电镜制样过程中取材时间对超微结构保存的影响
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37c医学网
作者：井建华
单位：井建华(电镜室 长沙 410078)
关键词：电子显微镜术；方法学；大鼠
湖南医科大学学报000240 [摘要] 观察大鼠肝脏离体后不同时间固定对肝细胞超微结 构的影响。结果显示：肝脏离体后浸泡于室温生理盐水中30min，或置4℃冰箱60min， 其超微结构仍可满足电镜诊断的要求；置室温超过30min，超微结构破坏严重，失去观察 价值。
[中图分类号] R329.4 R329.34 [文献标识码] A [文章编号] 1000-5625(2000)02-0205-02
Effect of prolonging time for sampling on preservation of
, http://www.100md.com
ultra structure during the specimen preparation
JING Jian-hua
Laboratory of Electron Micrscopy, Hunan Medical University(Changsha 41007 8)
[Abstract] The ultrastructural change of rat liver, which was not immediately fixed after separation from the animal, was observed under elect ron microscope. The results showed that the ultrastructure of hepatocytes still satisfied the needs for diagnostic electron microscopy if the isolated livers we re soaked in normal saline for 30 minutes, at room temperature, or placed in 4℃ refrigerator for 60 minutes, then they were fixed. After the isolated samples w ere put at room temperature for over 30 mintues, ultrastructure of hepatocytes w ere damaged so severely as to lose value for observation under electron microsco pe.
, 百拇医药
[Key words] electron microscopy; methodology; rats
超微结构保存的好坏与否是透射电镜样品制备成败的关键 。活体组织离体后由于缺血缺氧而自溶，使超微结构受到破坏，失去观察价值。故一般要求 组织离体后立即入固定液中固定，但有时由于条件限制，不能马上固定组织，如外科手术切 除标本。组织离体后究竟多长时间再固定，其超微结构才不失去观察价值对此，目前尚无 明确结论。笔者拟观察不同的取材时间对肝脏超微结构的影响，以确定肝脏能耐受多长的取 材时间。
1 材料与方法
1.1 标本与分组 麻醉状态下切取8只大白鼠的肝脏标本，组织均切成1m m×1mm×1mm，浸入下述4种溶液中固定。Ⅰ组：2.5%戊二醛溶液；Ⅱ组：生理盐水室 温30min(20℃)，再入2.5%戊二醛中；Ⅲ组：生理盐水室温60min，再入2.5%戊二醛中 ；Ⅳ组：生理盐水中4℃ 60min，再入2.5%戊二醛。
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1.2 超薄切片样品制备 所有标本于2.5%戊二醛固定4h后，PBS清洗；1 %锇酸后固定2h，梯度丙酮脱水；Epon812环氧树脂浸泡、包埋、聚合；用Reichert-Jung 型超薄切片机切取超薄切片；铀-铅双染色；H-600电子显微镜观察。
2 结 果
Ⅰ组肝细胞超微结构保存良好；Ⅱ组肝细胞线粒体肿胀，嵴破裂，核染色质聚边，但内质网、高尔基复合体尚保存较好；Ⅲ组肝细胞超微结构严重破坏，线粒体肿胀破裂，核染色质溶解消失，核糖体降解，内质网和高尔基复合体隐约可见(图1)；Ⅳ组超微结构的保存与第二组大致相当，细胞内容均有不同程度的丢失，但线粒体、内质网和高尔基体等膜性结构均清晰可辨，核糖体及核染色质均有一定程度的保存(图2)。
图1 严重破坏的肝细胞超微结构
, 百拇医药
线粒体肿胀破裂，核糖体降解，核染色质溶解(Ⅲ组)
Fig.1 Ultrastructure of hepatocytes w as severely damaged(Group Ⅲ).
图2 保存良好的肝细胞超微结构
线粒体、内质网、核糖体及胞核均清晰可辨(Ⅳ组)
Fig.2 The hepatocyte ultrastructure was i n a good state of preservation(Group Ⅳ).
3 讨 论
电镜样品制备均要求活体组织离体后立即入固定液中固定，才能使获得的超微结构真实反映 其生活时的状态。但在电镜诊断工作中，某些临床外科手术切除标本，由于当时条件的限制 ，未能及时固定。这类标本最多能放置多长时间再固定还具有观察价值是值得研究的问题。 笔者选择对缺血缺氧十分敏感，且富含蛋白水解酶，极易发生死后自溶的肝脏标本作为观察 对象，具有一定的代表性。本文结果表明肝脏离体后，浸泡于生理盐水中置室温30min， 或4℃冰箱60min后再固定，大部分细胞器保存尚好，基本可满足电镜诊断的要求。如置室 温60min其超微结构严重破坏，基本上失去观察价值。故对于那些缺血缺氧敏感且富含蛋 白水解酶的组织，离体后应立即浸入生理盐水中，且置室温的时间应小于30min，即使置4 ℃冰箱亦不应超过60min。否则难以满足电镜诊断的要求。对缺血缺氧不敏感，蛋白水解 酶含量低的组织(如胶原纤维，鳞状上皮等)，浸入固定液之前的时间可适当延长。
, 百拇医药
参考文献：
[1] 杭振镳，蔡文琴主编.电子显微镜术在临床医学的应用[M].重 庆：重庆出版社，1990：14-19.
[2] Mount SL, Schwarz JE, Taatjes DJ. Prolonged storage of fixative for elect ron microscopy: effects on tissue preservation for diagnostic specimens[J]. Ul trastruct Pathol, 1997,21(2):195-200.
