犬副流感流行毒株的分离与鉴定
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37c医学网
作者：金昌德 李六金 施新猷 师长宏 赵世君
单位：金昌德(第四军医大学实验动物研究中心，陕西 西安 710033)；李六金(第四军医大学实验动物研究中心，陕西 西安 710033)；施新猷(第四军医大学实验动物研究中心，陕西 西安 710033)；师长宏(第四军医大学实验动物研究中心，陕西 西安 710033)；赵世君(第四军医大学实验动物研究中心，陕西 西安 710033)
关键词：犬副流感病毒；流行毒株；分离；鉴定
第四军医大学学报000623 摘要:目的 分离和鉴定犬副流感病毒. 方法 无菌抽取病犬脑脊液，接种到Vero细胞，72 h后收集培养液进行回归动物试验，并采用形态学观察、血凝特性、血球吸附试验以及细胞敏感性、中和试验和交叉中和试验等方法进行系统鉴定. 结果 从病犬脑脊液中分离出一株CPIV流行毒株(CPIV-XN931). 接种Vero细胞后，出现明显的细胞病变作用，对Vero和MDCK敏感，对2.5 mL.L-1豚鼠红细胞具有显著的吸附作用；其超微结构具有副粘病毒的基本特点，中和抗体效价和交叉中和抗体效价都高达1024. 结论 成功分离犬副流感病毒CPIV-XN931.
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中图号：S852.653 文献标识码：A
文章编号：1000-2790(2000)06-0719-03
Isolation and identification of wild-type strain of canine parainfluenza virus
JIN Chang-De LI Liu-Jin SHI Xin-You SHI Chang-Hong ZHAO Shi-Jun
(Laboratory Animal Research Center, Fourth Military Medical University, Xi'an 710033，China)
Abstract:AIM To isolate and to identify canine parainfluenza virus(CPIV). METHODS The sick canine cerebrospinalfluid(CSF) was used to infect the Vero cell. After 72 hrs, culture medium was collected for the reversion animal test. Morpholog studa, hemagglutination(HA)property, erythrocyte absorption，neutralizing and cross-neutralizing tests were performed to identify the virus. RESULTS A CPIV epidemic virus strain was isolated from the sick canine CSF，named CPIV-XN931. After infecting the Vero cell，the cellular pathogenic effect(CPE)could be observed obviously. This virus could absorb guinea pig red cells(2.5 mL.L-1)strongly，and had the basic character of parainfluenza virus in the ultrastructure. The titer of neutralized antibody and cross- neutralized antibody all fell to 1024. CONCLUSION The isolated is a strain of CPIV-XN931.
, 百拇医药
Keyword:canine parainfluenza virus；wild-type strain；isolation；identification
0 引言
犬副流感是由犬副流感病毒(Canine parainfluenza virus，CPIV)引起的一种犬的接触性传染病. 通过皮内接种CPIV，可导致犬发生咽炎、扁桃体炎和支气管炎等病症. 我们从一只患后肢麻痹的病犬脑脊髓液(CSF)中分离出一株CPIV流行毒株，并对其形态结构特征和生物学特性进行了系统鉴定.
1 材料和方法
1.1 材料 CPIV-D008标准毒株及其免疫血清购自美国Fort Dodge公司. CPIV-XN931免疫血清由本实验室自制. Vero,MA-104,IBRS,F-81,MDCK及Hela等传代细胞均从美国ATCC购进. 6 wk CPIV抗体阴性犬30只购自非疫区.
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1.2 病毒分离
1.2.1 病料处理 无菌手术抽取CSF，置含10 mL.L-1犊牛血清和适量双抗的Hank's 液中，4℃过夜. 将样品用微型台式离心机以3000 r.min-1离心30 min，除去杂质后用0.45 μm的滤膜过滤除菌，滤液置-20℃冰箱.
1.2.2 细胞敏感性试验 处理好的样品用Hank's液按1∶1,1∶3,1∶5,1∶7和1∶9稀释，分别接种于Vero,MA-104,IBRS,F-81,MDCK和Hela细胞，于37℃培养，进行动态观察. 分别收集8～96 h细胞培养液，备用.
