体外抗癌药敏试验HTCA和MTT法对人肺癌细胞测定的对比性研究
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作者：秦治明 李良彬 温剑虎 吴庆琛 杜铭 葛明建
单位：(重庆医科大学附一院胸外科 400016)
关键词：人肺癌细胞株；抗癌药敏试验；HTCA；MTT法
重庆医学000312 摘 要 目的：测定人肺癌细胞株SK-LC-6(大细胞癌)和SK-LC-7(腺癌)药物CBDCA、5-Fu及蒽环类的反应曲线。方法：本研究用体外抗癌药敏试验HTCA和MTT法。结果：在HTCA中，人肺癌细胞株的克隆形成率PE值分为0.4580和0.9300，表明HTCA适于对肺癌细胞进行培养、研究。没类型瘤细胞在HTCA中PE值不一样，揭示其肿瘤干细胞的生长特性不一样。结果亦表明：1、不同类型肿瘤细胞对同一药物反应性不同显示化疗个体化的必要性。2、同一类型肿瘤细胞对不同药物反应性不一，从而揭示抗癌药敏试验用于临床预测肺癌患者对抗癌药物敏感或耐药是可取的。3、同一类型肺癌对同类抗癌药物反应性相似，通过比较其量效关系曲线可筛选出有效抗癌新药。结论：通过两种方法的对比分析，显示两种方法有较好的相关性，HTCA测试结果稳定、准确，但其耗费大，技术要求高，而MTT法操作简单快速、标本可测率高，便于推广，可望为肿瘤患者的治疗提供一定指导。
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Compared Study Between Two Anticancer Drug Sensitivity Assays(HICA and
MTT) for Testing chemostensitivity of Lung Cancers
Qin Zhiming
(Department of Cardiothoracic Surgery, the first affiliated Hospital, Chongqing
University of Medical Science, Chongqing 400016)
Abstract Objecttive: To assay the drug sensitivity of SK-LC-6 and SK-LC-7 cell lines to different chemotherapeutic agents.Methods: Two human tumor cell Lines, SK-LC-6 (large cell lung cancer) and SK-LC-7(lung adenocarcinoma) were tested by HICA and MTT assays. Results:1. PE of the cell lines was high (0.4580%,0.9300%).2.Difference of drug sensitivity was found in SK-LC-7 cell line to 3 different chemotherapeutic agents(EDR、CBDCA、5Fu) or in both to the same agent (EDR). Conclusion: The results indicated that anticancer drug sensitivity assay in vitro is the experimental basis for the choice of treatment for individual paients. The MTT assay in rapid, simple and easy for clinical application. Both methods may be abopted to find and evaluate the new anticancer drugs.
, 百拇医药
Key words:Human Lung tumor cell lines Chemosensitivity test MTT assay clonogenic assay
随着肺癌发生率的逐年上升，作为全身治疗的化疗是其综合治疗中必可少的重要手段之一，由于其对抗癌药物的多重耐药性(MDR)及有效抗癌新药的缺乏，常致临床疗效不佳或失败。因此肿瘤化疗研究的热点是开发人类肿瘤药物治疗敏感性的准确预测方法，近年来，在这方面已取得一定进展，为此我们引起了人癌干细胞克隆测定法(Human Tumor Clonogenic Assay,HTCA)，用人肺癌细胞株SK-LC-6、SK-LC-7探讨了HTCA的建立方法，并与四唑兰显色法(MTT法)[1]进行了对比性研究，现将结果报告如下：
1 材料与方法
1.1 材料
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1.1.1 肿瘤细胞株 人肺癌细胞株SK-LC-6(大细胞型)和SK-LD-7(腺癌)，均来自美国纪念斯隆—凯特林癌症中心。
1.1.2 琼脂粉(日本，上海化学试剂采购站)。
