两种抗癌药物敏感性试验方法的比较
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作者：刘枫春 陈肖嘉 王金珠 盛瑞楠
单位：刘枫春 陈肖嘉 王金珠 盛瑞楠(北京市结核病胸部肿瘤研究所胸外科 101149)
关键词：
中国肺癌杂志000522 【中图分类号】R734.2；R979.1
肺癌化疗药物敏感性的体外预测是肺癌化疗个体化的基础，近年来以指导临床肺癌化疗个体化用药为目的的肺癌化疗药敏试验日益受到重视。本研究采用SDI-P[1]法对801-D细胞及我科1998年6月～1999年8月肺癌手术标本进行药敏试验，并与四甲基偶氮唑盐(MTT)[2]法进行比较。
1 材料与方法
1.1 实验材料 实验药物采用顺铂(DDP)、鬼臼乙叉甙(VP-16)、阿霉素(AMD)、丝裂霉素(MMC)、甲氨喋呤(MTX)、长春瑞宾(NVB)、长春地辛(VDS)、5-氟脲嘧啶(5-FU)、卡铂(CBP)，按临床常规化疗剂量的峰值浓度配成试验浓度。人大细胞肺癌801-D系由301医院建立，临床标本来自本院外科。
, 百拇医药
1.2 实验方法
1.2.1 MTT法 用含15%小牛血清的1640培养液将801-D细胞或肿瘤细胞接种于96孔板，每孔100?μl，设空白组及不同肿瘤细胞浓度组，每组分别设为5×102、1×103、5×103、1×104、2×104、5×104/孔。置37℃、5%CO2饱和湿度培养72小时，弃上清。每孔加MTT 20?μl(浓度5?mg/ml)，继续培养4小时。加100?μl DMSO，平板振荡器上震荡5分钟，在酶标仪上以570?nm波长检测。
取肺癌手术标本重约2.0?g，在无菌条件下用含青、链霉素各500?kU/L的D-Hank's液冲洗干净，剪成尽可能小的组织块，通过100目钢筛过滤。收集过滤液吹打成单细胞悬液，小心加入预先加好2?ml Ficoll's液的10?ml离心管中(不破坏界面)，2000?r/min离心15分钟，吸出紧贴Ficoll's液上层界面的乳白色层(为肿瘤细胞)置于另一离心管内，加D-Hank's液洗涤2次(1000?r/min离心10分钟)，悬于1640培养液中，台盼蓝染色活细胞计数，调整细胞数分别接种于96孔板中，进行实验。
, 百拇医药
1.2.2 SDI-P法 在加入MTT的同时加入0.2?mol/L琥珀酸钠20?μl，其余步骤与MTT方法一样。
1.2.3 药敏试验 加抗癌药物为实验组，不加抗癌药物为对照组。实验组每种药物分3个浓度，每个浓度设3个孔。对照组设3个孔不加抗癌药物。另设3个空白孔。置37℃ 5% CO2饱和湿度培养72小时。弃上清，每孔加MTT 20?μl(5?mg/ml)继续培养4小时，加100?μl DMSO震荡5分钟，在酶标仪上570?nm测OD值。抑制率＝[(对照组OD值-实验组OD值)/(对照组OD值-空白组OD值)]×100%，当抑制率≥50%时判断该药为敏感药物。
2 结果
2.1 两法敏感性比较 用人肺癌细胞系801-D细胞进行试验，采用不同成倍稀释的细胞数量，用MTT和SDI-P法分别进行检测(表1)。每孔细胞数与OD值为直线相关，随细胞数增加OD也增加。MTT法中相关系数γ＝0.984，当细胞数在2×104/孔时可获得理想OD值。而在SDI-P法中相关系数γ＝0.983，当细胞数在5×103/孔时可获得理想OD值。
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用临床非小细胞肺癌标本进行试验，采用不同成倍稀释的细胞数量，用MTT和SDI-P法分别进行检测(表2)。MTT法相关系数γ＝0.968，细胞数在2×104/孔时可获得理想OD值；SDI-P法相关系数γ＝0.978，细胞数在5×103/孔可获得理想OD值。
表 1 MTT法与SDI-P法检测人肺癌细胞系801-D的结果
Tab 1 Detection results of human lung tumor
cell line 801-D by MTT and SDI-P assays Group
No. of cell number/well