1.2.3 回归动物试验 将24只CPIV抗体阴性仔犬，人工饲养至2 mo时分为8组，每组3只. 试验组a和试验组b及对照组分别脑内接种CSF样品和CPIV-XN931 Vero细胞培养液及Hank's液，接种量为0.5 mL/只. 接种后第7日处死犬，分别取CSF、血浆白细胞黄层、心、肝、肾等样品，分别测病毒TCID50.
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1.3 红血球吸附试验 选用大鼠、豚鼠、犬和鸡红细胞作为被感染细胞单层的吸附对象. 于接毒后8～96 h，分别作红血球吸附试验[1].
1.4 血凝特性 将鸡、猪、人“O”型、豚鼠、犬、绵羊和家兔等动物的红血球，用pH 7.5的PBS液稀释，以3000 r.min-1离心、洗涤，重复3次；再用pH 7.4的0.015 mol.L-1 PBS液制备5 ml.L-1红细胞悬液，在96孔U型微量反应板上进行HA试验[1].
1.5 中和试验 采取稀释血清-固定病毒的方法[1]在U型微量反应板上进行.
1.6 电镜观察
1.6.1 负染色 收集CPIV-XN931感染的Vero细胞培养物10 mL按常规方法[2]，用20 g.L-1磷钨酸(PTA)负染后电镜观察.
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1.6.2 免疫电镜 收集CPIV-XN931感染的Vero细胞培养物5 mL,加入0.1 mL豚鼠抗CPIV高免血清，振荡1 min后于37℃感作60 min，以6000 g离心15 min，弃上清，用1滴蒸镏水悬浮其沉淀，按常规法负染色后电镜观察.
1.7 交叉中和试验 采用固定病毒-稀释血清的方法进行. 将3种抗血清2倍连续稀释，与3种病毒交叉混合，37℃感作60 min，再接种Vero细胞单层，培养6～8 d，观察CPE.
2 结果
2.1 CPIV的分离 CSF处理样品接种Vero细胞单层培养7 d时发现1∶5,1∶7和1∶9稀释度出现明显的CPE.
2.2 细胞敏感性 CPIV-XN931毒株在MDCK和Vero细胞上引起较明显的CPE，而对IBRS,MA-104,F-81及Hela细胞均不敏感.
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2.3 回归动物试验 CSF和白细胞黄层的病毒效价最高，TCID50分别为10-5和10-3，在Vero细胞上CPE明显，其余样品均未出现CPE.
2.4 红细胞吸附试验 犬、鼠、鸡和豚鼠红细胞对CPIV-XN931均有吸附作用，尤以豚鼠红细胞吸附能力最强，在接毒后18 h即出现吸附现象，24 h后吸附作用逐渐稳定.
2.5 电镜观察
2.5.1 负染样品观察 在接种CPIV的Vero细胞培养物中，观察到形态多样、大小不等的病毒粒子. 当病毒粒子完整无损时，病毒体呈白色外观，并在其表面上附有密集的纤突结构；有的病毒粒子已破裂，可以见到粒子内部螺旋对称的核衣壳. 丝状体比较多见，有的丝状体长达800 nm以上(Fig 1).
, http://www.100md.com 2.5.2 免疫电镜观察 CPIV 培养物与豚鼠抗CPIV高免血清(50倍稀释)作用后，电镜未见大块的抗原—抗体免疫复合物，但能看到单个病毒粒子表面吸附有抗体分子，其纤突加宽变厚，呈现不规则的外观，个别病毒粒子已破裂，核衣壳呈螺旋对称结构(Fig 2)；游离出来的病毒粒子核衣壳周围也附着有抗体分子(Fig 3).
图 1 犬副流感病毒丝状形态
Fig 1 Filariform figure of canine parainfluenza virus
图 2 破裂后的犬副流感病毒粒子内部可见螺旋对称的核衣壳结构
Fig 2 Helix nuclear capsid inside the canine parainfluenza virus was observed after the disruptive canine parainfluenza virus particles
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图 3 犬副流感病毒粒子破裂后游离出来的核衣壳结构
Fig 3 Structure of nuclear capsid inside the canine parainfluenza virus was freed after the canine parainfluenza virus particles broking
2.6 血凝特性 CPIV-XN931对鸡、猪、兔等动物的红细胞均具有凝集作用，而随着该病毒传代次数的增多，其血凝性逐渐减弱，甚至无规律.
