牛舌粘膜间接免疫荧光法与免疫印迹法检测天疱疮抗体的比较
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作者：王培光 张学军 杨森 杨春俊 王再兴
单位：安徽医科大学第一附属医院皮肤科，合肥 230022
关键词：免疫印迹法；荧光抗体技术；天疱疮；免疫学；抗体
安徽医科大学学报990202
摘要 目的 比较以牛舌粘膜作为底物，间接免疫荧光法与免疫印迹法对检测天疱疮抗体的灵敏度和价值。方法 以牛舌粘膜作为底物，分别应用间接免疫荧光法和免疫印迹技术检测16例天疱疮患者血清中IgG型自身抗体。结果 间接免疫荧光法14例(87.5%)阳性，免疫印迹法11例(68.8%)阳性，两法合用总阳性15例(93.8%)。结论 间接免疫荧光法适合于常规辅助诊断天疱疮，而免疫印迹法可以作为前者的补充。
中国图书资料分类法分类号 R753.2； R392.11
, 百拇医药
Comparison of immunoblot and bovine tongue mucosa indirect
immunofluorescence in detecting pemphigus antibodies
Wang Peiguang, Zhang Xuejun, Yang Sen et al
(Dept of Dermatology, The First Affiliated Hospital, Anhui Medical University, Hefei 230022)
Abstract Objective To compare the sensitivity and value of immunoblot and bovine indirect immunofluorescence using bovine tongue mucosa as substrate in detecting pemphigus antibodies. Methods To detect autoantibodies in 16 cases of sera from patients with pemphigus by immunofluorescence. Results 11 cases (68.8%), 14 cases (87.5%), and 15 cases(93.8%) were positive in immunoblot and in indirect immunofluoresence, in the combination of two methods. Conclusion Bovine tongue mucosa indirect immunofluorescence was the routine aid to the diagnosis of pemphigus, whereas immunoblot could recruit the former.
, 百拇医药
MeSH immunoblotting; fluorescent antibody, technique; pemphigus/immunol; antibodies
间接免疫荧光法(IIF)检测发现80%～90%的天疱疮患者血清中有抗表皮细胞间物质抗体(天疱疮抗体)〔1〕，应用免疫印迹技术检测患者抗体时结果不完全相一致。通常以人皮肤作为底物，然而获取人皮肤比较困难，因此本研究以牛舌粘膜作为底物，分别应用免疫印迹技术和IIF同时检测16例天疱疮患者血清中IgG型自身抗体，探讨两种方法在天疱疮辅助诊断中的价值。
1 材料与方法
1.1 新鲜牛舌 取自当地屠宰场。
1.2 患者血清和对照 16例天疱疮患者血清，其中13例寻常型天疱疮(PV)，1例落叶型天疱疮(PF)，2例红斑型天疱疮(PE)。所有病例均经临床、组织病理、直接免疫荧光(DIF)检查确诊。患者平均年龄为55岁(30～70岁)。对照为4例正常人血清。
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1.3 牛舌粘膜上皮提取物的制备 新鲜牛舌用0.01 mol.L-1 PBS冲洗干净后，剥离其上皮及下方的结缔组织，切成1～2 cm2大小，置于1 mol.L-1 NaCl溶液(内含1 mmol.L-1 PMSF， 2 mmol.L-1 EDTA)中，4℃环境下快速磁力搅拌至上皮从结缔组织脱离〔2〕，牛舌粘膜上皮用0.01 mol.L-1 PBS反复冲洗后充分剪碎，置于8 mol.L-1尿素提取液(65 mmol.L-1 Tris-HCl，内含8 mol.L-1尿素，20 g.L-1 SDS， 5%(体积分数，下同) 2-巯基乙醇，1 mmol.L-1 PMSF， 2 mmol.L-1 EDTA)中4℃环境下快速磁力搅拌1 h，然后以10 000 g 8℃离心30 min，收集上清，重复离心一次。吸取上清，分装，-30℃下保存备用。
