改良的免疫电镜胶体金技术
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作者：李少玲 张向红 郝晶 武玉玲 高英茂
单位：山东医科大学组织学与胚胎学教研室
关键词：胶体金；生物学标记；显微镜检查；免疫电子
山东医科大学学报000241
分类号：Q343.2+3 文献标识码：B
文章编号：1000-0496(2000)02-0224-01
过碘酸结合乙二胺四乙酸(EDTA)代替双氧水(H2O2)和氚核(Triton)X-100应用于免疫电镜超薄切片的处理，改善了免疫胶体金标记的条件，提高了免疫胶体金标记技术的敏感性和特异性。利用改良的方法对人肺癌细胞内谷胱甘肽硫转移酶胎盘型(GST-pi)和小鼠子宫内膜细胞内碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、层粘连蛋白(LN)和纤维粘连蛋白(FN)分别进行免疫金标记观察，结果良好。
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1材料与方法
1.1材料人肺癌组织由外科手术切除提供。小鼠阳性模型组织由本室提供。兔抗人GST-pi抗体，兔抗小鼠LN抗体、兔抗小鼠FN抗体和羊抗兔5nm胶体金抗体由武汉博土德生物工程有限公司提供。兔抗小鼠bFGF抗体由北京中山生物制品公司提供。过碘酸和EDTA由山东化学试剂公司提供。
1.2方法
1.2.1超薄切片按常规电镜制样方法。取材后的新鲜组织经戊二醛、锇酸固定(有特殊要求可不经锇酸)、乙醇脱水、环氧树脂Epon812包埋。包埋块修整后，切70～90mn的超薄切片，置于未展支持膜的镍网上。
1.2.2免疫染色
1.2.2.1用一小片聚乙烯薄膜纸(每完成一步更换一片)为工作台，放人湿盒内，向膜上滴加8%过碘酸钠水溶液，使其成滴。镍网带有切片的面悬浮在液滴上，室温5～25min(视切片厚度及室温调节时间)，双蒸水洗3次，每次5min。0.01mol/LPBS(pH7.2)漂洗3次，每次5min。
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1.2.2.2滴加1：10稀释的正常羊血清，室温20min。
1.2.2.3分别滴加1：50稀释的一抗(兔抗人GST-pi抗体)。l：100稀释的一抗(兔抗小鼠的LN，FN和bFGF抗体)。阴性对照用PBS代替，4℃冰箱过夜。用0.01mol/LPBS(pH7.2，含1%BSA，0.01%EDTA)漂洗2次，每次5min。再用0.01mol/LPBS(pH7.2或9.0)漂洗5次，每次8min。
1.2.2.4滴加1：10稀释的二抗(直径5nm胶体金标记的羊抗兔IgG)，室温lh。用0.01mol/LPBS(pH7.2或9.0)漂洗5次，每次5min。双蒸水洗3次，每次5min。防尘干燥备用。
1.2.3电镜常规染色，干燥。用H-800透射电镜观察，加速电压80～100KV拍照。
2结果
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电镜下见金颗粒呈球形，电子密度高，清晰，背景干净，超微结构保存良好。阴性对照，电镜下未见金颗粒。
3讨论
3.1常规免疫电镜胶体金标记法是用不同浓度的H2O2来蚀刻超薄切片。目的是使组织细胞内的抗原从包埋剂中裸露出来，但蚀刻包埋剂时无法使组织细胞内抗原和超微结构不受H2O2损伤。尤其是当细胞内的待测抗原量少时，会造成肢体金标记不佳或标记失败。过碘酸在细胞生物学中作为固定剂使用[1～2]。利用过碘酸代替H2O2蚀刻超薄切片，对人肺癌细胞和小鼠子宫内膜细胞内的四种抗原进行5nm胶体金标记试验，成功率和反复性良好，这一结果符合过碘酸具有稳定抗原的特性。其作用是过碘酸可以有选择性地氧化抗原的糖类部位，保留抗原性存在的部位，提高胶体金标记的特异性。过碘酸与H2O2的区别还在于氧化作用。H2O2不但氧化组织结构固有的醛基，对作用后新形成的醛基有继续氧化的作用；过碘酸则对新形成的醛基不再氧化。我们改用过碘酸后不但提高了标记的成功率而且超微结构保存良好。
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3.2常规胶体金标记技术中，为了使金探针容易透过细胞膜标记细胞内抗原，常使用TritonX-100。但TritonX-100极易使细胞膜受到破坏[3]。在组织学技术中EDTA作为脱钙剂使用[4]。我们利用EDTA代替TritonX-100使5nm的金探针准确地标记在细胞内抗原存在的部位，电镜下膜结构保存良好。这结果说明EDTA不但作为非离子去污剂稳定免疫复合物，而且与组织内的离子形成的可溶性非离子化合物是可逆的，应用在免疫胶体金标记技术中，不但可增加胶体金标记的敏感性，还能使膜结构不受破坏。
参考文献：
[1]抗振镳，蔡文琴.电子显微镜术在临床医学的应用[M]重庆：重庆出版社，1988.8
[2]汪德耀.细胞生物学实验指导.北京：人民教育出版社，1981.12
[3]刘彦仿.免疫组织化学[M].北京：人民卫生出版社，1989.4
[4]杜卓民.实用组织学技术[M].北京：人民卫生出版社，1998.4