2.7 中和试验 中和抗体效价(SN)高达2048.
2.8 交叉中和试验 CPIV-XN931毒株与CPIV-D008株起交叉中和反应(Tab 1 ).
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表 1 CPIV-XN931株与国际标准毒株交叉中和效价(SN)
Tab 1 The SN of cross-neutralization titer between CPIV-XN931 strain and international standard virus strain Virus type
Immune serum
CPIV-XN931
CPIV-D008
CPIV-XN931
2048
1024
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CPIV-D008
1024
1024
3 讨论
作者采用Baumgartner[3]和Wagener等[4]的方法，从发病7 d的犬副流感病犬CSF中分离出一株CPIV流行毒株，复归动物后试验犬出现后肢麻痹、抽搐等神经症状，证明样品中确实有CPIV病毒存在. 该毒株接种Vero细胞单层出现明显的细胞病变作用；免疫电镜观察仅发现游离出来的核衣壳周围附着有抗体分子，没有见到典型的抗原抗体桥连支架，这可能与样品稀释倍数有关. 对2.5 mL.L-1豚鼠红细胞有较强的吸附能力. 负染样品观察证实该病毒具有副粘病毒的基本结构特征；交叉中和试验结果显示，CPIV-XN931毒株与国外标准毒株D-008具有抗原同一性. 由此可知这次分离病毒是成功的.
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基金项目：国家火炬计划[火炬发(1997)109号]
作者简介：金昌德(1968-),男(朝鲜族),吉林省延吉市人.讲师，硕士生(导师施新猷). Tel.(029)5252978 Email.jcd6811@pub.xaonline.com
参考文献:
[1] 殷 震，刘景华. 动物病毒学[M]. 第2版，北京：科学出版社，1997：354，336-340.
[2] 洪 涛. 生物医学超微结构与电子显微镜技术[M]. 北京：科学出版社，1984：174-182.
[3] Baumgartner W, Krakowka S, Blakeslee J. Evolution of in vitro persistence of two strains of canine parainfluenza virus[J]. Arch Virol,1987; 93(1-2): 147-154.
[4] Wagener JS, Sobonya R, Minnich L et al. Role of canine parainfluenza virus and Bordetella bronchiseptica in kennel cough[J]. Am J Vet Res, 1984; 45(9): 1862-1866.
收稿日期：2000-01-01
修回日期:2000-02-01, 百拇医药
单位：金昌德(第四军医大学实验动物研究中心，陕西 西安 710033)；李六金(第四军医大学实验动物研究中心，陕西 西安 710033)；施新猷(第四军医大学实验动物研究中心，陕西 西安 710033)；师长宏(第四军医大学实验动物研究中心，陕西 西安 710033)；赵世君(第四军医大学实验动物研究中心，陕西 西安 710033)
关键词：犬副流感病毒；流行毒株；分离；鉴定
第四军医大学学报000623 摘要:目的 分离和鉴定犬副流感病毒. 方法 无菌抽取病犬脑脊液，接种到Vero细胞，72 h后收集培养液进行回归动物试验，并采用形态学观察、血凝特性、血球吸附试验以及细胞敏感性、中和试验和交叉中和试验等方法进行系统鉴定. 结果 从病犬脑脊液中分离出一株CPIV流行毒株(CPIV-XN931). 接种Vero细胞后，出现明显的细胞病变作用，对Vero和MDCK敏感，对2.5 mL.L-1豚鼠红细胞具有显著的吸附作用；其超微结构具有副粘病毒的基本特点，中和抗体效价和交叉中和抗体效价都高达1024. 结论 成功分离犬副流感病毒CPIV-XN931.
