长沙地区小儿载脂蛋白E基因多态性及其对血脂的影响
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作者：向伟 赵水平 彭道泉 游学科 周宏年
单位：向 伟(第二附属医院儿科 长沙 410011)；赵水平 彭道泉 游学科 周宏年(第二附属医院心血管内科 长沙 410011)
关键词：血胆固醇；载脂蛋白E*；基因；儿童
湖南医科大学学报990306 提要 采用改良的PCR-RFLP方法测定长沙地区291名儿童载脂蛋白(Apo)E基因型。结果发现ε2，ε3，ε4等位基因的频率分别是0.081，0.857和0.062。ApoE等位基因频率分布无明显的性别差异(P>0.05)。Apoε2等位基因携带者与其它ApoE基因携带者相比，血高密度脂蛋白-胆固醇、ApoE和ApoA1浓度较高，而总胆固醇、低密度脂蛋白-胆固醇、ApoB100水平较低(P<0.05)。ε4等位基因携带者的血脂、脂蛋白、Apo改变则相反(P<0.05)。结果还显示ApoE等位基因对血甘油三酯、脂蛋白(a)浓度的影响不明显(P>0.05)。ε2，ε3，ε4等位基因与血总胆固醇、低密度脂蛋白-胆固醇、ApoB100浓度呈等级正相关，与高密度脂蛋白-胆固醇、ApoA1及ApoE水平呈等级负相关(P<0.05)。ApoE基因对血清脂类的影响存在性别差异。ApoE基因多态性影响小儿血清脂类代谢。
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中国图书分类号 R446.112
Apolipoprotein E polymorphism and plasma lipid, lipoprotein,apolipoprotein levels in 291 children of Changsha
Xiang Wei, Zhao Shuiping, Peng Daoquan, et al
(Department of Pediatrics, The Second Affiliated Hospital, Hunan Medical University, Changsha 410011)
In order to investigate the distribution of apolipoprotein(Apo) E polymorphism and effect of ApoE genotypes on plasma lipid, lipoprotein, apolipoprotein levels in children of Changsha, we determined ApoE genotypes in 291 children by means of PCR-RFLP. ApoE allele frequencies in the population were ε2=0.081,ε3=0.857,ε4=0.062. There were no difference in the ApoE genotypes distribution between sexes. The children with Apoε2 allele had higher levels of ApoE, ApoA1 and high density lipoprotein-cholesterol together with lower levels of total cholesterol, ApoB100 and low density lipoprotein-cholesterol than those with other ApoE alleles. These changes were opposite in children with Apoε4 allele. The levels of plasma triglyceride, lipoprotein(a) were not affected significantly by ApoE alleles. Moreover, the effect of ApoE genotypes on levels of plasma lipids was different between sexes. These results suggest that ApoE polymorphisms could affect plasma lipids metabolism in children.
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Key words cholesterol; apolipoprotein E; gene; child
载脂蛋白(Apo)E是一种由遗传决定的具有多态性的蛋白质，由人类第19号染色体一个基因位点上的三个等位基因ε2，ε3，ε4编码。因此人群中具有三种纯合子基因型E2/2，E3/3，E4/4和三种杂合子基因型E2/3，E3/4，E2/4[1]。不同异构体与受体结合活性以及自身在体内代谢途径存在明显差异。近年研究表明，ApoE结构与机能异常同高脂血症、动脉粥样硬化(AS)形成及其严重程度密切相关，并且认为ε4等位基因可能是冠心病(CHD)的重要遗传标记[1，2]。因此在人群中进行ApoE基因分型对有关疾病的诊断和防治具有重要的临床意义。国外对于ApoE基因的研究引人注目[2]，而我国迄今尚未见有关儿童ApoE的报道。为此作者于1995～1996年对长沙地区291名健康儿童进行ApoE基因型的研究，旨在探讨ApoE基因多态性及其意义。
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1 对象与方法