收稿日期：1999-06-06, http://www.100md.com
单位：山东医科大学组织学与胚胎学教研室
关键词：胶体金；生物学标记；显微镜检查；免疫电子
山东医科大学学报000241
分类号：Q343.2+3 文献标识码：B
文章编号：1000-0496(2000)02-0224-01
过碘酸结合乙二胺四乙酸(EDTA)代替双氧水(H2O2)和氚核(Triton)X-100应用于免疫电镜超薄切片的处理，改善了免疫胶体金标记的条件，提高了免疫胶体金标记技术的敏感性和特异性。利用改良的方法对人肺癌细胞内谷胱甘肽硫转移酶胎盘型(GST-pi)和小鼠子宫内膜细胞内碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、层粘连蛋白(LN)和纤维粘连蛋白(FN)分别进行免疫金标记观察，结果良好。
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1材料与方法
1.1材料人肺癌组织由外科手术切除提供。小鼠阳性模型组织由本室提供。兔抗人GST-pi抗体，兔抗小鼠LN抗体、兔抗小鼠FN抗体和羊抗兔5nm胶体金抗体由武汉博土德生物工程有限公司提供。兔抗小鼠bFGF抗体由北京中山生物制品公司提供。过碘酸和EDTA由山东化学试剂公司提供。
1.2方法
1.2.1超薄切片按常规电镜制样方法。取材后的新鲜组织经戊二醛、锇酸固定(有特殊要求可不经锇酸)、乙醇脱水、环氧树脂Epon812包埋。包埋块修整后，切70～90mn的超薄切片，置于未展支持膜的镍网上。
1.2.2免疫染色
1.2.2.1用一小片聚乙烯薄膜纸(每完成一步更换一片)为工作台，放人湿盒内，向膜上滴加8%过碘酸钠水溶液，使其成滴。镍网带有切片的面悬浮在液滴上，室温5～25min(视切片厚度及室温调节时间)，双蒸水洗3次，每次5min。0.01mol/LPBS(pH7.2)漂洗3次，每次5min。
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1.2.2.2滴加1：10稀释的正常羊血清，室温20min。
1.2.2.3分别滴加1：50稀释的一抗(兔抗人GST-pi抗体)。l：100稀释的一抗(兔抗小鼠的LN，FN和bFGF抗体)。阴性对照用PBS代替，4℃冰箱过夜。用0.01mol/LPBS(pH7.2，含1%BSA，0.01%EDTA)漂洗2次，每次5min。再用0.01mol/LPBS(pH7.2或9.0)漂洗5次，每次8min。
1.2.2.4滴加1：10稀释的二抗(直径5nm胶体金标记的羊抗兔IgG)，室温lh。用0.01mol/LPBS(pH7.2或9.0)漂洗5次，每次5min。双蒸水洗3次，每次5min。防尘干燥备用。
1.2.3电镜常规染色，干燥。用H-800透射电镜观察，加速电压80～100KV拍照。
2结果
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电镜下见金颗粒呈球形，电子密度高，清晰，背景干净，超微结构保存良好。阴性对照，电镜下未见金颗粒。
3讨论
3.1常规免疫电镜胶体金标记法是用不同浓度的H2O2来蚀刻超薄切片。目的是使组织细胞内的抗原从包埋剂中裸露出来，但蚀刻包埋剂时无法使组织细胞内抗原和超微结构不受H2O2损伤。尤其是当细胞内的待测抗原量少时，会造成肢体金标记不佳或标记失败。过碘酸在细胞生物学中作为固定剂使用[1～2]。利用过碘酸代替H2O2蚀刻超薄切片，对人肺癌细胞和小鼠子宫内膜细胞内的四种抗原进行5nm胶体金标记试验，成功率和反复性良好，这一结果符合过碘酸具有稳定抗原的特性。其作用是过碘酸可以有选择性地氧化抗原的糖类部位，保留抗原性存在的部位，提高胶体金标记的特异性。过碘酸与H2O2的区别还在于氧化作用。H2O2不但氧化组织结构固有的醛基，对作用后新形成的醛基有继续氧化的作用；过碘酸则对新形成的醛基不再氧化。我们改用过碘酸后不但提高了标记的成功率而且超微结构保存良好。
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3.2常规胶体金标记技术中，为了使金探针容易透过细胞膜标记细胞内抗原，常使用TritonX-100。但TritonX-100极易使细胞膜受到破坏[3]。在组织学技术中EDTA作为脱钙剂使用[4]。我们利用EDTA代替TritonX-100使5nm的金探针准确地标记在细胞内抗原存在的部位，电镜下膜结构保存良好。这结果说明EDTA不但作为非离子去污剂稳定免疫复合物，而且与组织内的离子形成的可溶性非离子化合物是可逆的，应用在免疫胶体金标记技术中，不但可增加胶体金标记的敏感性，还能使膜结构不受破坏。
参考文献：
[1]抗振镳，蔡文琴.电子显微镜术在临床医学的应用[M]重庆：重庆出版社，1988.8
[2]汪德耀.细胞生物学实验指导.北京：人民教育出版社，1981.12
[3]刘彦仿.免疫组织化学[M].北京：人民卫生出版社，1989.4
[4]杜卓民.实用组织学技术[M].北京：人民卫生出版社，1998.4
收稿日期：1999-06-06, http://www.100md.com