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中图号：S852.653 文献标识码：A
文章编号：1000-2790(2000)06-0719-03
Isolation and identification of wild-type strain of canine parainfluenza virus
JIN Chang-De LI Liu-Jin SHI Xin-You SHI Chang-Hong ZHAO Shi-Jun
(Laboratory Animal Research Center, Fourth Military Medical University, Xi'an 710033，China)
Abstract:AIM To isolate and to identify canine parainfluenza virus(CPIV). METHODS The sick canine cerebrospinalfluid(CSF) was used to infect the Vero cell. After 72 hrs, culture medium was collected for the reversion animal test. Morpholog studa, hemagglutination(HA)property, erythrocyte absorption，neutralizing and cross-neutralizing tests were performed to identify the virus. RESULTS A CPIV epidemic virus strain was isolated from the sick canine CSF，named CPIV-XN931. After infecting the Vero cell，the cellular pathogenic effect(CPE)could be observed obviously. This virus could absorb guinea pig red cells(2.5 mL.L-1)strongly，and had the basic character of parainfluenza virus in the ultrastructure. The titer of neutralized antibody and cross- neutralized antibody all fell to 1024. CONCLUSION The isolated is a strain of CPIV-XN931.
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Keyword:canine parainfluenza virus；wild-type strain；isolation；identification
0 引言
犬副流感是由犬副流感病毒(Canine parainfluenza virus，CPIV)引起的一种犬的接触性传染病. 通过皮内接种CPIV，可导致犬发生咽炎、扁桃体炎和支气管炎等病症. 我们从一只患后肢麻痹的病犬脑脊髓液(CSF)中分离出一株CPIV流行毒株，并对其形态结构特征和生物学特性进行了系统鉴定.
1 材料和方法
1.1 材料 CPIV-D008标准毒株及其免疫血清购自美国Fort Dodge公司. CPIV-XN931免疫血清由本实验室自制. Vero,MA-104,IBRS,F-81,MDCK及Hela等传代细胞均从美国ATCC购进. 6 wk CPIV抗体阴性犬30只购自非疫区.
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1.2 病毒分离
1.2.1 病料处理 无菌手术抽取CSF，置含10 mL.L-1犊牛血清和适量双抗的Hank's 液中，4℃过夜. 将样品用微型台式离心机以3000 r.min-1离心30 min，除去杂质后用0.45 μm的滤膜过滤除菌，滤液置-20℃冰箱.
1.2.2 细胞敏感性试验 处理好的样品用Hank's液按1∶1,1∶3,1∶5,1∶7和1∶9稀释，分别接种于Vero,MA-104,IBRS,F-81,MDCK和Hela细胞，于37℃培养，进行动态观察. 分别收集8～96 h细胞培养液，备用.
1.2.3 回归动物试验 将24只CPIV抗体阴性仔犬，人工饲养至2 mo时分为8组，每组3只. 试验组a和试验组b及对照组分别脑内接种CSF样品和CPIV-XN931 Vero细胞培养液及Hank's液，接种量为0.5 mL/只. 接种后第7日处死犬，分别取CSF、血浆白细胞黄层、心、肝、肾等样品，分别测病毒TCID50.
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1.3 红血球吸附试验 选用大鼠、豚鼠、犬和鸡红细胞作为被感染细胞单层的吸附对象. 于接毒后8～96 h，分别作红血球吸附试验[1].
1.4 血凝特性 将鸡、猪、人“O”型、豚鼠、犬、绵羊和家兔等动物的红血球，用pH 7.5的PBS液稀释，以3000 r.min-1离心、洗涤，重复3次；再用pH 7.4的0.015 mol.L-1 PBS液制备5 ml.L-1红细胞悬液，在96孔U型微量反应板上进行HA试验[1].
1.5 中和试验 采取稀释血清-固定病毒的方法[1]在U型微量反应板上进行.
1.6 电镜观察
1.6.1 负染色 收集CPIV-XN931感染的Vero细胞培养物10 mL按常规方法[2]，用20 g.L-1磷钨酸(PTA)负染后电镜观察.
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1.6.2 免疫电镜 收集CPIV-XN931感染的Vero细胞培养物5 mL,加入0.1 mL豚鼠抗CPIV高免血清，振荡1 min后于37℃感作60 min，以6000 g离心15 min，弃上清，用1滴蒸镏水悬浮其沉淀，按常规法负染色后电镜观察.
1.7 交叉中和试验 采用固定病毒-稀释血清的方法进行. 将3种抗血清2倍连续稀释，与3种病毒交叉混合，37℃感作60 min，再接种Vero细胞单层，培养6～8 d，观察CPE.