1.1 对象和标本来源 受试者为长沙地区健康普查的儿童291人，经病史询问、体格检查、心电图、胸部透视、肝肾功能检查及血脂、血糖测定，排除了可引起血脂异常的全身性疾病。291例中男151例，女140例，年龄6～14(平均9.5±2.6)岁。受试者禁食12h。抽取其外周静脉血5ml，以2% EDTA抗凝，分离血浆，置-70℃低温下保存备用。
1.2 试剂与方法
1.2.1 主要试剂及PCR引物 上游引物：5’-TAAGCTTGGCACGGCTGTCAAGGA-3’；下游引物：5’-GAATTCGCCCCGGCCTGGTACAC-3’，上海生物工程研究所合成。4种脱氧核苷酸(dNTP)购自上海复华公司，Taq DNA多聚酶、HhaⅠ核酸内切酶为Promega公司产品。
1.2.2 ApoE基因型检测 按常规方法进行周围血细胞DNA抽提。参照改良Hixson JE法进行PCR扩增[3]。扩增条件：95℃ 72s，72℃ 3min，循环5次；95℃ 72s，55℃ 56s，72℃ 60s，循环30次。PCR产物用2%琼脂糖凝胶电泳分离后，紫外透射灯下检测，若在233bp处出现荧光条带，即为特异性PCR产物。限制性核酸内切酶酶解PCR产物：取PCR产物10μl加入HhaⅠ内切酶5U，混匀后置37℃酶解3h以上。电泳：采用聚丙烯酰胺凝胶电泳，以PUC18/HpaⅡ酶解片段为DNA片段大小的标准物，紫外透射灯下观察结果。
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1.2.3 全套血脂检测 ⑴总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)等的检测：TC，TG采用酶法；高密度脂蛋白-胆固醇(HDL-C)采用磷钨酸镁沉淀法；低密度脂蛋白-胆固醇(LDL-C)按Friedewaid公式计算，LDL-C=TC-(TG/2.2+HDL-C)。⑵ApoE，ApoA,ApoB100浓度检测：ApoE采用ApoE单克隆抗体作酶标抗体，应用酶联免疫一步法测定，试剂盒由南京聚力生物医学工程研究所提供；ApoA1和ApoB100采用免疫浊度法，试剂盒由宁波慈利生物制剂厂提供。⑶脂蛋白(a)[Lp(a)]浓度检测：采用羊抗人Lp(a)血清，ELISA双抗夹心法测定，试剂盒由南京军区总医院生化科提供。
1.2.4 统计学处理 应用S486型计算机，FOX-2.5软件包建立数据库，S-4.0软件包进行统计分析。分别计算各指标的均值及其标准差。两组间比较采用t检验。分类资料用频数表示，组间比较采用配对卡方检验。对有相关趋势的变量进行相关分析。
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2 结 果
2.1 聚合酶链式反应-限制性片段多态性(PCR-RFLP)结果 ApoE是一种具有多态性的蛋白质，有三种常见的异构体即ε2，ε3和ε4。各种异构体的主要区别是氨基酸一级结构的差异，ε3可能是ApoE的母体形式，ε4，ε2是发生在两个不同部位的单一核苷酸点突变的结果，ε2是由ε3的158位精氨酸被半胱氨酸置换所产生，而ε4是由ε3的112位半胱氨酸被精氨酸所替代。由于HhaⅠ内切酶只能内切编码精氨酸的核苷酸顺序GCGC，不能切割编码半胱氨酸的核苷酸顺序GTGC，导致
酶切片段不同(见图1)。图1示各ApoE基因型酶切片段分别为E4/4：35bp,48bp,72bp;E3/
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3:35bp,48bp,91bp;E2/2:83bp,91bp;E4/3:35bp,48bp,72bp,91bp;E2/3:35bp,48bp,83bp,91bp;E4/
2:35bp,48bp,72bp,83bp,91bp。6种载脂蛋白E基因型电泳图如图2所示(系银染相片)。
图1 载脂蛋白E等位基因酶切位点示意图(限制性内切酶HhaⅠ切割)
Fig. 1 Apolipoprotein E alleles cleavage maps by HhaⅠ
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图2 6种载脂蛋白E基因型电泳图(PCR-RFLP)
Fig. 2 Electrophoretic results of apolipoprotein E genotypes by PCR-RFLP
2.2 健康儿童ApoE基因型及其等位基因频率分布 从表1，表2可看出，长沙地区健康儿童中ApoE基因型及等位基因频率分布不均，E3/3发生频率最高，次为含ApoE3的杂合子(E3/4，E3/2)，E2/2，E4/4，E2/4发生频率最低。ApoE等位基因频率分布亦以ε3最常见，ε4及ε2等位基因发生频率低。
表1 长沙地区健康儿童ApoE基因型分布
, 百拇医药
E4/4
E3/3
E2/2
E4/3
E2/3
E4/2
例数
1
210
2
33
44
, 百拇医药
1
百分率
0.04
72.41
0.07
11.38
15.14
0.04
表2 长沙地区健康儿童ApoE等位基因频率分布
ε2
ε3
ε4
, 百拇医药
例数
24.5
248.5
18
百分率
0.08
0.86
0.06
①等位基因频率采用平衡法计算
2.3 男女儿童ApoE等位基因频率的比较 数值显示女童ε2，ε4等位基因频率较男童为高，但经配对卡方检验，无统计学意义(P>0.05)。说明长沙地区健康儿童中ApoE等位基因频率分布并无明显的性别差异。
, 百拇医药