OD value
, 百拇医药
MTT
SDI-P
Blank
0
0.4±0.05
0.4±0.05
1
5×102
0.45±0.02
0.5±0.02
2
1×103
, 百拇医药
0.5±0.03
0.6±0.03
3
5×103
0.55±0.02
0.85±0.02
4
1×104
0.6±0.02
0.87±0.02
5
2×104
, 百拇医药
0.85±0.02
0.9±0.03
6
5×104
0.85±0.03
0.9±0.02
表 2 MTT法与SDI-P法检测肺癌手术标本的结果
Tab 2 Detection results of postoperative samples of
lung tumor by MTT and SDI-P methods Group
No. of cell number/well
, 百拇医药
OD value
MTT
SDI-P
Blank
0
0.38±0.04
0.38±0.03
1
5×102
0.43±0.02
0.48±0.02
2
, 百拇医药
1×103
0.48±0.03
0.58±0.02
3
5×103
0.54±0.02
0.84±0.03
4
1×104
0.57±0.03
0.85±0.03
, 百拇医药 5
2×104
0.84±0.02
0.98±0.02
6
5×104
0.84±0.03
0.89±0.03
2.2 应用SDI-P法对临床标本进行化疗药物敏感性试验 我们对9种常用化疗药物在30例临床非小细胞肺癌术后标本中进行药物敏感性实验，结果为：NVB?80%(24/30)，MMC?80%(24/30)，ADM?77%(23/30)，DDP?73%(22/30)，VP-16?70%(21/30)，CBP?60%(18/30)，VDS?60%(18/30)，MTX?13%(4/30)，5-FU?7%(2/30)。其敏感性分别为NVB＝MMC>ADM>DDP>VP-16>CBP＝VSD>MTX>5-FU，这与贾正平等[3]报道的结果基本一致。
, 百拇医药
3 讨论
SDI-P法是在MTT法的基础上的改进。MTT法的原理是：包括肿瘤细胞在内的有核细胞线粒体呼吸链上的琥珀酸脱氢酶能把3-(4，5)-2-噻唑-(2，5)-二苯基溴化四氮唑蓝(MTT)还原成蓝色的甲(formasan)，后者的生成量与药物作用后的细胞数目和/或细胞活性成正相关。MTT法就是根据这一原理在培养板中加入一定数量肿瘤细胞的单细胞悬液，然后加入一定浓度的化疗药物培育3～4天，移去培养液后加入二甲基桠枫(DMSO)溶解所生成的甲，通过检测光密度值(OD)的变化，就能定量地反映细胞数目和/或细胞活性变化，从而确定对化疗药物的敏感性。但实际工作中发现当临床标本较小、肿瘤细胞数少时，还原的甲量少，MTT法不能有效地检测出敏感的化疗药物。有研究者将MTT法改进为SDI-P法，在反应体系中加入琥珀酸盐，使甲的产量成倍增高，所以在细胞数相对较少时仍能准确进行药敏试验。
我们通过对SDI-P和MTT法进行比较，发现SDI-P法可在癌细胞数目相对较少时进行药敏试验，使试验范围扩大，相对于MTT法更具有临床意义。同时为支气管镜检、胸水、局部淋巴结等微小病灶非手术标本进行药敏试验提供实验基础，使抗癌药物敏感试验能够更广泛地应用于临床，为个体化化疗提供更加方便、可靠的药敏试验方法。
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参考文献
1，吴舟锋，焦宛，王炳生.肿瘤化疗药物敏感性试验.国外医学外科学分册，1998，25(3)∶153-155.
2，Mosmann T.Colorimetric assay for cellular growth and survival:Application to proliferation and cytotoxicity assays. J Immunol Methods,1983,65(5)∶55-63.
3，贾正平，孙华蕴，周殿元.化疗药物体外试验(MTT分析法).中国肿瘤临床，1993，20(4)∶243-245.
