金黄色葡萄球菌肠毒素B单克隆抗体对烫伤脓毒症大鼠脏器功能的影响
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作者：李红云 姚咏明 施志国 于燕 董宁 盛志勇
单位：中国人民解放军第三○四医院创伤外科中心免疫研究室 北京1000037
关键词：
中华医学杂志001122 近年来, 革兰阳性菌引起的院内感染明显上升，主要表现为革兰阳性菌感染所致脓毒症呈优势增长[1], 其中金黄色葡萄球菌(金葡菌)感染的发病率位居首位。由于金葡菌致病因素复杂，且耐药性的不断增强，金葡菌脓毒症的防治已成为现代外科的难点之一[2]。但迄今为止，关于肠毒素单克隆抗体(单抗)在金葡菌脓毒症免疫防治中的作用尚少见报道。本研究采用大鼠烫伤后金葡菌感染模型，观察金葡菌肠毒素B(SEB)单抗对烫伤脓毒症大鼠体内细胞因子诱生及器官功能的影响，旨在探寻一种有效的金葡菌脓毒症免疫防治措施。
一、材料与方法
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1.实验动物与模型制备：清洁级雄性Wistar大鼠50只，体重220～300 g (购自军事医学科学院实验动物研究所)。动物购来后饲养1周以上，实验前禁食过夜，自由饮水。以质量浓度为2%戊巴比妥钠腹腔麻醉，以质量浓度为20%硫化钠脱毛，温水洗净，纱布擦干。将其背部浸于沸水中12s造成20%总体表面积Ⅲ°烫伤。立即腹腔注射林格氏液(40 ml/kg) 抗休克，创面涂以碘酊抗感染。烫伤后24 h，给大鼠腹腔注射对数生长期的金黄色葡萄球菌古典S6菌株菌液4 ml/kg(浓度为8×109菌落形成单位/ml)造成脓毒性休克。该模型24 h动物死亡率约80%。
2.动物分组: 50只大鼠随机分为3组：正常对照组(10只)，麻醉后活杀；烫伤脓毒症组(20只)，分别于烫伤复合金葡菌攻击后2、6 h活杀；治疗组(20只)，于金葡菌攻击前即刻经阴茎静脉注射SEB单抗2D1(Ig2A)4 mg/kg(防化研究院梁秀敏教授提供)，分别于金葡菌攻击后2、6 h活杀。各时相点均为10只动物。
, 百拇医药
3.检测指标及方法:(1)血浆及组织中SEB的检测：参照梁秀敏等[3]建立的BA-ELISA方法进行改进，用以检测血浆及组织中的SEB。大鼠心、肝、肺、肾组织于3倍体积生理盐水中匀浆，10 000 r/min离心10 min，取上清进行检测。血浆标本为肝素抗凝全血，4 000 r/min离心10 min，取上清待测。该方法检测灵敏度为0.078 ng/ml，检测范围为0.078～20 ng/ml。血浆标本回收率为88.7%～106.2%。
(2)动物脏器功能的检测：血清谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)、肌酸激酶(CK)、心肌型肌酸激酶同工酶(CKMB)用日立7170型全自动生化分析仪测定。
(3)血浆中肿瘤坏死因子-α(TNF-α) 用ELISA方法测定(试剂盒为法国Diaclone产品)，严格按试剂盒说明书操作。
, 百拇医药 3.统计学分析: 结果以
±s表示。应用SAS统计软件包(6.12版)进行t检验、方差分析和χ2检验等。
二、结果
1.SEB单抗治疗对血浆及组织SEB的影响：如表1所示，SEB攻击后2 h和6 h血浆及组织中SEB水平即明显高于正常对照组(P<0.01)。早期给予SEB单抗可有效中和循环SEB水平，同时心、肝、肺、肾等多种组织中SEB含量均有不同程度下降(P<0.05～0.01)。
2.SEB单抗治疗对动物脏器功能的影响: 如表2所示。
3.SEB单抗治疗对血浆TNF-α水平的影响: 正常情况下，大鼠血浆中有少量TNF-α存在(5.45 pg/ml), 烫伤复合金葡菌攻击后2 h血浆TNF-α水平迅速升高(59.68 pg/ml, 与正常对照组相比P<0.01)，攻击后6 h则明显下降(为25.99 pg/ml)。早期给予SEB单抗治疗可使各时相点TNF-α水平明显降低(分别为29.18 pg/ml和15.50 pg/ml P<0.05～0.01)。
, 百拇医药
表1 SEB单抗对血浆及组织SEB的影响(ng/g，±s) 组别
鼠数
血浆(ng/ml)
心
肝
肺
肾
正常对照组
10
0.24±0.19
