rhIL-3影响K562细胞对阿糖胞苷敏感性的研究
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作者：王景昌 王庆余 周大柱 孙胜德 罗莉 张侃如 谢家印
单位：王景昌 周大柱 孙胜德 罗莉 张侃如(733000 甘肃省武威市，解放军第十医院内科)；王庆余 谢家印(第三军医大学新桥医院血液科)
关键词：
中华血液学杂志000610 我们以前的研究表明，在体外重组人白细胞介素3(rhIL-3)能增强急性髓系白血病(AML)细胞对柔红霉素(DNR)的敏感性[1]。阿糖胞苷(Ara-C)是国际AML化疗的标准方案(DA方案)中的主要药物，且DNR和Ara-C对白血病细胞的作用机制不同。我们以AML细胞株K562细胞为模型，观察rhIL-3联合Ara-C对K562细胞集落(CFU-L)生长的影响，并通过3H-Ara-C掺入和测定白细胞分化抗原CD14、CD15表达，探讨其影响的机制和意义。
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材料和方法
1 K562细胞株 引自重庆医科大学组织胚胎教研室。
2 试剂 rhIL-3，日本Kirin公司产品，活性1×108U/mg。盐酸阿糖胞苷，Upjoh公司产品。3H-Ara-C，Amersham公司产品，放射性活度925GBq/mmol。小鼠抗人单克隆抗体(单抗)CD14、CD15和异硫氰酸酯荧光素(FITC)标记的兔抗鼠抗体(二抗)均购自军事医学科学院。
3 K562细胞培养 K562细胞培养液为含体积分数为10%的小牛血清的RPMI 1640液。置细胞于37℃，体积分数为5%的CO2，饱和湿度条件下培养，每3～4d换液传代。换液时1500r/min离心5min，弃上清液，细胞数调至1×105/ml，10ml/瓶。细胞经多次传代后至指数生长且死细胞数<5%时进行实验。
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4 液体悬浮培养 将指数生长期K562细胞调成5×105/ml细胞浓度悬液，以10ml/瓶为一体系，实验组加入rhIL-3，浓度分别调至10U/ml,100U/ml,1000U/ml；对照组不加rhIL-3，每组2瓶，置37℃，体积分数为5%的CO2及饱和湿度条件下培养2～3d。
5 3H-Ara-C掺入试验 将悬浮培养的K562细胞移入96孔培养板中，每孔0.2ml，加3H-Ara-C(100ng/ml)继续培养24h，收获在醋酸纤维膜上，用液闪仪测定各孔放射性核素每分钟闪烁计数(CPM)值，以3孔平均值作为3H-Ara-C掺入量。
6 细胞集落半固体培养及药敏试验 取液体悬浮培养的细胞，加入Ara-C(100ng/ml)后作用24h，按文献[2]方法进行CFU-L半固体培养，观察细胞集落产率情况，按液体悬浮培养时的分组分别计算集落产率。
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7 白血病细胞分化抗原表达测定 液体悬浮培养3d的K562细胞悬液离心弃上清，用PBA(PBS+体积分数为20%的小牛血清)洗2次，分别加入CD14、CD15单抗(一抗)，4℃ 30min。用PBA洗2次，加入二抗，4℃ 30min。PBS洗2次后，用流式细胞仪检测1×104个细胞，设立阴性对照去除非特异性荧光，仪器用鸡红细胞作标准，激发波长488nm，发射波长525nm，数据经计算机处理，计算阳性细胞百分率。
结果
1 rhIL-3对3H-Ara-C掺入K562细胞的影响 经不同浓度rhIL-3作用后K562细胞内3H-Ara-C掺入值均明显高于未经rhIL-3处理的K562细胞内3H-Ara-C掺入值(P<0.05或P<0.01)，并且CPM值的增高与rhIL-3的浓度呈剂量依赖关系(见图1)。
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图1 rhIL-3对3H-Ara-C掺入K562细胞的影响
2 rhIL-3联合Ara-C对CFU-L生长的影响 rhIL-3+Ara-C组CFU-L产率为(18.33±4.21)%，单纯Ara-C组为(38.68±7.20)%，两组比较，差异有显著性意义(P<0.01)。
3 rhIL-3对K562细胞分化抗原表达的影响 K562细胞经rhIL-3作用3d，与对照组比较，细胞分化抗原CD14、CD15表达阳性率差异无显著性意义(P>0.05)，见表1。
表1 rhIL-3对K562细胞分化的影响(
±s) 组别
CD14阳性率(%)
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CD15阳性率(%)