收稿日期：1999-11-08
修回日期：2000-03-07, 百拇医药
单位：刘枫春 陈肖嘉 王金珠 盛瑞楠(北京市结核病胸部肿瘤研究所胸外科 101149)
关键词：
中国肺癌杂志000522 【中图分类号】R734.2；R979.1
肺癌化疗药物敏感性的体外预测是肺癌化疗个体化的基础，近年来以指导临床肺癌化疗个体化用药为目的的肺癌化疗药敏试验日益受到重视。本研究采用SDI-P[1]法对801-D细胞及我科1998年6月～1999年8月肺癌手术标本进行药敏试验，并与四甲基偶氮唑盐(MTT)[2]法进行比较。
1 材料与方法
1.1 实验材料 实验药物采用顺铂(DDP)、鬼臼乙叉甙(VP-16)、阿霉素(AMD)、丝裂霉素(MMC)、甲氨喋呤(MTX)、长春瑞宾(NVB)、长春地辛(VDS)、5-氟脲嘧啶(5-FU)、卡铂(CBP)，按临床常规化疗剂量的峰值浓度配成试验浓度。人大细胞肺癌801-D系由301医院建立，临床标本来自本院外科。
, 百拇医药
1.2 实验方法
1.2.1 MTT法 用含15%小牛血清的1640培养液将801-D细胞或肿瘤细胞接种于96孔板，每孔100?μl，设空白组及不同肿瘤细胞浓度组，每组分别设为5×102、1×103、5×103、1×104、2×104、5×104/孔。置37℃、5%CO2饱和湿度培养72小时，弃上清。每孔加MTT 20?μl(浓度5?mg/ml)，继续培养4小时。加100?μl DMSO，平板振荡器上震荡5分钟，在酶标仪上以570?nm波长检测。
取肺癌手术标本重约2.0?g，在无菌条件下用含青、链霉素各500?kU/L的D-Hank's液冲洗干净，剪成尽可能小的组织块，通过100目钢筛过滤。收集过滤液吹打成单细胞悬液，小心加入预先加好2?ml Ficoll's液的10?ml离心管中(不破坏界面)，2000?r/min离心15分钟，吸出紧贴Ficoll's液上层界面的乳白色层(为肿瘤细胞)置于另一离心管内，加D-Hank's液洗涤2次(1000?r/min离心10分钟)，悬于1640培养液中，台盼蓝染色活细胞计数，调整细胞数分别接种于96孔板中，进行实验。
, 百拇医药
1.2.2 SDI-P法 在加入MTT的同时加入0.2?mol/L琥珀酸钠20?μl，其余步骤与MTT方法一样。
1.2.3 药敏试验 加抗癌药物为实验组，不加抗癌药物为对照组。实验组每种药物分3个浓度，每个浓度设3个孔。对照组设3个孔不加抗癌药物。另设3个空白孔。置37℃ 5% CO2饱和湿度培养72小时。弃上清，每孔加MTT 20?μl(5?mg/ml)继续培养4小时，加100?μl DMSO震荡5分钟，在酶标仪上570?nm测OD值。抑制率＝[(对照组OD值-实验组OD值)/(对照组OD值-空白组OD值)]×100%，当抑制率≥50%时判断该药为敏感药物。
2 结果
2.1 两法敏感性比较 用人肺癌细胞系801-D细胞进行试验，采用不同成倍稀释的细胞数量，用MTT和SDI-P法分别进行检测(表1)。每孔细胞数与OD值为直线相关，随细胞数增加OD也增加。MTT法中相关系数γ＝0.984，当细胞数在2×104/孔时可获得理想OD值。而在SDI-P法中相关系数γ＝0.983，当细胞数在5×103/孔时可获得理想OD值。
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用临床非小细胞肺癌标本进行试验，采用不同成倍稀释的细胞数量，用MTT和SDI-P法分别进行检测(表2)。MTT法相关系数γ＝0.968，细胞数在2×104/孔时可获得理想OD值；SDI-P法相关系数γ＝0.978，细胞数在5×103/孔可获得理想OD值。
表 1 MTT法与SDI-P法检测人肺癌细胞系801-D的结果
Tab 1 Detection results of human lung tumor
cell line 801-D by MTT and SDI-P assays Group
No. of cell number/well
OD value
, 百拇医药
MTT
SDI-P
Blank
0
0.4±0.05