1.1.3 培养基：①不完全培养液：RPMI-1640(美，GIBCO)②完全培养液：RPMI-1640内含10%灭活新生小牛血清(华西生物制品厂)、青霉素10万u/L和链霉素0.1g/L。③McCoy's5A培养液(美，GIBCO)
1.1.4 35mm玻璃培养血(江苏三宝玻璃仪器厂)
1.1.5 抗癌药物 柔红霉素(DNR)、阿霉素(ADR)、表阿霉素(EDR)、米托葱醌(Mitoxantrone)、卡铂(CBDCA)、5-氟脲嘧啶(5-Fu)。
, 百拇医药 1.1.6 细胞培养常用仪器及试剂。
1.2 方法
1.2.1 单个肿瘤细胞悬液的制备 将SK-LD-6、SK-LD-7常规培养于完全培养液中，实验前将对数生长期细胞经胰酶消化，RPMI-1640洗涤后，用完全培养液制成单细胞悬液备用。
1.2.2 3%琼脂的配制 加30g琼脂粉于1000ml双蒸水中，搅拌均匀并煮沸至清亮，冷却后切成2cm2大小，双蒸水漂洗(1次/天)，分装于三角烧瓶内，高压灭菌后4℃冷藏，用前加热至琼脂溶化清亮，置50～55℃水浴箱备用。
1.2.3 抗癌药物的配制 均用无菌生理盐水稀释浓度在0.01～100ug/ml范围内，采用持续染药方法。
1.2.4 人癌干细胞克隆生成测定(HTCA)方法
, 百拇医药
我们采用的是Salmon氏法(即双层琼脂法将直径为35mm培养血中加入0.5%琼脂McCOy's5A培养液，内含丰富营养成分做为底层(即滋养层)上层双称接种层，含瘤细胞数1×104/日。肿瘤细胞接种后，将培养血置于37℃，饱和湿度7%的二氧化碳培养箱中培养7～21天，于倒置显微镜下观察并计数细胞克隆，通常将≥50个细胞的团块视为一个克隆，最终克隆数按3个平血计数的平均值为准，计算克隆形成率(Plating efficiency,PE)，一般≥5个克隆/血视为培养成功，≥30个克隆/血方能进行药敏分析。
PE＝克隆生长数/每平血接种细胞数×100%本实验设①肿瘤细胞对照组：加生理盐水。②阳性对照组：加Lectin。③不同抗癌药物组：不同浓度药物。瘤细胞克隆存活率＝
1.2.5 四唑兰显色法(MTT法)
, 百拇医药
调整单细胞浓度1-4×104/ml，将瘤细胞接种于96孔培养极内，按常规方法，3天后测定每孔光密度值(CD值)计算瘤细胞存活率。
药敏判定标准 存活率<50%为敏感；
存活率≥50%为耐药；
2 结果
2.1 SK-LD-6、SK-LD-7在HTCA双层琼脂系统中生长情况见下表： 细胞类型
培养时间(天)
平均PE值(%)
SK-LD-6(大细胞癌)
, 百拇医药
11
0.4580
SK-LD-7(腺癌)
12
0.9300
2.2 HTCA与MTT法平行测定SK-LD-6、SK-LD-7在同一类抗癌药物(蒽环类)及不同类抗癌药物(浓度为0.01-100ug/ml)作用下的量效关系曲线(如图1，2)
图1 表示SK-LD-7细胞株对不同类抗癌药物表阿霉、卡铂、5-氟尿嘧啶、作用下两法测得的量效关系曲线。
○表阿霉素 □阿霉素
, 百拇医药
△米托蒽醌 ●录红霉素
图2 MTT法测得的SK-LC-6细胞株对四种蒽环类抗癌药物的反应曲线。
3 讨论
3.1 HTCA测定理论及临床意义
HTCA的理论基础是肿瘤干细胞学说[2]。肿瘤干细胞指肿瘤群体内具自身敏殖并能分化产生子化细胞双重生物学特征的细胞，它对肿瘤的发生、发展起决定作用，也是肿瘤复发的根源。1977年[3]Hamburger和Salmon创立了HTCA双层琼脂法，可用之对肿瘤干细胞者直接测定，许多研究证明了HTCA药敏测定结果与临床疗效有效好相关性[4]，总结得出真阳性率(实验结果敏感同时治疗有效的符合率)达60～80%，真阴性率(实验结果耐药、治疗无效的符合率为90～100%，一直被许多学者在探索抗癌药敏新方法中视为“黄金指标”。
, 百拇医药
我们利用HTCA系统培养人肺癌细胞，从表中显示其生长良好，表明HTCA适于对肺癌细胞进行培养、研究。不同类型瘤细胞如SK-LC-6(大细胞癌)和SK-LC-7(腺癌)在HTCA中PE值不一样，揭示不同类型肿瘤干细胞的生长特性不一，以便我们应用HTCA深入进行肿瘤细胞的生物学研究。
3.2 HTCA的应用评价
3.2.1 不同类型肿瘤细胞对同一药物的反应性不同，本实验结果显示没类型肺癌(大细胞癌SK-LC-6和SK-LC-7腺癌)采用同一种方法对同一药物的敏感性不同(见图1、图2)表明化疗个体化的必要性。
3.2.2 同一类型肿瘤细胞对不同药物反应性不一。
同一肺癌细胞株(SK-LC-7)对不同药物(EDR、CBDA及5-Fu)的反应性不相同(图1)从而揭示抗癌药敏试验用于临床上预测肺癌患者对抗癌药物的敏感或耐药是可取的。
, 百拇医药
3.2.3 同一类型肺癌对同类抗癌药物及应性相似
HTCA的另一个重要用途是抗癌新药的开发我们用之测SK-LC-6对蒽环类抗癌药物DNR、ADR、EDR及米托蒽醌系列浓度作用下的量放关系曲线(图2)其形态酷似，由此揭示应用抗癌药敏试验，通过比较可筛选出有效的抗癌新药。
3.3 HTCA和MTT法的对比分析
通过比较SK-LC-6和SK-LC-7在抗癌药物系列浓度(0.01～100ug/ml)作用下显示的量效关系表明两种方法有较好的相关性，与国外学者所报道的一致。HTCA系统下瘤细胞对抗癌药物的反应较敏感，揭示由不同方法学进行的抗癌药敏试验应采用不同的抗癌药物浓度。