, 百拇医药
32.6±3.4
41.9±5.3
14.3± 1.8
44.2± 6.7
烫伤脓毒症2 h
未治疗组
20
13.43±0.80△
62.9±8.4△
158.0±13.7△
66.9± 6.8△
, 百拇医药
190.2±22.0△
治疗组
20
0.31±0.17**
31.1±1.7**
33.8± 2.5**
14.1± 1.9**
37.7± 3.7**
烫伤脓毒症6 h
未治疗组
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20
22.66±4.06△
106.1±9.3△
218.3±16.8△
92.5±15.0△
285.3±40.6△
治疗组
20
1.34±0.57*
75.5±8.4△*
, 百拇医药
125.8±17.2△**
36.1± 5.6△**
102.9±13.4△**
注：与正常对照组相比：△P<0.01；与未治疗组相比：P<0.05，**P<0.01表2 SEB单抗治疗对动物多脏器功能的影响(±s) 组别
鼠数
ALT(U/L)
BUN(mmol/L)
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Cr(μmol/L)
AST(U/L)
CK(U/L)
CKMB(U/L)
正常对照组
10
33.9±2.8
6.3±0.5
33.3±0.8
114± 5
504± 38
181± 14
, 百拇医药
烫伤脓毒症2 h
未治疗组
20
83.4± 2.4△△
15.6±4.6△
39.6±4.5
353±50△△
505±415
209±256
治疗组
20
99.0± 7.4△△
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8.2±0.7△
39.2±3.6
327±27△△
781±219
376±130
烫伤脓毒症6 h
未治疗组
20
168.1±20.13△△
11.6±1.5△△
45.2±3.8△
, 百拇医药
514±79△△
1 496±415
798±256
治疗组
20
111.4±10.0△△*
8.3±1.5
44.3±2.5△△
335±43△△*
781±599
375±298
, 百拇医药
注：与正常对照组比较△P<0.05，△△P<0.01；与未治疗组比较*P<0.05 4.SEB单抗治疗对动物死亡率的影响：烫伤复合金葡菌攻击后，动物6 h死亡率为52.6% (10/19)，SEB单抗治疗可使动物死亡率明显降低，仅为17.6% (3/17; P<0.01)。
三、讨论
研究表明，SEB等一类微生物外毒素为“超抗原”，具有强大的抗原刺激能力。它们在极低浓度即可致T细胞大量活化，促炎细胞因子(如TNF-α等)的产生显著增加，在金葡菌脓毒症的发生、发展过程中发挥重要作用。因此，利用SEB单抗中和体内SEB的活性，在金葡菌脓毒症的防治中可能具有一定的应用价值。
本实验结果表明，烫伤后金葡菌攻击动物血浆及组织中SEB含量显著升高，多器官功能明显受损。而静脉注射SEB单抗可有效降低血浆及组织中SEB水平，并与动物相应器官功能的改善密切相关。鉴于T淋巴细胞的大量活化是金葡菌脓毒症的重要特征之一，因此我们推测SEB单抗可能是通过促进抗体介导的毒素快速清除作用或通过阻断SEB对T细胞的活化来减轻SEB所致的机体炎症反应和组织损害。特别值得注意的是，SEB单抗治疗可明显降低脓毒症动物6 h死亡率，表明它在一定程度上还能够改善动物的预后。有人报道金葡菌中毒性休克毒素-1的某些抗体也可有效减轻毒素对家兔的毒性作用，动物生存率亦明显提高[4],与本研究结果相似。应指出的是，由于不同类型的单抗与毒素结合的位点及亲和力不同，其对毒素的拮抗能力亦有所不同，因而对动物器官功能的保护作用也会有所差异。本研究结果初步认为SEB单抗2D1在金葡菌脓毒症的免疫防治中可能具有一定的意义。
, 百拇医药
本实验结果还表明，金葡菌攻击后促炎细胞因子TNF-α的合成与释放显著增加，而静脉给予SEB单抗则能有效抑制TNF-α的产生。提示SEB单抗对脏器功能的保护作用可能与其抑制SEB诱导炎症介质产生有关。另据报道[5]，抗TNF-α单抗可有效防止SEB对D-半乳糖胺致敏小鼠的致死效应，从而证实了TNF-α在SEB诱导的致死性休克中具有重要作用。