0.4±0.05
1
5×102
0.45±0.02
0.5±0.02
2
1×103
, 百拇医药
0.5±0.03
0.6±0.03
3
5×103
0.55±0.02
0.85±0.02
4
1×104
0.6±0.02
0.87±0.02
5
2×104
, 百拇医药
0.85±0.02
0.9±0.03
6
5×104
0.85±0.03
0.9±0.02
表 2 MTT法与SDI-P法检测肺癌手术标本的结果
Tab 2 Detection results of postoperative samples of
lung tumor by MTT and SDI-P methods Group
No. of cell number/well
, 百拇医药
OD value
MTT
SDI-P
Blank
0
0.38±0.04
0.38±0.03
1
5×102
0.43±0.02
0.48±0.02
2
, 百拇医药
1×103
0.48±0.03
0.58±0.02
3
5×103
0.54±0.02
0.84±0.03
4
1×104
0.57±0.03
0.85±0.03
, 百拇医药 5
2×104
0.84±0.02
0.98±0.02
6
5×104
0.84±0.03
0.89±0.03
2.2 应用SDI-P法对临床标本进行化疗药物敏感性试验 我们对9种常用化疗药物在30例临床非小细胞肺癌术后标本中进行药物敏感性实验，结果为：NVB?80%(24/30)，MMC?80%(24/30)，ADM?77%(23/30)，DDP?73%(22/30)，VP-16?70%(21/30)，CBP?60%(18/30)，VDS?60%(18/30)，MTX?13%(4/30)，5-FU?7%(2/30)。其敏感性分别为NVB＝MMC>ADM>DDP>VP-16>CBP＝VSD>MTX>5-FU，这与贾正平等[3]报道的结果基本一致。
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3 讨论
SDI-P法是在MTT法的基础上的改进。MTT法的原理是：包括肿瘤细胞在内的有核细胞线粒体呼吸链上的琥珀酸脱氢酶能把3-(4，5)-2-噻唑-(2，5)-二苯基溴化四氮唑蓝(MTT)还原成蓝色的甲(formasan)，后者的生成量与药物作用后的细胞数目和/或细胞活性成正相关。MTT法就是根据这一原理在培养板中加入一定数量肿瘤细胞的单细胞悬液，然后加入一定浓度的化疗药物培育3～4天，移去培养液后加入二甲基桠枫(DMSO)溶解所生成的甲，通过检测光密度值(OD)的变化，就能定量地反映细胞数目和/或细胞活性变化，从而确定对化疗药物的敏感性。但实际工作中发现当临床标本较小、肿瘤细胞数少时，还原的甲量少，MTT法不能有效地检测出敏感的化疗药物。有研究者将MTT法改进为SDI-P法，在反应体系中加入琥珀酸盐，使甲的产量成倍增高，所以在细胞数相对较少时仍能准确进行药敏试验。
我们通过对SDI-P和MTT法进行比较，发现SDI-P法可在癌细胞数目相对较少时进行药敏试验，使试验范围扩大，相对于MTT法更具有临床意义。同时为支气管镜检、胸水、局部淋巴结等微小病灶非手术标本进行药敏试验提供实验基础，使抗癌药物敏感试验能够更广泛地应用于临床，为个体化化疗提供更加方便、可靠的药敏试验方法。
, http://www.100md.com
参考文献
1，吴舟锋，焦宛，王炳生.肿瘤化疗药物敏感性试验.国外医学外科学分册，1998，25(3)∶153-155.
2，Mosmann T.Colorimetric assay for cellular growth and survival:Application to proliferation and cytotoxicity assays. J Immunol Methods,1983,65(5)∶55-63.
3，贾正平，孙华蕴，周殿元.化疗药物体外试验(MTT分析法).中国肿瘤临床，1993，20(4)∶243-245.
收稿日期：1999-11-08
修回日期：2000-03-07, 百拇医药