2.4 健康儿童ApoE基因型及其等位基因对血脂、脂蛋白、Apo浓度的影响 表3可见，依E2/2，E3/2，E4/2，E3/3，E4/3，E4/4顺序，血TC，LDL-C浓度逐渐增加，ApoE浓度逐渐下降，血TG，ApoB100水平呈上升趋势，HDL-C，ApoA1，Lp(a)没有明显变化。从表4可看出，与ε3等位基因携带者比较，Apoε2等位基因携带者具有较低的血TC，LDL-C，ApoB100水平和较高的HDL-C，ApoA1，ApoE水平，差异有统计学意义(P<0.05)。ε4等位基因携带者的血脂、脂蛋白、Apo浓度改变则相反(P<0.05)。ApoE等位基因对血TG，Lp(a)浓度的影响不明显(P>0.05)。等级相关分析ε2，ε3，ε4等位基因与血TC，LDL-C，ApoB100浓度呈正相关(等级相关系数分别为0.45，0.34，0.306，P<0.05)；与HDL-C，ApoA1，ApoE水平呈负相关(等级相关系数为-0.27，-0.33，-0.30，P<0.05)，与TG，Lp(a)浓度无明显相关(等级相关系数为0.14，0.10，P>0.05)。
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表3 长沙地区健康儿童ApoE等位基因对血脂、脂蛋白、Apo水平的影响(
±s) 基因型
例数
TG
(mmol.L-1)
TC
(mmol.L-1)
HDL-C
(mmol.L-1)
LDL-C
, 百拇医药
(mmol.L-1)
ApoA1
(mg.dl-1)
ApoB100
(mg.L-1)
Lp(a)
(mg.L-1)
ApoE
(mg.L-1)
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E2/2
2
0.44
2.56
1.78
0.56
113.00
32.30
885.00
50.00
E2/3
44
, 百拇医药 0.91±0.40
2.91±0.64
1.86±0.57
0.87±0.46
141.48±25.41
56.76±22.44
365.79±87.34
37.64±8.59
E4/2
1
0.84
2.98
, 百拇医药
1.34
1.06
98.43
58.75
969.22
35.2
E3/3
210
0.96±0.43
3.08±0.63
1.66±0.44
1.05±0.55
, 百拇医药
133.43±38.34
65.98±21.46
440.00±577.02
33.79±9.97
E3/4
33
1.07±0.51
4.06±0.62
1.51±0.36
1.85±0.59
107.01±25.12
, 百拇医药
70.05±27.84
459.92±618.95
28.01±7.47
E4/4
1
1.60
4.18
1.86
1.60
138.65
65.14
177.90
, 百拇医药
33.00
表4 长沙地区健康儿童ApoE等位基因对血脂、脂蛋白、Apo水平的影响(±s) 等位
基因
TG
(mmol.L-1)
TC
(mmol.L-1)
HDL-C
(mmol.L-1)
, 百拇医药
LDL-C
(mmol.L-1)
ApoA1
(mg.dl-1)
ApoB100
(mg.L-1)
Lp(a)
(mg.L-1)
ApoE
(mg.L-1)
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ε2
0.92±0.40
2.90±0.63①
1.86±0.44①
0.96±0.44①
143.48±25.41①
56.56±22.44①
369.79±487.34
38.64±8.59①
ε3
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0.96±0.43
3.08±0.63
1.66±0.44
1.05±0.50
133.43±38.34
65.98±21.46
440.00±577.02
33.79±9.97
ε4
1.06±0.50
4.05±0.62②
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1.52±0.36②
0.85±0.58②
107.13±25.11②
70.06±27.83②
460.92±418.82
28.01±7.57②
①ε2组与ε3组相比较，P<0.05；②ε4组与ε3组相比较，P<0.05
2.5 男女儿童ApoE等位基因对血脂、脂蛋白、Apo浓度的影响 携带ε2等位基因的男童与女童比较，从数值上看，前者血TG，TC，LDL-C,Lp(a),ApoB100浓度较低，HDL-C，ApoA1，ApoE水平较高；携带ε4等位基因的男童与女童比较，前者TG，TC，LDL-C，Lp(a),ApoB100较高；HDL-C，ApoA1，ApoE较低。说明ApoE基因多态性对血脂、脂蛋白及Apo浓度的影响有性别差异，男童较女童更明显。但经统计学处理，差异均无显著性(P>0.05)。
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3 讨 论
ApoE是脂蛋白的组成成分，并参与脂蛋白转化和代谢过程[1，4]。在胆固醇和TG代谢中起关键(或核心)作用，与高脂蛋白血症及AS的发生发展密切相关[2]。人ApoE是一个含有299个氨基酸结合有磷脂的糖蛋白。1982年完成了人ApoE的全部氨基酸序列分析。ApoE是一多态性蛋白，有3种主要异构体，E2，E3，E4及数种次要的异构体。各种异构体的主要区别在于氨基酸的一级结构，E3可能是ApoE的母体形式，E2，E4是发生在两个不同部位的单一核苷酸点突变的结果[1]。
正常人群中6种ApoE表现型或基因型分布不均，但有其共同特点：①E3/3发生频率超过50%；②含ApoE3的杂合子(E3/4、E3/2)居中；③E2/2，E4/4，E2/4发生频率最低[1]。本文采用改良PCR-RFLP方法测定了长沙地区291名儿童ApoE基因型。结果发现长沙地区健康儿童中ApoE基因型及等位基因频率也不均一，E3/3发生频率最高；其次为E3/4，E3/2，E2/2，E4/4，E2/4发生频率最低。ApoE等位基因频率分布亦以ε3最常见，ε4及ε2等位基因发生频率低。此与一般人群中ApoE分布的特点相符。ApoE基因存在种族差异，非洲黑人ε4等位基因的频率较高，欧洲ε4等位基因频率由北向南逐渐下降，而亚洲人群中ε4等位基因的频率较低(日本0.06，新加坡0.096)[1，2]。我国游学科等人[5]分析了100名健康成年人ApoE基因型，ε2，ε3，ε4等位基因的频率分别是0.05，0.88，0.07。本文结果与之基本一致。支持亚洲人群中ε4等位基因的频率较低的论点。