HTCA设立双层琼脂培养系统，上层提供癌细胞生长良好环境，下层可防止细胞贴壁和成纤维细胞生长，且实验结果稳定、准确，但其耗费大、技术条件要求高，一般的实验室不易建立。MTT法操作简单、快速、标本可测率高，便于推广等优点，但其灵敏度及可靠性均逊于HTCA，若能较好掌握此法，排除非瘤细胞干扰不失为一种在一般单位易于建立、应用的可行检测方法，为肿瘤患者的治疗提供一定指导。
, 百拇医药
参考文献
1，秦治明，张泽普，骆云鹏，等.43例胸部恶性肿瘤的抗癌药敏试验(MTT法)测试结果分析.重庆医科大学学报，1994，19(1)：36
2，Selby.A critical appraisal if the human tumor stem cell assay.New Engl J Med,1983,308：129
3，Hamburger A W,Salmon S E Primary bioassay of human tumour stem cells. Science,1997,1197：461
4，Carney D N.Positive correlation between histologic tumor involvement and generation of tumor cell colonies in agarose in specimens taken directly from pautients with small cell carcinoma of the lung. Cancer Res,1980,(40)：1820, 百拇医药
单位：(重庆医科大学附一院胸外科 400016)
关键词：人肺癌细胞株；抗癌药敏试验；HTCA；MTT法
重庆医学000312 摘 要 目的：测定人肺癌细胞株SK-LC-6(大细胞癌)和SK-LC-7(腺癌)药物CBDCA、5-Fu及蒽环类的反应曲线。方法：本研究用体外抗癌药敏试验HTCA和MTT法。结果：在HTCA中，人肺癌细胞株的克隆形成率PE值分为0.4580和0.9300，表明HTCA适于对肺癌细胞进行培养、研究。没类型瘤细胞在HTCA中PE值不一样，揭示其肿瘤干细胞的生长特性不一样。结果亦表明：1、不同类型肿瘤细胞对同一药物反应性不同显示化疗个体化的必要性。2、同一类型肿瘤细胞对不同药物反应性不一，从而揭示抗癌药敏试验用于临床预测肺癌患者对抗癌药物敏感或耐药是可取的。3、同一类型肺癌对同类抗癌药物反应性相似，通过比较其量效关系曲线可筛选出有效抗癌新药。结论：通过两种方法的对比分析，显示两种方法有较好的相关性，HTCA测试结果稳定、准确，但其耗费大，技术要求高，而MTT法操作简单快速、标本可测率高，便于推广，可望为肿瘤患者的治疗提供一定指导。
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Compared Study Between Two Anticancer Drug Sensitivity Assays(HICA and
MTT) for Testing chemostensitivity of Lung Cancers
Qin Zhiming
(Department of Cardiothoracic Surgery, the first affiliated Hospital, Chongqing
University of Medical Science, Chongqing 400016)
Abstract Objecttive: To assay the drug sensitivity of SK-LC-6 and SK-LC-7 cell lines to different chemotherapeutic agents.Methods: Two human tumor cell Lines, SK-LC-6 (large cell lung cancer) and SK-LC-7(lung adenocarcinoma) were tested by HICA and MTT assays. Results:1. PE of the cell lines was high (0.4580%,0.9300%).2.Difference of drug sensitivity was found in SK-LC-7 cell line to 3 different chemotherapeutic agents(EDR、CBDCA、5Fu) or in both to the same agent (EDR). Conclusion: The results indicated that anticancer drug sensitivity assay in vitro is the experimental basis for the choice of treatment for individual paients. The MTT assay in rapid, simple and easy for clinical application. Both methods may be abopted to find and evaluate the new anticancer drugs.