SEB单抗2D1可通过抑制炎症介质的过度生成，从而部分拮抗SEB对器官的损害作用。提示SEB单抗在金葡菌脓毒症的免疫防治中可能具有一定应用价值。
基金项目：国家重点基础发展规划项目基金(G1999054203)、国家自然科学基金(39870286)和军队杰出中青年人才专项基金(98J013)资助
参考文献
1，Bone RC. Gram-positive organisms and sepsis. Arch Intern Med, 1994, 154:26-34.
, 百拇医药
2，施志国，盛志勇. 革兰氏阳性菌感染与脓毒症. 中华医院感染学杂志，1996, 6增刊: 239-240.
3，梁秀敏, 张靖, 杨廷松, 等. SEB双单克隆抗体免疫检测试剂盒研制. 卫生研究, 1998, 27增刊:23-25.
4，Bonventre PF, Thompson MR, Adinolfi LE, et al. Neutralization of toxic shock syndrome toxin-1 by monoclonal antibodies in vitro and in vivo. Infect Immun, 1988, 56:135-141.
5，Nagaki M, Muto Y, Ohnishi H, et al. Hepatic injury and lethal shock in galactosamine-sensitized mice induced by the superantigen staphylococcal enterotoxin B. Gastroenterology, 1994, 106:450-458.
(收稿日期：1999-11-25), 百拇医药
单位：中国人民解放军第三○四医院创伤外科中心免疫研究室 北京1000037
关键词：
中华医学杂志001122 近年来, 革兰阳性菌引起的院内感染明显上升，主要表现为革兰阳性菌感染所致脓毒症呈优势增长[1], 其中金黄色葡萄球菌(金葡菌)感染的发病率位居首位。由于金葡菌致病因素复杂，且耐药性的不断增强，金葡菌脓毒症的防治已成为现代外科的难点之一[2]。但迄今为止，关于肠毒素单克隆抗体(单抗)在金葡菌脓毒症免疫防治中的作用尚少见报道。本研究采用大鼠烫伤后金葡菌感染模型，观察金葡菌肠毒素B(SEB)单抗对烫伤脓毒症大鼠体内细胞因子诱生及器官功能的影响，旨在探寻一种有效的金葡菌脓毒症免疫防治措施。
一、材料与方法
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1.实验动物与模型制备：清洁级雄性Wistar大鼠50只，体重220～300 g (购自军事医学科学院实验动物研究所)。动物购来后饲养1周以上，实验前禁食过夜，自由饮水。以质量浓度为2%戊巴比妥钠腹腔麻醉，以质量浓度为20%硫化钠脱毛，温水洗净，纱布擦干。将其背部浸于沸水中12s造成20%总体表面积Ⅲ°烫伤。立即腹腔注射林格氏液(40 ml/kg) 抗休克，创面涂以碘酊抗感染。烫伤后24 h，给大鼠腹腔注射对数生长期的金黄色葡萄球菌古典S6菌株菌液4 ml/kg(浓度为8×109菌落形成单位/ml)造成脓毒性休克。该模型24 h动物死亡率约80%。
2.动物分组: 50只大鼠随机分为3组：正常对照组(10只)，麻醉后活杀；烫伤脓毒症组(20只)，分别于烫伤复合金葡菌攻击后2、6 h活杀；治疗组(20只)，于金葡菌攻击前即刻经阴茎静脉注射SEB单抗2D1(Ig2A)4 mg/kg(防化研究院梁秀敏教授提供)，分别于金葡菌攻击后2、6 h活杀。各时相点均为10只动物。
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3.检测指标及方法:(1)血浆及组织中SEB的检测：参照梁秀敏等[3]建立的BA-ELISA方法进行改进，用以检测血浆及组织中的SEB。大鼠心、肝、肺、肾组织于3倍体积生理盐水中匀浆，10 000 r/min离心10 min，取上清进行检测。血浆标本为肝素抗凝全血，4 000 r/min离心10 min，取上清待测。该方法检测灵敏度为0.078 ng/ml，检测范围为0.078～20 ng/ml。血浆标本回收率为88.7%～106.2%。