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大量研究表明ApoE基因多态性影响血脂浓度，与CHD密切相关，并且ε4等位基因被认为是CHD的重要遗传标记[2]。ApoE亦影响儿童和青少年的血脂水平。有人[6]在调查了195名8～11岁意大利儿童后发现ApoE基因频率分别为ε2 0.062，ε3 0.867，ε4 0.071。ε2等位基因的作用是降低TC，LDL-C，ApoB水平和升高HDL-C水平，ε4的作用则相反。儿童ApoE基因对血TG浓度的影响不明显。同时观察到ApoE基因多态性对儿童血脂、脂蛋白、Apo水平的影响有性别差异，ApoE基因变异能解释TC变化的5.1%，LDL-C 7.6%，HDL-C 14.1%；ApoB 7.3%[6]。芬兰儿童和青少年ApoE等位基因频率是ε2 0.039，ε3 0.767，ε4 0.194，男女之间无明显差异，依E2/2，E3/2，E4/2，E3/3，E4/3，E4/4顺序TC，LDL-C，ApoB浓度逐渐增加，男性较女性更明显，而HDL-C，ApoA1，TG，Lp(a)没有明显变化[7]。Srinvasan等[8]研究了8～17岁黑人及白人青少年ApoE对血脂浓度的影响，发现ApoE表型及等位基因频率存在明显种族差异，但没有性别差异。白人青少年的ε2等位基因携带者的血浆LDL-C，ApoB浓度相对ε3者低，ε4等位基因的作用则相反；黑人青少年显示出类似现象，但其程度较轻。ε2等位基因者显示出较高的HDL-C和ApoA1水平。ApoE等位基因引起血脂差异的机制还不十分清楚，可能与各种ApoE异构体的受体结合活性及自身体内代谢速率明显差异有关[9]。本文亦表明ApoE基因多态性同样影响小儿血脂代谢，且其特点与国外文献报道的结果类似。并且发现ε2，ε3，ε4等 位基因与血TC，LDL-C，ApoB100浓度呈等级正相关，与HDL-C，ApoA1，ApoE水平呈等级负相关。
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不同ApoE基因型个体对高脂血症、CHD和脑卒中等疾病易感性存在明显差异，ε4等位基因频率分布可能与世界各地发病率不同有密切关系。如在芬兰人群中，CHD的发病率居世界前列，而ε4等位基因频率最高(0.227)；与此相反，亚洲人群发病率低，ε4等位基因频率亦低。有人认为ε2等位基因可能对人体有保护作用[1，2]。CHD起源于儿童时期，从预防角度来看CHD也是一种儿科疾病。因此在儿童中进行ApoE基因型的检查，早期发现CHD高危人群，并对他们进行一级预防，具有较大的临床意义。
①本院博士研究生 现在海南省人民医院儿科工作 ②第二附属医院中心实验室
作者：向伟 男 35岁 主治医师
参考文献
1 Siest G, Pillot T, Bailly A, et al. Apolipoprotein E: An important gene and protein to follow in laboratory medicine. Clin Chem, 1995,41:1068～1086
, 百拇医药
2 Peter WF, Richard H, Martin G, et al. Apolipoprotein AE alleles, dyslipidemia and coronary heart disease. JAMA, 1994,272:1666～1671
3 Hixson JE. Restiction isotyping of human apolipoprotein E by gene amplification and cleavage with HhaⅠ. J Lipid Res, 1990,31:545～548
4 Grundy SM, Vega GL. Role of apolipoprotein levels in clinical practice. Arch Inten Med, 1990,150:1579～1582
5 游学科，赵水平，朱铁兵，等.人载脂蛋白E基因的PCR-RFLP分型.湖南医科大学学报，1995，20(4)：333～335
, http://www.100md.com
6 Xu CF, Talmud PJ, Angelico F, et al. Apolipoprotein E polymorphism and plasma lipid, lipoprotein, and apolipoprotein levels in Italian children. Genet Epidemiol, 1991,8(6):389～398
7 Lehtimaki T, Moilanen T, Viikari J. Apolipoprotein ephenotypes in Finnish youths: A cross sectional and 6-year follow-up study. J Lipid Res, 1990,31:487～495
8 Srinivasan SR, Lhnholm C, Wattigney W, et al. Apolipoprotein E polymorphism and its association with serum lipoprotein concentration in black versus white children: The bogalusa heart study. Metabolsim, 1993,42(3):381～386