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Key words:Human Lung tumor cell lines Chemosensitivity test MTT assay clonogenic assay
随着肺癌发生率的逐年上升，作为全身治疗的化疗是其综合治疗中必可少的重要手段之一，由于其对抗癌药物的多重耐药性(MDR)及有效抗癌新药的缺乏，常致临床疗效不佳或失败。因此肿瘤化疗研究的热点是开发人类肿瘤药物治疗敏感性的准确预测方法，近年来，在这方面已取得一定进展，为此我们引起了人癌干细胞克隆测定法(Human Tumor Clonogenic Assay,HTCA)，用人肺癌细胞株SK-LC-6、SK-LC-7探讨了HTCA的建立方法，并与四唑兰显色法(MTT法)[1]进行了对比性研究，现将结果报告如下：
1 材料与方法
1.1 材料
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1.1.1 肿瘤细胞株 人肺癌细胞株SK-LC-6(大细胞型)和SK-LD-7(腺癌)，均来自美国纪念斯隆—凯特林癌症中心。
1.1.2 琼脂粉(日本，上海化学试剂采购站)。
1.1.3 培养基：①不完全培养液：RPMI-1640(美，GIBCO)②完全培养液：RPMI-1640内含10%灭活新生小牛血清(华西生物制品厂)、青霉素10万u/L和链霉素0.1g/L。③McCoy's5A培养液(美，GIBCO)
1.1.4 35mm玻璃培养血(江苏三宝玻璃仪器厂)
1.1.5 抗癌药物 柔红霉素(DNR)、阿霉素(ADR)、表阿霉素(EDR)、米托葱醌(Mitoxantrone)、卡铂(CBDCA)、5-氟脲嘧啶(5-Fu)。
, 百拇医药 1.1.6 细胞培养常用仪器及试剂。
1.2 方法
1.2.1 单个肿瘤细胞悬液的制备 将SK-LD-6、SK-LD-7常规培养于完全培养液中，实验前将对数生长期细胞经胰酶消化，RPMI-1640洗涤后，用完全培养液制成单细胞悬液备用。
1.2.2 3%琼脂的配制 加30g琼脂粉于1000ml双蒸水中，搅拌均匀并煮沸至清亮，冷却后切成2cm2大小，双蒸水漂洗(1次/天)，分装于三角烧瓶内，高压灭菌后4℃冷藏，用前加热至琼脂溶化清亮，置50～55℃水浴箱备用。
1.2.3 抗癌药物的配制 均用无菌生理盐水稀释浓度在0.01～100ug/ml范围内，采用持续染药方法。
1.2.4 人癌干细胞克隆生成测定(HTCA)方法
, 百拇医药
我们采用的是Salmon氏法(即双层琼脂法将直径为35mm培养血中加入0.5%琼脂McCOy's5A培养液，内含丰富营养成分做为底层(即滋养层)上层双称接种层，含瘤细胞数1×104/日。肿瘤细胞接种后，将培养血置于37℃，饱和湿度7%的二氧化碳培养箱中培养7～21天，于倒置显微镜下观察并计数细胞克隆，通常将≥50个细胞的团块视为一个克隆，最终克隆数按3个平血计数的平均值为准，计算克隆形成率(Plating efficiency,PE)，一般≥5个克隆/血视为培养成功，≥30个克隆/血方能进行药敏分析。
PE＝克隆生长数/每平血接种细胞数×100%本实验设①肿瘤细胞对照组：加生理盐水。②阳性对照组：加Lectin。③不同抗癌药物组：不同浓度药物。瘤细胞克隆存活率＝
1.2.5 四唑兰显色法(MTT法)
, 百拇医药
调整单细胞浓度1-4×104/ml，将瘤细胞接种于96孔培养极内，按常规方法，3天后测定每孔光密度值(CD值)计算瘤细胞存活率。
药敏判定标准 存活率<50%为敏感；
存活率≥50%为耐药；
2 结果
2.1 SK-LD-6、SK-LD-7在HTCA双层琼脂系统中生长情况见下表： 细胞类型
培养时间(天)
平均PE值(%)
SK-LD-6(大细胞癌)
, 百拇医药
11
0.4580
SK-LD-7(腺癌)
12
0.9300
2.2 HTCA与MTT法平行测定SK-LD-6、SK-LD-7在同一类抗癌药物(蒽环类)及不同类抗癌药物(浓度为0.01-100ug/ml)作用下的量效关系曲线(如图1，2)
图1 表示SK-LD-7细胞株对不同类抗癌药物表阿霉、卡铂、5-氟尿嘧啶、作用下两法测得的量效关系曲线。
○表阿霉素 □阿霉素
