1细 胞的生长抑制剂，推测在将来治疗粘液表皮样癌中，c-myc基因有可能成为ASODN基因 治疗策略中的许多靶(目的)基因中的一员。
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参考文献
1，司徒镇强，吴军正，薛辉.口腔颌面部癌瘤细胞系c-myc、c-Ha -ras癌基因扩增的研究.实用口腔医学杂志，1992，8：116
2，吴军正，司徒镇强，刘斌.MTT试验及其在抗癌中药筛选中的应用.中华口腔医学杂志，199 2，27：373
3，Hunter T.Oncoprotein networks.Cell,1997,88:333
4，Evan GI,Wyllie AH,Glibert CS,et al.Induction of apoptosis in fibroblasts b y c-myc protein.Cell,1992,69:119
5，Watson PH,Pon RT,Shiu RP.Inhibition of c-myc expression by phosphothioate ant i sense oligonucltide identifies a critical role for c-myc in the growth of human breast cancer.Cancer Res,1991,51:3996
6，Cerutti J,Trapasso F,Battaglia,C,et al.Block of c-myc expression by antis ense oligonucleotides inhibits proliferation of human thyroid carcinoma cell lines.Cl in Cancer Res,1996,2:119
(收稿：2000-04-19), 百拇医药