对照组
19.54±4.80
31.83±5.40
rhIL-3组
20.68±5.60*
34.96±8.70*
注：与对照组比较，*P>0.05讨论
白血病细胞存在较多非增殖期(G0)或慢增殖细胞，这些细胞的存在是白血病化疗失败和复发的重要原因之一[3]。我们曾以原代AML细胞体外培养为模型，证实rhIL-3具有刺激增加S期白血病细胞比例的作用[1]。Ara-C是已知作用于细胞S期的特异性药物。我们观察不同浓度rhIL-3作用后K562细胞3H-Ara-C掺入情况，结果显示，经不同浓度rhIL-3刺激后，K562细胞内3H-Ara-C掺入率较对照组增加近0.5～1.5倍。进一步半固体CFU-L培养的结果表明，rhIL-3联合Ara-C作用后，CFU-L产率比对照组显著减低。CD14、CD15为表达于较成熟的粒-单核细胞表面的抗原，观察K562细胞CD14、CD15的表达可从一个方面了解细胞的分化情况，我们的测定结果显示，rhIL-3(100U/ml)对K562细胞CD14、CD15表达阳性率无明显影响，提示在本实验条件下，rhIL-3对K562细胞无诱导分化作用，因此认为rhIL-3(100U/ml)与Ara-C联合可增强K562细胞对Ara-C的敏感性。其机制可能是rhIL-3刺激后使G0期或慢增殖的白血病细胞进入S期，从而有利于Ara-C掺入细胞DNA，加速白血病细胞死亡。
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参考文献
1，王景昌，王庆余. rhIL-3增强急性髓系白血病细胞对柔红霉素敏感性的研究. 中华血液学杂志，1999,20:30-32.
2，Boekhorst PA,Lowerberg B, Sonneveld P. Enhanced chemosensitivity in acute myeloid leukemia by the haematopoietic growth factor:a comparison of MTT assay with a clonogenic assay. Leukemia, 1993,7:1637-1644.
3，Greenberg ML, Chanana AD, Cronkite EP. The generation time of human leukemic myeloblasts. Lab Invest,1972,26:245-252.
(收稿日期：1999-05-17), 百拇医药
单位：王景昌 周大柱 孙胜德 罗莉 张侃如(733000 甘肃省武威市，解放军第十医院内科)；王庆余 谢家印(第三军医大学新桥医院血液科)
关键词：
中华血液学杂志000610 我们以前的研究表明，在体外重组人白细胞介素3(rhIL-3)能增强急性髓系白血病(AML)细胞对柔红霉素(DNR)的敏感性[1]。阿糖胞苷(Ara-C)是国际AML化疗的标准方案(DA方案)中的主要药物，且DNR和Ara-C对白血病细胞的作用机制不同。我们以AML细胞株K562细胞为模型，观察rhIL-3联合Ara-C对K562细胞集落(CFU-L)生长的影响，并通过3H-Ara-C掺入和测定白细胞分化抗原CD14、CD15表达，探讨其影响的机制和意义。
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材料和方法
1 K562细胞株 引自重庆医科大学组织胚胎教研室。
2 试剂 rhIL-3，日本Kirin公司产品，活性1×108U/mg。盐酸阿糖胞苷，Upjoh公司产品。3H-Ara-C，Amersham公司产品，放射性活度925GBq/mmol。小鼠抗人单克隆抗体(单抗)CD14、CD15和异硫氰酸酯荧光素(FITC)标记的兔抗鼠抗体(二抗)均购自军事医学科学院。
3 K562细胞培养 K562细胞培养液为含体积分数为10%的小牛血清的RPMI 1640液。置细胞于37℃，体积分数为5%的CO2，饱和湿度条件下培养，每3～4d换液传代。换液时1500r/min离心5min，弃上清液，细胞数调至1×105/ml，10ml/瓶。细胞经多次传代后至指数生长且死细胞数<5%时进行实验。
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4 液体悬浮培养 将指数生长期K562细胞调成5×105/ml细胞浓度悬液，以10ml/瓶为一体系，实验组加入rhIL-3，浓度分别调至10U/ml,100U/ml,1000U/ml；对照组不加rhIL-3，每组2瓶，置37℃，体积分数为5%的CO2及饱和湿度条件下培养2～3d。