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△米托蒽醌 ●录红霉素
图2 MTT法测得的SK-LC-6细胞株对四种蒽环类抗癌药物的反应曲线。
3 讨论
3.1 HTCA测定理论及临床意义
HTCA的理论基础是肿瘤干细胞学说[2]。肿瘤干细胞指肿瘤群体内具自身敏殖并能分化产生子化细胞双重生物学特征的细胞，它对肿瘤的发生、发展起决定作用，也是肿瘤复发的根源。1977年[3]Hamburger和Salmon创立了HTCA双层琼脂法，可用之对肿瘤干细胞者直接测定，许多研究证明了HTCA药敏测定结果与临床疗效有效好相关性[4]，总结得出真阳性率(实验结果敏感同时治疗有效的符合率)达60～80%，真阴性率(实验结果耐药、治疗无效的符合率为90～100%，一直被许多学者在探索抗癌药敏新方法中视为“黄金指标”。
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我们利用HTCA系统培养人肺癌细胞，从表中显示其生长良好，表明HTCA适于对肺癌细胞进行培养、研究。不同类型瘤细胞如SK-LC-6(大细胞癌)和SK-LC-7(腺癌)在HTCA中PE值不一样，揭示不同类型肿瘤干细胞的生长特性不一，以便我们应用HTCA深入进行肿瘤细胞的生物学研究。
3.2 HTCA的应用评价
3.2.1 不同类型肿瘤细胞对同一药物的反应性不同，本实验结果显示没类型肺癌(大细胞癌SK-LC-6和SK-LC-7腺癌)采用同一种方法对同一药物的敏感性不同(见图1、图2)表明化疗个体化的必要性。
3.2.2 同一类型肿瘤细胞对不同药物反应性不一。
同一肺癌细胞株(SK-LC-7)对不同药物(EDR、CBDA及5-Fu)的反应性不相同(图1)从而揭示抗癌药敏试验用于临床上预测肺癌患者对抗癌药物的敏感或耐药是可取的。
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3.2.3 同一类型肺癌对同类抗癌药物及应性相似
HTCA的另一个重要用途是抗癌新药的开发我们用之测SK-LC-6对蒽环类抗癌药物DNR、ADR、EDR及米托蒽醌系列浓度作用下的量放关系曲线(图2)其形态酷似，由此揭示应用抗癌药敏试验，通过比较可筛选出有效的抗癌新药。
3.3 HTCA和MTT法的对比分析
通过比较SK-LC-6和SK-LC-7在抗癌药物系列浓度(0.01～100ug/ml)作用下显示的量效关系表明两种方法有较好的相关性，与国外学者所报道的一致。HTCA系统下瘤细胞对抗癌药物的反应较敏感，揭示由不同方法学进行的抗癌药敏试验应采用不同的抗癌药物浓度。
HTCA设立双层琼脂培养系统，上层提供癌细胞生长良好环境，下层可防止细胞贴壁和成纤维细胞生长，且实验结果稳定、准确，但其耗费大、技术条件要求高，一般的实验室不易建立。MTT法操作简单、快速、标本可测率高，便于推广等优点，但其灵敏度及可靠性均逊于HTCA，若能较好掌握此法，排除非瘤细胞干扰不失为一种在一般单位易于建立、应用的可行检测方法，为肿瘤患者的治疗提供一定指导。
, 百拇医药
参考文献
1，秦治明，张泽普，骆云鹏，等.43例胸部恶性肿瘤的抗癌药敏试验(MTT法)测试结果分析.重庆医科大学学报，1994，19(1)：36
2，Selby.A critical appraisal if the human tumor stem cell assay.New Engl J Med,1983,308：129
3，Hamburger A W,Salmon S E Primary bioassay of human tumour stem cells. Science,1997,1197：461
4，Carney D N.Positive correlation between histologic tumor involvement and generation of tumor cell colonies in agarose in specimens taken directly from pautients with small cell carcinoma of the lung. Cancer Res,1980,(40)：1820, 百拇医药