(2)动物脏器功能的检测：血清谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)、肌酸激酶(CK)、心肌型肌酸激酶同工酶(CKMB)用日立7170型全自动生化分析仪测定。
(3)血浆中肿瘤坏死因子-α(TNF-α) 用ELISA方法测定(试剂盒为法国Diaclone产品)，严格按试剂盒说明书操作。
, 百拇医药 3.统计学分析: 结果以
±s表示。应用SAS统计软件包(6.12版)进行t检验、方差分析和χ2检验等。二、结果
1.SEB单抗治疗对血浆及组织SEB的影响：如表1所示，SEB攻击后2 h和6 h血浆及组织中SEB水平即明显高于正常对照组(P<0.01)。早期给予SEB单抗可有效中和循环SEB水平，同时心、肝、肺、肾等多种组织中SEB含量均有不同程度下降(P<0.05～0.01)。
2.SEB单抗治疗对动物脏器功能的影响: 如表2所示。
3.SEB单抗治疗对血浆TNF-α水平的影响: 正常情况下，大鼠血浆中有少量TNF-α存在(5.45 pg/ml), 烫伤复合金葡菌攻击后2 h血浆TNF-α水平迅速升高(59.68 pg/ml, 与正常对照组相比P<0.01)，攻击后6 h则明显下降(为25.99 pg/ml)。早期给予SEB单抗治疗可使各时相点TNF-α水平明显降低(分别为29.18 pg/ml和15.50 pg/ml P<0.05～0.01)。
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表1 SEB单抗对血浆及组织SEB的影响(ng/g，
±s) 组别鼠数
血浆(ng/ml)
心
肝
肺
肾
正常对照组
10
0.24±0.19
, 百拇医药
32.6±3.4
41.9±5.3
14.3± 1.8
44.2± 6.7
烫伤脓毒症2 h
未治疗组
20
13.43±0.80△
62.9±8.4△
158.0±13.7△
66.9± 6.8△
, 百拇医药
190.2±22.0△
治疗组
20
0.31±0.17**
31.1±1.7**
33.8± 2.5**
14.1± 1.9**
37.7± 3.7**
烫伤脓毒症6 h
未治疗组
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20
22.66±4.06△
106.1±9.3△
218.3±16.8△
92.5±15.0△
285.3±40.6△
治疗组
20
1.34±0.57*
75.5±8.4△*
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125.8±17.2△**
36.1± 5.6△**
102.9±13.4△**
注：与正常对照组相比：△P<0.01；与未治疗组相比：P<0.05，**P<0.01表2 SEB单抗治疗对动物多脏器功能的影响(
±s) 组别鼠数
ALT(U/L)
BUN(mmol/L)
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Cr(μmol/L)
AST(U/L)
CK(U/L)
CKMB(U/L)
正常对照组
10
33.9±2.8
6.3±0.5
33.3±0.8
114± 5
504± 38
181± 14
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烫伤脓毒症2 h
未治疗组
20
83.4± 2.4△△
15.6±4.6△
39.6±4.5
353±50△△
505±415
209±256
治疗组
20
99.0± 7.4△△
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8.2±0.7△
39.2±3.6
327±27△△
781±219
376±130
烫伤脓毒症6 h
未治疗组
20
168.1±20.13△△
11.6±1.5△△
45.2±3.8△
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514±79△△
1 496±415
798±256