5 3H-Ara-C掺入试验 将悬浮培养的K562细胞移入96孔培养板中，每孔0.2ml，加3H-Ara-C(100ng/ml)继续培养24h，收获在醋酸纤维膜上，用液闪仪测定各孔放射性核素每分钟闪烁计数(CPM)值，以3孔平均值作为3H-Ara-C掺入量。
6 细胞集落半固体培养及药敏试验 取液体悬浮培养的细胞，加入Ara-C(100ng/ml)后作用24h，按文献[2]方法进行CFU-L半固体培养，观察细胞集落产率情况，按液体悬浮培养时的分组分别计算集落产率。
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7 白血病细胞分化抗原表达测定 液体悬浮培养3d的K562细胞悬液离心弃上清，用PBA(PBS+体积分数为20%的小牛血清)洗2次，分别加入CD14、CD15单抗(一抗)，4℃ 30min。用PBA洗2次，加入二抗，4℃ 30min。PBS洗2次后，用流式细胞仪检测1×104个细胞，设立阴性对照去除非特异性荧光，仪器用鸡红细胞作标准，激发波长488nm，发射波长525nm，数据经计算机处理，计算阳性细胞百分率。
结果
1 rhIL-3对3H-Ara-C掺入K562细胞的影响 经不同浓度rhIL-3作用后K562细胞内3H-Ara-C掺入值均明显高于未经rhIL-3处理的K562细胞内3H-Ara-C掺入值(P<0.05或P<0.01)，并且CPM值的增高与rhIL-3的浓度呈剂量依赖关系(见图1)。
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图1 rhIL-3对3H-Ara-C掺入K562细胞的影响
2 rhIL-3联合Ara-C对CFU-L生长的影响 rhIL-3+Ara-C组CFU-L产率为(18.33±4.21)%，单纯Ara-C组为(38.68±7.20)%，两组比较，差异有显著性意义(P<0.01)。
3 rhIL-3对K562细胞分化抗原表达的影响 K562细胞经rhIL-3作用3d，与对照组比较，细胞分化抗原CD14、CD15表达阳性率差异无显著性意义(P>0.05)，见表1。
表1 rhIL-3对K562细胞分化的影响(
±s) 组别CD14阳性率(%)
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CD15阳性率(%)
对照组
19.54±4.80
31.83±5.40
rhIL-3组
20.68±5.60*
34.96±8.70*
注：与对照组比较，*P>0.05讨论
白血病细胞存在较多非增殖期(G0)或慢增殖细胞，这些细胞的存在是白血病化疗失败和复发的重要原因之一[3]。我们曾以原代AML细胞体外培养为模型，证实rhIL-3具有刺激增加S期白血病细胞比例的作用[1]。Ara-C是已知作用于细胞S期的特异性药物。我们观察不同浓度rhIL-3作用后K562细胞3H-Ara-C掺入情况，结果显示，经不同浓度rhIL-3刺激后，K562细胞内3H-Ara-C掺入率较对照组增加近0.5～1.5倍。进一步半固体CFU-L培养的结果表明，rhIL-3联合Ara-C作用后，CFU-L产率比对照组显著减低。CD14、CD15为表达于较成熟的粒-单核细胞表面的抗原，观察K562细胞CD14、CD15的表达可从一个方面了解细胞的分化情况，我们的测定结果显示，rhIL-3(100U/ml)对K562细胞CD14、CD15表达阳性率无明显影响，提示在本实验条件下，rhIL-3对K562细胞无诱导分化作用，因此认为rhIL-3(100U/ml)与Ara-C联合可增强K562细胞对Ara-C的敏感性。其机制可能是rhIL-3刺激后使G0期或慢增殖的白血病细胞进入S期，从而有利于Ara-C掺入细胞DNA，加速白血病细胞死亡。
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参考文献
1，王景昌，王庆余. rhIL-3增强急性髓系白血病细胞对柔红霉素敏感性的研究. 中华血液学杂志，1999,20:30-32.
2，Boekhorst PA,Lowerberg B, Sonneveld P. Enhanced chemosensitivity in acute myeloid leukemia by the haematopoietic growth factor:a comparison of MTT assay with a clonogenic assay. Leukemia, 1993,7:1637-1644.
3，Greenberg ML, Chanana AD, Cronkite EP. The generation time of human leukemic myeloblasts. Lab Invest,1972,26:245-252.
(收稿日期：1999-05-17), 百拇医药