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1.4 免疫印迹〔3〕 采用7.5%的分离胶和4%的浓缩胶。将提取的牛舌粘膜上皮抗原经SDS-PAGE和转移电泳转印至硝酸纤维膜(NC)上。置于0.01 mol.L-1 PBS(内含0.05% Tween-20和50 g.L-1 BSA)封闭4～5 h，切成3 mm宽，置于反应槽内，加入经血清稀释液(50 mmol.L-1 Tris-HCl，pH 7.4，含0.5 mol.L-1 NaCl，5 g.L-1 BSA， 0.3% Tween-20)1∶10稀释的待检血清，室温平缓摇动2 h，倾去反应液，用洗涤液(10 mmol.L-1 Tris-HCl, pH 7.4，含0.5 mol.L-1 NaCl，0.3% Tween-20)漂洗10 min×4次，加入按1∶400稀释的辣根过氧化物酶标记的兔抗人IgG抗体(Sigma产品)室温平摇1 h，倾去反应液，用洗涤液漂洗10 min×4次，甩干后加入新鲜配制的DAB底物液(0.6 g.L-1 DAB, 0.03% H2O2)，观察出现较明显区带后用双蒸水冲洗终止反应。
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1.5 牛舌粘膜IIF〔4〕 取牛舌粘膜及下方的结缔组织，切成0.4 cm×0.8 cm大小，OCT包埋，冰冻切片(6 μm)作为底物。受检血清经1∶10稀释后做倍比稀释，以牛舌粘膜为底物，进行IIF法检测。经1∶10或以上稀释的血清在牛舌粘膜上皮细胞间引起网状荧光染色判断为阳性，经1∶10稀释的血清未引起网状荧光染色则判断为阴性。
2 结果
2.1 免疫印迹检测 11/16例天疱疮患者血清中有特异性IgG型自身抗体与1 mol.L-1 NaCl分离法分离的牛舌粘膜上皮提取物反应，其中10/13例PV血清与210 ku多肽结合，同时还结合260，230，190，160，65，62 ku多肽，1例PF血清结合260和180 ku多肽，2例PE血清呈阴性反应。用作对照的4例正常人血清不与牛舌粘膜上皮提取物发生反应。
2.2 牛舌粘膜IIF检查 16例天疱疮血清在牛舌粘膜上皮细胞间有IgG型自身抗体呈网状沉积者14例，阳性率为87.5%，阳性血清中天疱疮抗体的滴度为1∶80～1∶640。11/13例PV血清呈现阳性反应，其IgG型抗体在整个牛舌粘膜上皮细胞间呈网状沉积，而2例PE和1例PF血清中IgG型抗体则主要在上部牛舌粘膜上皮细胞间网状沉积。用作对照的4例正常人血清未有在牛舌粘膜上皮细胞间引起特异性荧光染色。
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2.3 天疱疮血清经两种方法检测结果 见表1。
表1 16例不同型天疱疮血清经两种方法检测的结果 间接免疫荧光
免疫印迹法
阳性
阴性
PV
阳性
8
3
阴性
2
0
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PF
阳性
1
0
阴性
PE
阳性
0
2
阴性
2×2列联表χ2检验，P>0.053 讨论
现已证实，在天疱疮患者皮肤粘膜和血清中均存在抗表皮细胞间物质抗体，IIF发现一般80%～90%的患者血清中有天疱疮抗体。本研究应用牛舌粘膜为底物，对16例天疱疮患血清进行IIF检查，结果14例(87.5%)血清中有IgG型自身抗体在牛舌粘膜上皮细胞间呈网状沉积，其中11例PV血清在整个上皮细胞间引起荧光染色，1例PF和2例PE血清主要在上部上皮细胞间引起荧光染色。结果与文献报道一致。Hashimoto等〔5〕应用正常人表皮提取物和牛桥粒制备物分别同18例天疱疮血清进行免疫印迹分析，结果13例(66.7%)出现阳性反应，其中4例PV血清表皮提取物中130 ku多肽和牛桥粒制备物中135 ku多肽反应，9例PF血清与表皮提取物和牛桥粒制备物中150 ku多肽反应。我们应用牛舌粘膜提取物免疫印迹检测16例天疱疮血清，结果11例(68.8%)出现阳性反应，其中10例PV和1例PF血清出现IgG型自身抗体。经统计学处理，结果表明IIF法与免疫印迹法在检测天疱疮抗体时灵敏度差异无显著性，然而IIF法操作过程相对简单方便，并且结合临床表现可进一步对天疱疮进行分型。此外，在应用此法检测时，不需要切取患者的皮肤，并且牛舌来源方便。因此，牛舌IIF法适于常规辅助诊断天疱疮。然而，在IIF检测结果呈阴性的2例PV中，其免疫印迹检测结果则为阳性。所以，免疫印迹法可以作为IIF法的补充。