2 结果
2.1 CPIV的分离 CSF处理样品接种Vero细胞单层培养7 d时发现1∶5,1∶7和1∶9稀释度出现明显的CPE.
2.2 细胞敏感性 CPIV-XN931毒株在MDCK和Vero细胞上引起较明显的CPE，而对IBRS,MA-104,F-81及Hela细胞均不敏感.
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2.3 回归动物试验 CSF和白细胞黄层的病毒效价最高，TCID50分别为10-5和10-3，在Vero细胞上CPE明显，其余样品均未出现CPE.
2.4 红细胞吸附试验 犬、鼠、鸡和豚鼠红细胞对CPIV-XN931均有吸附作用，尤以豚鼠红细胞吸附能力最强，在接毒后18 h即出现吸附现象，24 h后吸附作用逐渐稳定.
2.5 电镜观察
2.5.1 负染样品观察 在接种CPIV的Vero细胞培养物中，观察到形态多样、大小不等的病毒粒子. 当病毒粒子完整无损时，病毒体呈白色外观，并在其表面上附有密集的纤突结构；有的病毒粒子已破裂，可以见到粒子内部螺旋对称的核衣壳. 丝状体比较多见，有的丝状体长达800 nm以上(Fig 1).
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图 1 犬副流感病毒丝状形态
Fig 1 Filariform figure of canine parainfluenza virus
图 2 破裂后的犬副流感病毒粒子内部可见螺旋对称的核衣壳结构
Fig 2 Helix nuclear capsid inside the canine parainfluenza virus was observed after the disruptive canine parainfluenza virus particles
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图 3 犬副流感病毒粒子破裂后游离出来的核衣壳结构
Fig 3 Structure of nuclear capsid inside the canine parainfluenza virus was freed after the canine parainfluenza virus particles broking
2.6 血凝特性 CPIV-XN931对鸡、猪、兔等动物的红细胞均具有凝集作用，而随着该病毒传代次数的增多，其血凝性逐渐减弱，甚至无规律.
2.7 中和试验 中和抗体效价(SN)高达2048.
2.8 交叉中和试验 CPIV-XN931毒株与CPIV-D008株起交叉中和反应(Tab 1 ).
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表 1 CPIV-XN931株与国际标准毒株交叉中和效价(SN)
Tab 1 The SN of cross-neutralization titer between CPIV-XN931 strain and international standard virus strain Virus type
Immune serum
CPIV-XN931
CPIV-D008
CPIV-XN931
2048
1024
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CPIV-D008
1024
1024
3 讨论
作者采用Baumgartner[3]和Wagener等[4]的方法，从发病7 d的犬副流感病犬CSF中分离出一株CPIV流行毒株，复归动物后试验犬出现后肢麻痹、抽搐等神经症状，证明样品中确实有CPIV病毒存在. 该毒株接种Vero细胞单层出现明显的细胞病变作用；免疫电镜观察仅发现游离出来的核衣壳周围附着有抗体分子，没有见到典型的抗原抗体桥连支架，这可能与样品稀释倍数有关. 对2.5 mL.L-1豚鼠红细胞有较强的吸附能力. 负染样品观察证实该病毒具有副粘病毒的基本结构特征；交叉中和试验结果显示，CPIV-XN931毒株与国外标准毒株D-008具有抗原同一性. 由此可知这次分离病毒是成功的.
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基金项目：国家火炬计划[火炬发(1997)109号]
作者简介：金昌德(1968-),男(朝鲜族),吉林省延吉市人.讲师，硕士生(导师施新猷). Tel.(029)5252978 Email.jcd6811@pub.xaonline.com
参考文献:
[1] 殷 震，刘景华. 动物病毒学[M]. 第2版，北京：科学出版社，1997：354，336-340.
[2] 洪 涛. 生物医学超微结构与电子显微镜技术[M]. 北京：科学出版社，1984：174-182.
[3] Baumgartner W, Krakowka S, Blakeslee J. Evolution of in vitro persistence of two strains of canine parainfluenza virus[J]. Arch Virol,1987; 93(1-2): 147-154.
[4] Wagener JS, Sobonya R, Minnich L et al. Role of canine parainfluenza virus and Bordetella bronchiseptica in kennel cough[J]. Am J Vet Res, 1984; 45(9): 1862-1866.
收稿日期：2000-01-01
修回日期:2000-02-01, 百拇医药