9 Avel RJ. Functional activities of hepatic lipoprotein receptors.
Annu Rev Physiol, 1986,48:119～134
1998-01-12 收稿, http://www.100md.com
单位：向 伟(第二附属医院儿科 长沙 410011)；赵水平 彭道泉 游学科 周宏年(第二附属医院心血管内科 长沙 410011)
关键词：血胆固醇；载脂蛋白E*；基因；儿童
湖南医科大学学报990306 提要 采用改良的PCR-RFLP方法测定长沙地区291名儿童载脂蛋白(Apo)E基因型。结果发现ε2，ε3，ε4等位基因的频率分别是0.081，0.857和0.062。ApoE等位基因频率分布无明显的性别差异(P>0.05)。Apoε2等位基因携带者与其它ApoE基因携带者相比，血高密度脂蛋白-胆固醇、ApoE和ApoA1浓度较高，而总胆固醇、低密度脂蛋白-胆固醇、ApoB100水平较低(P<0.05)。ε4等位基因携带者的血脂、脂蛋白、Apo改变则相反(P<0.05)。结果还显示ApoE等位基因对血甘油三酯、脂蛋白(a)浓度的影响不明显(P>0.05)。ε2，ε3，ε4等位基因与血总胆固醇、低密度脂蛋白-胆固醇、ApoB100浓度呈等级正相关，与高密度脂蛋白-胆固醇、ApoA1及ApoE水平呈等级负相关(P<0.05)。ApoE基因对血清脂类的影响存在性别差异。ApoE基因多态性影响小儿血清脂类代谢。
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Apolipoprotein E polymorphism and plasma lipid, lipoprotein,apolipoprotein levels in 291 children of Changsha
Xiang Wei, Zhao Shuiping, Peng Daoquan, et al
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In order to investigate the distribution of apolipoprotein(Apo) E polymorphism and effect of ApoE genotypes on plasma lipid, lipoprotein, apolipoprotein levels in children of Changsha, we determined ApoE genotypes in 291 children by means of PCR-RFLP. ApoE allele frequencies in the population were ε2=0.081,ε3=0.857,ε4=0.062. There were no difference in the ApoE genotypes distribution between sexes. The children with Apoε2 allele had higher levels of ApoE, ApoA1 and high density lipoprotein-cholesterol together with lower levels of total cholesterol, ApoB100 and low density lipoprotein-cholesterol than those with other ApoE alleles. These changes were opposite in children with Apoε4 allele. The levels of plasma triglyceride, lipoprotein(a) were not affected significantly by ApoE alleles. Moreover, the effect of ApoE genotypes on levels of plasma lipids was different between sexes. These results suggest that ApoE polymorphisms could affect plasma lipids metabolism in children.