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本组牛舌粘膜IIF检测结果为阳性的2例PE和1例PV血清中天疱疮抗体的滴度均在1∶80以上，而其免疫印迹结果却为阴性，提示天疱疮血清免疫印迹结果阳性与否可能与天疱疮抗体的滴度高低无关。在进行免疫印迹分析时，10/13例PV血清分别结合牛舌粘膜提取物中210 ku多肽，此外还可同时结合260，230，190，160，85，65，62 ku多肽，1例PF血清与260和180 ku多肽结合。结果与Hashimoto的报道〔5〕不同，我们推测这可能与抗原的提取方法不同有关。
我们的研究结果表明，牛舌粘膜IIF法适合于天疱疮辅助诊断，而免疫印迹法可以作为IIF法的补充。
基金项目：安徽省自然科学基金资助课题(编号 97424005)
作者简介：王培光，男，27岁，硕士研究生
张学军，男，44岁，教授，硕士研究生导师，安徽医科大学学报常务副主编
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参考文献
1 杨国亮，王侠生主编. 现代皮肤病学. 上海：上海医科大学出版社，1996：570～574
2 张学军. 1 mol.L-1 NaCl分离皮肤的免疫荧光法在表皮下大疱病诊断中的应用.国外医学皮肤性病学分册，1994；20(1)：16～18
3 张学军，翁孟武，施守义.免疫印迹检测大疱性类天疱疮抗体.中国免疫学杂志，1995；11(1)：48～50
4 杨春俊，张学军，杨 森 等 .牛舌为底物间接免疫荧光检测天疱疮抗体的研究.临床皮肤科杂志，1999；28(1)：22～23
5 Hashimoto T, Konohara A, Nishikawa T et al. Immunoblot assay as an aid to the diagnosis of unclasssified cases of pemphigus. Arch Dermatol, 1991;127(6):843～846
1999-01-14收稿，1999-04-05修回, 百拇医药
单位：安徽医科大学第一附属医院皮肤科，合肥 230022
关键词：免疫印迹法；荧光抗体技术；天疱疮；免疫学；抗体
安徽医科大学学报990202
摘要 目的 比较以牛舌粘膜作为底物，间接免疫荧光法与免疫印迹法对检测天疱疮抗体的灵敏度和价值。方法 以牛舌粘膜作为底物，分别应用间接免疫荧光法和免疫印迹技术检测16例天疱疮患者血清中IgG型自身抗体。结果 间接免疫荧光法14例(87.5%)阳性，免疫印迹法11例(68.8%)阳性，两法合用总阳性15例(93.8%)。结论 间接免疫荧光法适合于常规辅助诊断天疱疮，而免疫印迹法可以作为前者的补充。
中国图书资料分类法分类号 R753.2； R392.11
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Comparison of immunoblot and bovine tongue mucosa indirect
immunofluorescence in detecting pemphigus antibodies
Wang Peiguang, Zhang Xuejun, Yang Sen et al
(Dept of Dermatology, The First Affiliated Hospital, Anhui Medical University, Hefei 230022)
Abstract Objective To compare the sensitivity and value of immunoblot and bovine indirect immunofluorescence using bovine tongue mucosa as substrate in detecting pemphigus antibodies. Methods To detect autoantibodies in 16 cases of sera from patients with pemphigus by immunofluorescence. Results 11 cases (68.8%), 14 cases (87.5%), and 15 cases(93.8%) were positive in immunoblot and in indirect immunofluoresence, in the combination of two methods. Conclusion Bovine tongue mucosa indirect immunofluorescence was the routine aid to the diagnosis of pemphigus, whereas immunoblot could recruit the former.