治疗组
20
111.4±10.0△△*
8.3±1.5
44.3±2.5△△
335±43△△*
781±599
375±298
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注：与正常对照组比较△P<0.05，△△P<0.01；与未治疗组比较*P<0.05 4.SEB单抗治疗对动物死亡率的影响：烫伤复合金葡菌攻击后，动物6 h死亡率为52.6% (10/19)，SEB单抗治疗可使动物死亡率明显降低，仅为17.6% (3/17; P<0.01)。
三、讨论
研究表明，SEB等一类微生物外毒素为“超抗原”，具有强大的抗原刺激能力。它们在极低浓度即可致T细胞大量活化，促炎细胞因子(如TNF-α等)的产生显著增加，在金葡菌脓毒症的发生、发展过程中发挥重要作用。因此，利用SEB单抗中和体内SEB的活性，在金葡菌脓毒症的防治中可能具有一定的应用价值。
本实验结果表明，烫伤后金葡菌攻击动物血浆及组织中SEB含量显著升高，多器官功能明显受损。而静脉注射SEB单抗可有效降低血浆及组织中SEB水平，并与动物相应器官功能的改善密切相关。鉴于T淋巴细胞的大量活化是金葡菌脓毒症的重要特征之一，因此我们推测SEB单抗可能是通过促进抗体介导的毒素快速清除作用或通过阻断SEB对T细胞的活化来减轻SEB所致的机体炎症反应和组织损害。特别值得注意的是，SEB单抗治疗可明显降低脓毒症动物6 h死亡率，表明它在一定程度上还能够改善动物的预后。有人报道金葡菌中毒性休克毒素-1的某些抗体也可有效减轻毒素对家兔的毒性作用，动物生存率亦明显提高[4],与本研究结果相似。应指出的是，由于不同类型的单抗与毒素结合的位点及亲和力不同，其对毒素的拮抗能力亦有所不同，因而对动物器官功能的保护作用也会有所差异。本研究结果初步认为SEB单抗2D1在金葡菌脓毒症的免疫防治中可能具有一定的意义。
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本实验结果还表明，金葡菌攻击后促炎细胞因子TNF-α的合成与释放显著增加，而静脉给予SEB单抗则能有效抑制TNF-α的产生。提示SEB单抗对脏器功能的保护作用可能与其抑制SEB诱导炎症介质产生有关。另据报道[5]，抗TNF-α单抗可有效防止SEB对D-半乳糖胺致敏小鼠的致死效应，从而证实了TNF-α在SEB诱导的致死性休克中具有重要作用。
SEB单抗2D1可通过抑制炎症介质的过度生成，从而部分拮抗SEB对器官的损害作用。提示SEB单抗在金葡菌脓毒症的免疫防治中可能具有一定应用价值。
基金项目：国家重点基础发展规划项目基金(G1999054203)、国家自然科学基金(39870286)和军队杰出中青年人才专项基金(98J013)资助
参考文献
1，Bone RC. Gram-positive organisms and sepsis. Arch Intern Med, 1994, 154:26-34.
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2，施志国，盛志勇. 革兰氏阳性菌感染与脓毒症. 中华医院感染学杂志，1996, 6增刊: 239-240.
3，梁秀敏, 张靖, 杨廷松, 等. SEB双单克隆抗体免疫检测试剂盒研制. 卫生研究, 1998, 27增刊:23-25.
4，Bonventre PF, Thompson MR, Adinolfi LE, et al. Neutralization of toxic shock syndrome toxin-1 by monoclonal antibodies in vitro and in vivo. Infect Immun, 1988, 56:135-141.
5，Nagaki M, Muto Y, Ohnishi H, et al. Hepatic injury and lethal shock in galactosamine-sensitized mice induced by the superantigen staphylococcal enterotoxin B. Gastroenterology, 1994, 106:450-458.
(收稿日期：1999-11-25), 百拇医药