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载脂蛋白(Apo)E是一种由遗传决定的具有多态性的蛋白质，由人类第19号染色体一个基因位点上的三个等位基因ε2，ε3，ε4编码。因此人群中具有三种纯合子基因型E2/2，E3/3，E4/4和三种杂合子基因型E2/3，E3/4，E2/4[1]。不同异构体与受体结合活性以及自身在体内代谢途径存在明显差异。近年研究表明，ApoE结构与机能异常同高脂血症、动脉粥样硬化(AS)形成及其严重程度密切相关，并且认为ε4等位基因可能是冠心病(CHD)的重要遗传标记[1，2]。因此在人群中进行ApoE基因分型对有关疾病的诊断和防治具有重要的临床意义。国外对于ApoE基因的研究引人注目[2]，而我国迄今尚未见有关儿童ApoE的报道。为此作者于1995～1996年对长沙地区291名健康儿童进行ApoE基因型的研究，旨在探讨ApoE基因多态性及其意义。
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1 对象与方法
1.1 对象和标本来源 受试者为长沙地区健康普查的儿童291人，经病史询问、体格检查、心电图、胸部透视、肝肾功能检查及血脂、血糖测定，排除了可引起血脂异常的全身性疾病。291例中男151例，女140例，年龄6～14(平均9.5±2.6)岁。受试者禁食12h。抽取其外周静脉血5ml，以2% EDTA抗凝，分离血浆，置-70℃低温下保存备用。
1.2 试剂与方法
1.2.1 主要试剂及PCR引物 上游引物：5’-TAAGCTTGGCACGGCTGTCAAGGA-3’；下游引物：5’-GAATTCGCCCCGGCCTGGTACAC-3’，上海生物工程研究所合成。4种脱氧核苷酸(dNTP)购自上海复华公司，Taq DNA多聚酶、HhaⅠ核酸内切酶为Promega公司产品。
1.2.2 ApoE基因型检测 按常规方法进行周围血细胞DNA抽提。参照改良Hixson JE法进行PCR扩增[3]。扩增条件：95℃ 72s，72℃ 3min，循环5次；95℃ 72s，55℃ 56s，72℃ 60s，循环30次。PCR产物用2%琼脂糖凝胶电泳分离后，紫外透射灯下检测，若在233bp处出现荧光条带，即为特异性PCR产物。限制性核酸内切酶酶解PCR产物：取PCR产物10μl加入HhaⅠ内切酶5U，混匀后置37℃酶解3h以上。电泳：采用聚丙烯酰胺凝胶电泳，以PUC18/HpaⅡ酶解片段为DNA片段大小的标准物，紫外透射灯下观察结果。
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1.2.3 全套血脂检测 ⑴总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)等的检测：TC，TG采用酶法；高密度脂蛋白-胆固醇(HDL-C)采用磷钨酸镁沉淀法；低密度脂蛋白-胆固醇(LDL-C)按Friedewaid公式计算，LDL-C=TC-(TG/2.2+HDL-C)。⑵ApoE，ApoA,ApoB100浓度检测：ApoE采用ApoE单克隆抗体作酶标抗体，应用酶联免疫一步法测定，试剂盒由南京聚力生物医学工程研究所提供；ApoA1和ApoB100采用免疫浊度法，试剂盒由宁波慈利生物制剂厂提供。⑶脂蛋白(a)[Lp(a)]浓度检测：采用羊抗人Lp(a)血清，ELISA双抗夹心法测定，试剂盒由南京军区总医院生化科提供。
1.2.4 统计学处理 应用S486型计算机，FOX-2.5软件包建立数据库，S-4.0软件包进行统计分析。分别计算各指标的均值及其标准差。两组间比较采用t检验。分类资料用频数表示，组间比较采用配对卡方检验。对有相关趋势的变量进行相关分析。
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2 结 果
2.1 聚合酶链式反应-限制性片段多态性(PCR-RFLP)结果 ApoE是一种具有多态性的蛋白质，有三种常见的异构体即ε2，ε3和ε4。各种异构体的主要区别是氨基酸一级结构的差异，ε3可能是ApoE的母体形式，ε4，ε2是发生在两个不同部位的单一核苷酸点突变的结果，ε2是由ε3的158位精氨酸被半胱氨酸置换所产生，而ε4是由ε3的112位半胱氨酸被精氨酸所替代。由于HhaⅠ内切酶只能内切编码精氨酸的核苷酸顺序GCGC，不能切割编码半胱氨酸的核苷酸顺序GTGC，导致
酶切片段不同(见图1)。图1示各ApoE基因型酶切片段分别为E4/4：35bp,48bp,72bp;E3/
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3:35bp,48bp,91bp;E2/2:83bp,91bp;E4/3:35bp,48bp,72bp,91bp;E2/3:35bp,48bp,83bp,91bp;E4/
2:35bp,48bp,72bp,83bp,91bp。6种载脂蛋白E基因型电泳图如图2所示(系银染相片)。
图1 载脂蛋白E等位基因酶切位点示意图(限制性内切酶HhaⅠ切割)
Fig. 1 Apolipoprotein E alleles cleavage maps by HhaⅠ
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图2 6种载脂蛋白E基因型电泳图(PCR-RFLP)