[3] Morin F, Crevier C, Bouvier G, et al. A fixation procedure for ultras tructural investigation of synaptic connections in resected human cortex[J]. B rain Res Bull, 1997,44(2):205-210., http://www.100md.com
单位：井建华(电镜室 长沙 410078)
关键词：电子显微镜术；方法学；大鼠
湖南医科大学学报000240 [摘要] 观察大鼠肝脏离体后不同时间固定对肝细胞超微结 构的影响。结果显示：肝脏离体后浸泡于室温生理盐水中30min，或置4℃冰箱60min， 其超微结构仍可满足电镜诊断的要求；置室温超过30min，超微结构破坏严重，失去观察 价值。
[中图分类号] R329.4 R329.34 [文献标识码] A [文章编号] 1000-5625(2000)02-0205-02
Effect of prolonging time for sampling on preservation of
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ultra structure during the specimen preparation
JING Jian-hua
Laboratory of Electron Micrscopy, Hunan Medical University(Changsha 41007 8)
[Abstract] The ultrastructural change of rat liver, which was not immediately fixed after separation from the animal, was observed under elect ron microscope. The results showed that the ultrastructure of hepatocytes still satisfied the needs for diagnostic electron microscopy if the isolated livers we re soaked in normal saline for 30 minutes, at room temperature, or placed in 4℃ refrigerator for 60 minutes, then they were fixed. After the isolated samples w ere put at room temperature for over 30 mintues, ultrastructure of hepatocytes w ere damaged so severely as to lose value for observation under electron microsco pe.
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[Key words] electron microscopy; methodology; rats
超微结构保存的好坏与否是透射电镜样品制备成败的关键 。活体组织离体后由于缺血缺氧而自溶，使超微结构受到破坏，失去观察价值。故一般要求 组织离体后立即入固定液中固定，但有时由于条件限制，不能马上固定组织，如外科手术切 除标本。组织离体后究竟多长时间再固定，其超微结构才不失去观察价值对此，目前尚无 明确结论。笔者拟观察不同的取材时间对肝脏超微结构的影响，以确定肝脏能耐受多长的取 材时间。
1 材料与方法
1.1 标本与分组 麻醉状态下切取8只大白鼠的肝脏标本，组织均切成1m m×1mm×1mm，浸入下述4种溶液中固定。Ⅰ组：2.5%戊二醛溶液；Ⅱ组：生理盐水室 温30min(20℃)，再入2.5%戊二醛中；Ⅲ组：生理盐水室温60min，再入2.5%戊二醛中 ；Ⅳ组：生理盐水中4℃ 60min，再入2.5%戊二醛。
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1.2 超薄切片样品制备 所有标本于2.5%戊二醛固定4h后，PBS清洗；1 %锇酸后固定2h，梯度丙酮脱水；Epon812环氧树脂浸泡、包埋、聚合；用Reichert-Jung 型超薄切片机切取超薄切片；铀-铅双染色；H-600电子显微镜观察。
2 结 果
Ⅰ组肝细胞超微结构保存良好；Ⅱ组肝细胞线粒体肿胀，嵴破裂，核染色质聚边，但内质网、高尔基复合体尚保存较好；Ⅲ组肝细胞超微结构严重破坏，线粒体肿胀破裂，核染色质溶解消失，核糖体降解，内质网和高尔基复合体隐约可见(图1)；Ⅳ组超微结构的保存与第二组大致相当，细胞内容均有不同程度的丢失，但线粒体、内质网和高尔基体等膜性结构均清晰可辨，核糖体及核染色质均有一定程度的保存(图2)。
图1 严重破坏的肝细胞超微结构
, 百拇医药
线粒体肿胀破裂，核糖体降解，核染色质溶解(Ⅲ组)
Fig.1 Ultrastructure of hepatocytes w as severely damaged(Group Ⅲ).
图2 保存良好的肝细胞超微结构
线粒体、内质网、核糖体及胞核均清晰可辨(Ⅳ组)
Fig.2 The hepatocyte ultrastructure was i n a good state of preservation(Group Ⅳ).
3 讨 论
电镜样品制备均要求活体组织离体后立即入固定液中固定，才能使获得的超微结构真实反映 其生活时的状态。但在电镜诊断工作中，某些临床外科手术切除标本，由于当时条件的限制 ，未能及时固定。这类标本最多能放置多长时间再固定还具有观察价值是值得研究的问题。 笔者选择对缺血缺氧十分敏感，且富含蛋白水解酶，极易发生死后自溶的肝脏标本作为观察 对象，具有一定的代表性。本文结果表明肝脏离体后，浸泡于生理盐水中置室温30min， 或4℃冰箱60min后再固定，大部分细胞器保存尚好，基本可满足电镜诊断的要求。如置室 温60min其超微结构严重破坏，基本上失去观察价值。故对于那些缺血缺氧敏感且富含蛋 白水解酶的组织，离体后应立即浸入生理盐水中，且置室温的时间应小于30min，即使置4 ℃冰箱亦不应超过60min。否则难以满足电镜诊断的要求。对缺血缺氧不敏感，蛋白水解 酶含量低的组织(如胶原纤维，鳞状上皮等)，浸入固定液之前的时间可适当延长。
, 百拇医药
参考文献：
[1] 杭振镳，蔡文琴主编.电子显微镜术在临床医学的应用[M].重 庆：重庆出版社，1990：14-19.
[2] Mount SL, Schwarz JE, Taatjes DJ. Prolonged storage of fixative for elect ron microscopy: effects on tissue preservation for diagnostic specimens[J]. Ul trastruct Pathol, 1997,21(2):195-200.
[3] Morin F, Crevier C, Bouvier G, et al. A fixation procedure for ultras tructural investigation of synaptic connections in resected human cortex[J]. B rain Res Bull, 1997,44(2):205-210., http://www.100md.com