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MeSH immunoblotting; fluorescent antibody, technique; pemphigus/immunol; antibodies
间接免疫荧光法(IIF)检测发现80%～90%的天疱疮患者血清中有抗表皮细胞间物质抗体(天疱疮抗体)〔1〕，应用免疫印迹技术检测患者抗体时结果不完全相一致。通常以人皮肤作为底物，然而获取人皮肤比较困难，因此本研究以牛舌粘膜作为底物，分别应用免疫印迹技术和IIF同时检测16例天疱疮患者血清中IgG型自身抗体，探讨两种方法在天疱疮辅助诊断中的价值。
1 材料与方法
1.1 新鲜牛舌 取自当地屠宰场。
1.2 患者血清和对照 16例天疱疮患者血清，其中13例寻常型天疱疮(PV)，1例落叶型天疱疮(PF)，2例红斑型天疱疮(PE)。所有病例均经临床、组织病理、直接免疫荧光(DIF)检查确诊。患者平均年龄为55岁(30～70岁)。对照为4例正常人血清。
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1.3 牛舌粘膜上皮提取物的制备 新鲜牛舌用0.01 mol.L-1 PBS冲洗干净后，剥离其上皮及下方的结缔组织，切成1～2 cm2大小，置于1 mol.L-1 NaCl溶液(内含1 mmol.L-1 PMSF， 2 mmol.L-1 EDTA)中，4℃环境下快速磁力搅拌至上皮从结缔组织脱离〔2〕，牛舌粘膜上皮用0.01 mol.L-1 PBS反复冲洗后充分剪碎，置于8 mol.L-1尿素提取液(65 mmol.L-1 Tris-HCl，内含8 mol.L-1尿素，20 g.L-1 SDS， 5%(体积分数，下同) 2-巯基乙醇，1 mmol.L-1 PMSF， 2 mmol.L-1 EDTA)中4℃环境下快速磁力搅拌1 h，然后以10 000 g 8℃离心30 min，收集上清，重复离心一次。吸取上清，分装，-30℃下保存备用。
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1.4 免疫印迹〔3〕 采用7.5%的分离胶和4%的浓缩胶。将提取的牛舌粘膜上皮抗原经SDS-PAGE和转移电泳转印至硝酸纤维膜(NC)上。置于0.01 mol.L-1 PBS(内含0.05% Tween-20和50 g.L-1 BSA)封闭4～5 h，切成3 mm宽，置于反应槽内，加入经血清稀释液(50 mmol.L-1 Tris-HCl，pH 7.4，含0.5 mol.L-1 NaCl，5 g.L-1 BSA， 0.3% Tween-20)1∶10稀释的待检血清，室温平缓摇动2 h，倾去反应液，用洗涤液(10 mmol.L-1 Tris-HCl, pH 7.4，含0.5 mol.L-1 NaCl，0.3% Tween-20)漂洗10 min×4次，加入按1∶400稀释的辣根过氧化物酶标记的兔抗人IgG抗体(Sigma产品)室温平摇1 h，倾去反应液，用洗涤液漂洗10 min×4次，甩干后加入新鲜配制的DAB底物液(0.6 g.L-1 DAB, 0.03% H2O2)，观察出现较明显区带后用双蒸水冲洗终止反应。
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1.5 牛舌粘膜IIF〔4〕 取牛舌粘膜及下方的结缔组织，切成0.4 cm×0.8 cm大小，OCT包埋，冰冻切片(6 μm)作为底物。受检血清经1∶10稀释后做倍比稀释，以牛舌粘膜为底物，进行IIF法检测。经1∶10或以上稀释的血清在牛舌粘膜上皮细胞间引起网状荧光染色判断为阳性，经1∶10稀释的血清未引起网状荧光染色则判断为阴性。
2 结果
2.1 免疫印迹检测 11/16例天疱疮患者血清中有特异性IgG型自身抗体与1 mol.L-1 NaCl分离法分离的牛舌粘膜上皮提取物反应，其中10/13例PV血清与210 ku多肽结合，同时还结合260，230，190，160，65，62 ku多肽，1例PF血清结合260和180 ku多肽，2例PE血清呈阴性反应。用作对照的4例正常人血清不与牛舌粘膜上皮提取物发生反应。