Fig. 2 Electrophoretic results of apolipoprotein E genotypes by PCR-RFLP
2.2 健康儿童ApoE基因型及其等位基因频率分布 从表1，表2可看出，长沙地区健康儿童中ApoE基因型及等位基因频率分布不均，E3/3发生频率最高，次为含ApoE3的杂合子(E3/4，E3/2)，E2/2，E4/4，E2/4发生频率最低。ApoE等位基因频率分布亦以ε3最常见，ε4及ε2等位基因发生频率低。
表1 长沙地区健康儿童ApoE基因型分布
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E4/4
E3/3
E2/2
E4/3
E2/3
E4/2
例数
1
210
2
33
44
, 百拇医药
1
百分率
0.04
72.41
0.07
11.38
15.14
0.04
表2 长沙地区健康儿童ApoE等位基因频率分布
ε2
ε3
ε4
, 百拇医药
例数
24.5
248.5
18
百分率
0.08
0.86
0.06
①等位基因频率采用平衡法计算
2.3 男女儿童ApoE等位基因频率的比较 数值显示女童ε2，ε4等位基因频率较男童为高，但经配对卡方检验，无统计学意义(P>0.05)。说明长沙地区健康儿童中ApoE等位基因频率分布并无明显的性别差异。
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2.4 健康儿童ApoE基因型及其等位基因对血脂、脂蛋白、Apo浓度的影响 表3可见，依E2/2，E3/2，E4/2，E3/3，E4/3，E4/4顺序，血TC，LDL-C浓度逐渐增加，ApoE浓度逐渐下降，血TG，ApoB100水平呈上升趋势，HDL-C，ApoA1，Lp(a)没有明显变化。从表4可看出，与ε3等位基因携带者比较，Apoε2等位基因携带者具有较低的血TC，LDL-C，ApoB100水平和较高的HDL-C，ApoA1，ApoE水平，差异有统计学意义(P<0.05)。ε4等位基因携带者的血脂、脂蛋白、Apo浓度改变则相反(P<0.05)。ApoE等位基因对血TG，Lp(a)浓度的影响不明显(P>0.05)。等级相关分析ε2，ε3，ε4等位基因与血TC，LDL-C，ApoB100浓度呈正相关(等级相关系数分别为0.45，0.34，0.306，P<0.05)；与HDL-C，ApoA1，ApoE水平呈负相关(等级相关系数为-0.27，-0.33，-0.30，P<0.05)，与TG，Lp(a)浓度无明显相关(等级相关系数为0.14，0.10，P>0.05)。
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表3 长沙地区健康儿童ApoE等位基因对血脂、脂蛋白、Apo水平的影响(
±s) 基因型例数
TG
(mmol.L-1)
TC
(mmol.L-1)
HDL-C
(mmol.L-1)
LDL-C
, 百拇医药
(mmol.L-1)
ApoA1
(mg.dl-1)
ApoB100
(mg.L-1)
Lp(a)
(mg.L-1)
ApoE
(mg.L-1)
, http://www.100md.com
E2/2
2
0.44
2.56
1.78
0.56
113.00
32.30
885.00
50.00
E2/3
44
, 百拇医药 0.91±0.40
2.91±0.64
1.86±0.57
0.87±0.46
141.48±25.41
56.76±22.44
365.79±87.34
37.64±8.59
E4/2
1
0.84
2.98
, 百拇医药
1.34
1.06
98.43
58.75
969.22
35.2
E3/3
210
0.96±0.43
3.08±0.63
1.66±0.44
1.05±0.55
, 百拇医药
133.43±38.34
65.98±21.46
440.00±577.02
33.79±9.97
E3/4
33
1.07±0.51
4.06±0.62
1.51±0.36
1.85±0.59
107.01±25.12
, 百拇医药
70.05±27.84
459.92±618.95
28.01±7.47
E4/4
1
1.60
4.18
1.86
1.60
138.65
65.14
177.90
, 百拇医药
33.00
表4 长沙地区健康儿童ApoE等位基因对血脂、脂蛋白、Apo水平的影响(
±s) 等位基因
TG
(mmol.L-1)
TC
(mmol.L-1)
HDL-C
(mmol.L-1)
, 百拇医药
LDL-C
(mmol.L-1)
ApoA1
(mg.dl-1)
ApoB100
(mg.L-1)
Lp(a)
(mg.L-1)
ApoE
(mg.L-1)
, http://www.100md.com
ε2
0.92±0.40
2.90±0.63①
1.86±0.44①
0.96±0.44①
143.48±25.41①
56.56±22.44①
369.79±487.34
38.64±8.59①
ε3
, http://www.100md.com
0.96±0.43
3.08±0.63
1.66±0.44
1.05±0.50
133.43±38.34
65.98±21.46
440.00±577.02
33.79±9.97
ε4
1.06±0.50
4.05±0.62②
, http://www.100md.com
1.52±0.36②
0.85±0.58②
107.13±25.11②
70.06±27.83②
