人羊膜FL细胞CROC-1基因表达反义阻断后的生物学特性研究
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作者：陈建明 余应年
单位：浙江大学医学院病理生理学教研究，浙江 杭州 310031
关键词：
中国病理生理杂志0010173
目的：CROC-1是人细胞中新发现的基因，其酵母同源基因MMS2是一个抗增变基因。本研究用反义策略建立CROC-1基因表达阻断细胞系，分析CROC-1基因在细胞生理活动中的作用。方法：1.CROC-1反义RNA表达质粒构建：用ACCI酶从pBS-Croc-1B上切出840 bp长cDNA片断，两端填平后分别连上Sal I Linker, Sal I酶切后将此目的片断连到改建的地塞米松诱导表达载体多克隆位点的SalI切点上，通过酶切图谱分析筛选CROC-1反义RNA表达重组子；2.细胞转染及筛选：反向表达重组子用改良的磷酸钙法转染入FL细胞，通过G418筛选抗性集落，同时转染空质粒建立质粒对照细胞系；3.细胞生长速率测定：将FL-CROC-1及对照FL、FL-MAMneo细胞分别以3×104 cells/孔种于24孔板，诱导培养24 h后第2 d开始每天计数，共计6 d；4.系列浓度MNNG及MMS毒性测定：将3种细胞分别以2×104 cells/孔种于24孔板，诱导培养过夜后第2 d分别进行系列浓度MNNG及MMS处理，处理后继续培养4 d再行细胞计数；5.自发性非定标性变率测定：3种细胞分别以0.5-1.0×106/瓶接种培养，诱导培养24 h后用DEAE-Dextran法分别转染穿梭质粒pZ189，继续培养48 h后用Hirt法提取细胞内质粒pZ189，DpnI酶切后转化指示菌并计数菌落。结果：构建好的重组质粒经NheI酶切其中的一个出现228 bp及9 kb二条带，说明此质粒就是CROC-1反义RNA表达重组子；反向表达重组子及空质粒分别转染FL细胞后筛选培养3周各得到10多个抗性集落，进一步分别扩大培养成系；研究发现地塞米松诱导后FL-CROC-1细胞系(TD=2.85)的生长速率明显慢于对照FL-MAMneo(TD＝1.97)及FL(TD＝1.96)细胞系(P<0.05)，毒性试验显示FL-CROC-1细胞系对MNNG的敏感性较对照FL-MAMneo及FL细胞的分别强3.6倍及3.1倍(IC50，0.50 μmol/L versus 1.80 μmol/L,and versus 1.53 μmol/L)、对MMS的敏感性则分别强3.2倍及3.5倍(IC50，28.4 μmol/L versus 90.2 μmol/L,and versus 99.2 μmol/L)，但FL-CROC-1细胞系(11/8661)中自发性非定标性突变率与对照FL-MAMneo(5/7062)及FL(2/4109)细胞的相比未发现有明显差异(P>0.05)。结论：上述结果提示CROC-1基因可能在细胞增殖中起正调控作用，并可能参与DNA修复过程，但它与人细胞内自发性突变的形成无关。
国家自然科学基金重点项目(39830210)资助, http://www.100md.com
单位：浙江大学医学院病理生理学教研究，浙江 杭州 310031
关键词：
中国病理生理杂志0010173
目的：CROC-1是人细胞中新发现的基因，其酵母同源基因MMS2是一个抗增变基因。本研究用反义策略建立CROC-1基因表达阻断细胞系，分析CROC-1基因在细胞生理活动中的作用。方法：1.CROC-1反义RNA表达质粒构建：用ACCI酶从pBS-Croc-1B上切出840 bp长cDNA片断，两端填平后分别连上Sal I Linker, Sal I酶切后将此目的片断连到改建的地塞米松诱导表达载体多克隆位点的SalI切点上，通过酶切图谱分析筛选CROC-1反义RNA表达重组子；2.细胞转染及筛选：反向表达重组子用改良的磷酸钙法转染入FL细胞，通过G418筛选抗性集落，同时转染空质粒建立质粒对照细胞系；3.细胞生长速率测定：将FL-CROC-1及对照FL、FL-MAMneo细胞分别以3×104 cells/孔种于24孔板，诱导培养24 h后第2 d开始每天计数，共计6 d；4.系列浓度MNNG及MMS毒性测定：将3种细胞分别以2×104 cells/孔种于24孔板，诱导培养过夜后第2 d分别进行系列浓度MNNG及MMS处理，处理后继续培养4 d再行细胞计数；5.自发性非定标性变率测定：3种细胞分别以0.5-1.0×106/瓶接种培养，诱导培养24 h后用DEAE-Dextran法分别转染穿梭质粒pZ189，继续培养48 h后用Hirt法提取细胞内质粒pZ189，DpnI酶切后转化指示菌并计数菌落。结果：构建好的重组质粒经NheI酶切其中的一个出现228 bp及9 kb二条带，说明此质粒就是CROC-1反义RNA表达重组子；反向表达重组子及空质粒分别转染FL细胞后筛选培养3周各得到10多个抗性集落，进一步分别扩大培养成系；研究发现地塞米松诱导后FL-CROC-1细胞系(TD=2.85)的生长速率明显慢于对照FL-MAMneo(TD＝1.97)及FL(TD＝1.96)细胞系(P<0.05)，毒性试验显示FL-CROC-1细胞系对MNNG的敏感性较对照FL-MAMneo及FL细胞的分别强3.6倍及3.1倍(IC50，0.50 μmol/L versus 1.80 μmol/L,and versus 1.53 μmol/L)、对MMS的敏感性则分别强3.2倍及3.5倍(IC50，28.4 μmol/L versus 90.2 μmol/L,and versus 99.2 μmol/L)，但FL-CROC-1细胞系(11/8661)中自发性非定标性突变率与对照FL-MAMneo(5/7062)及FL(2/4109)细胞的相比未发现有明显差异(P>0.05)。结论：上述结果提示CROC-1基因可能在细胞增殖中起正调控作用，并可能参与DNA修复过程，但它与人细胞内自发性突变的形成无关。
国家自然科学基金重点项目(39830210)资助, http://www.100md.com