2.2 牛舌粘膜IIF检查 16例天疱疮血清在牛舌粘膜上皮细胞间有IgG型自身抗体呈网状沉积者14例，阳性率为87.5%，阳性血清中天疱疮抗体的滴度为1∶80～1∶640。11/13例PV血清呈现阳性反应，其IgG型抗体在整个牛舌粘膜上皮细胞间呈网状沉积，而2例PE和1例PF血清中IgG型抗体则主要在上部牛舌粘膜上皮细胞间网状沉积。用作对照的4例正常人血清未有在牛舌粘膜上皮细胞间引起特异性荧光染色。
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2.3 天疱疮血清经两种方法检测结果 见表1。
表1 16例不同型天疱疮血清经两种方法检测的结果 间接免疫荧光
免疫印迹法
阳性
阴性
PV
阳性
8
3
阴性
2
0
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PF
阳性
1
0
阴性
PE
阳性
0
2
阴性
2×2列联表χ2检验，P>0.053 讨论
现已证实，在天疱疮患者皮肤粘膜和血清中均存在抗表皮细胞间物质抗体，IIF发现一般80%～90%的患者血清中有天疱疮抗体。本研究应用牛舌粘膜为底物，对16例天疱疮患血清进行IIF检查，结果14例(87.5%)血清中有IgG型自身抗体在牛舌粘膜上皮细胞间呈网状沉积，其中11例PV血清在整个上皮细胞间引起荧光染色，1例PF和2例PE血清主要在上部上皮细胞间引起荧光染色。结果与文献报道一致。Hashimoto等〔5〕应用正常人表皮提取物和牛桥粒制备物分别同18例天疱疮血清进行免疫印迹分析，结果13例(66.7%)出现阳性反应，其中4例PV血清表皮提取物中130 ku多肽和牛桥粒制备物中135 ku多肽反应，9例PF血清与表皮提取物和牛桥粒制备物中150 ku多肽反应。我们应用牛舌粘膜提取物免疫印迹检测16例天疱疮血清，结果11例(68.8%)出现阳性反应，其中10例PV和1例PF血清出现IgG型自身抗体。经统计学处理，结果表明IIF法与免疫印迹法在检测天疱疮抗体时灵敏度差异无显著性，然而IIF法操作过程相对简单方便，并且结合临床表现可进一步对天疱疮进行分型。此外，在应用此法检测时，不需要切取患者的皮肤，并且牛舌来源方便。因此，牛舌IIF法适于常规辅助诊断天疱疮。然而，在IIF检测结果呈阴性的2例PV中，其免疫印迹检测结果则为阳性。所以，免疫印迹法可以作为IIF法的补充。
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本组牛舌粘膜IIF检测结果为阳性的2例PE和1例PV血清中天疱疮抗体的滴度均在1∶80以上，而其免疫印迹结果却为阴性，提示天疱疮血清免疫印迹结果阳性与否可能与天疱疮抗体的滴度高低无关。在进行免疫印迹分析时，10/13例PV血清分别结合牛舌粘膜提取物中210 ku多肽，此外还可同时结合260，230，190，160，85，65，62 ku多肽，1例PF血清与260和180 ku多肽结合。结果与Hashimoto的报道〔5〕不同，我们推测这可能与抗原的提取方法不同有关。
我们的研究结果表明，牛舌粘膜IIF法适合于天疱疮辅助诊断，而免疫印迹法可以作为IIF法的补充。
基金项目：安徽省自然科学基金资助课题(编号 97424005)
作者简介：王培光，男，27岁，硕士研究生
张学军，男，44岁，教授，硕士研究生导师，安徽医科大学学报常务副主编
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参考文献
1 杨国亮，王侠生主编. 现代皮肤病学. 上海：上海医科大学出版社，1996：570～574
2 张学军. 1 mol.L-1 NaCl分离皮肤的免疫荧光法在表皮下大疱病诊断中的应用.国外医学皮肤性病学分册，1994；20(1)：16～18
3 张学军，翁孟武，施守义.免疫印迹检测大疱性类天疱疮抗体.中国免疫学杂志，1995；11(1)：48～50
4 杨春俊，张学军，杨 森 等 .牛舌为底物间接免疫荧光检测天疱疮抗体的研究.临床皮肤科杂志，1999；28(1)：22～23
5 Hashimoto T, Konohara A, Nishikawa T et al. Immunoblot assay as an aid to the diagnosis of unclasssified cases of pemphigus. Arch Dermatol, 1991;127(6):843～846
1999-01-14收稿，1999-04-05修回, 百拇医药