460.92±418.82
28.01±7.57②
①ε2组与ε3组相比较，P<0.05；②ε4组与ε3组相比较，P<0.05
2.5 男女儿童ApoE等位基因对血脂、脂蛋白、Apo浓度的影响 携带ε2等位基因的男童与女童比较，从数值上看，前者血TG，TC，LDL-C,Lp(a),ApoB100浓度较低，HDL-C，ApoA1，ApoE水平较高；携带ε4等位基因的男童与女童比较，前者TG，TC，LDL-C，Lp(a),ApoB100较高；HDL-C，ApoA1，ApoE较低。说明ApoE基因多态性对血脂、脂蛋白及Apo浓度的影响有性别差异，男童较女童更明显。但经统计学处理，差异均无显著性(P>0.05)。
, 百拇医药
3 讨 论
ApoE是脂蛋白的组成成分，并参与脂蛋白转化和代谢过程[1，4]。在胆固醇和TG代谢中起关键(或核心)作用，与高脂蛋白血症及AS的发生发展密切相关[2]。人ApoE是一个含有299个氨基酸结合有磷脂的糖蛋白。1982年完成了人ApoE的全部氨基酸序列分析。ApoE是一多态性蛋白，有3种主要异构体，E2，E3，E4及数种次要的异构体。各种异构体的主要区别在于氨基酸的一级结构，E3可能是ApoE的母体形式，E2，E4是发生在两个不同部位的单一核苷酸点突变的结果[1]。
正常人群中6种ApoE表现型或基因型分布不均，但有其共同特点：①E3/3发生频率超过50%；②含ApoE3的杂合子(E3/4、E3/2)居中；③E2/2，E4/4，E2/4发生频率最低[1]。本文采用改良PCR-RFLP方法测定了长沙地区291名儿童ApoE基因型。结果发现长沙地区健康儿童中ApoE基因型及等位基因频率也不均一，E3/3发生频率最高；其次为E3/4，E3/2，E2/2，E4/4，E2/4发生频率最低。ApoE等位基因频率分布亦以ε3最常见，ε4及ε2等位基因发生频率低。此与一般人群中ApoE分布的特点相符。ApoE基因存在种族差异，非洲黑人ε4等位基因的频率较高，欧洲ε4等位基因频率由北向南逐渐下降，而亚洲人群中ε4等位基因的频率较低(日本0.06，新加坡0.096)[1，2]。我国游学科等人[5]分析了100名健康成年人ApoE基因型，ε2，ε3，ε4等位基因的频率分别是0.05，0.88，0.07。本文结果与之基本一致。支持亚洲人群中ε4等位基因的频率较低的论点。
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大量研究表明ApoE基因多态性影响血脂浓度，与CHD密切相关，并且ε4等位基因被认为是CHD的重要遗传标记[2]。ApoE亦影响儿童和青少年的血脂水平。有人[6]在调查了195名8～11岁意大利儿童后发现ApoE基因频率分别为ε2 0.062，ε3 0.867，ε4 0.071。ε2等位基因的作用是降低TC，LDL-C，ApoB水平和升高HDL-C水平，ε4的作用则相反。儿童ApoE基因对血TG浓度的影响不明显。同时观察到ApoE基因多态性对儿童血脂、脂蛋白、Apo水平的影响有性别差异，ApoE基因变异能解释TC变化的5.1%，LDL-C 7.6%，HDL-C 14.1%；ApoB 7.3%[6]。芬兰儿童和青少年ApoE等位基因频率是ε2 0.039，ε3 0.767，ε4 0.194，男女之间无明显差异，依E2/2，E3/2，E4/2，E3/3，E4/3，E4/4顺序TC，LDL-C，ApoB浓度逐渐增加，男性较女性更明显，而HDL-C，ApoA1，TG，Lp(a)没有明显变化[7]。Srinvasan等[8]研究了8～17岁黑人及白人青少年ApoE对血脂浓度的影响，发现ApoE表型及等位基因频率存在明显种族差异，但没有性别差异。白人青少年的ε2等位基因携带者的血浆LDL-C，ApoB浓度相对ε3者低，ε4等位基因的作用则相反；黑人青少年显示出类似现象，但其程度较轻。ε2等位基因者显示出较高的HDL-C和ApoA1水平。ApoE等位基因引起血脂差异的机制还不十分清楚，可能与各种ApoE异构体的受体结合活性及自身体内代谢速率明显差异有关[9]。本文亦表明ApoE基因多态性同样影响小儿血脂代谢，且其特点与国外文献报道的结果类似。并且发现ε2，ε3，ε4等 位基因与血TC，LDL-C，ApoB100浓度呈等级正相关，与HDL-C，ApoA1，ApoE水平呈等级负相关。
, 百拇医药
不同ApoE基因型个体对高脂血症、CHD和脑卒中等疾病易感性存在明显差异，ε4等位基因频率分布可能与世界各地发病率不同有密切关系。如在芬兰人群中，CHD的发病率居世界前列，而ε4等位基因频率最高(0.227)；与此相反，亚洲人群发病率低，ε4等位基因频率亦低。有人认为ε2等位基因可能对人体有保护作用[1，2]。CHD起源于儿童时期，从预防角度来看CHD也是一种儿科疾病。因此在儿童中进行ApoE基因型的检查，早期发现CHD高危人群，并对他们进行一级预防，具有较大的临床意义。
①本院博士研究生 现在海南省人民医院儿科工作 ②第二附属医院中心实验室
作者：向伟 男 35岁 主治医师
参考文献
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9 Avel RJ. Functional activities of hepatic lipoprotein receptors.
Annu Rev Physiol, 1986,48:119～134
1998-01-12 收稿, http://www.100md.com