全反式维甲酸和阿糖胞苷对HL-60细胞端粒酶活性的影响
http://www.100md.com
37c医学网
作者：吴向华 叶开和 胡爱群
单位：吴向华 叶开和(暨南大学医学院，广州 510630)；胡爱群(皖南医学院，芜湖 241001)
关键词：HL-60细胞；端粒酶活性；全反式维甲酸；阿糖胞苷
中国临床药理学与治疗学000113
目的 探讨全反式维甲酸(all trans-retinoic acid, ATRA)和阿糖胞苷(Ara-c)诱导人早幼粒细胞白血病细胞凋亡和分化的机制。方法 采用PCR-ELISA方法观察ATRA 和Ara-c对HL-60细胞端粒酶活性的影响。结果 ATRA和Ara-c在诱导HL-60细胞凋亡和分化过程中均可使端粒酶活性减低。结论 ATRA和Ara-c抑制HK-60细胞端粒酶的活性，可能是其诱导白血病细胞凋亡和分化的重要机制之一。
, http://www.100md.com
中图分类号 R979.1
Effect of the all trans retinoic acid and Ara-c on the telomerase activity of HL-60 cells
WU Xiang-Hua YE Kai-He
(Medical college of Jinan University,Gangzhou 510630)
HU Ai-Qun
(Wannan Medical College,Wuhu 241001)
Aim To investigate the possible mechanism of human promyelocytic leukemia cells differentiation and apoptosis induced by all trans-retinoic acid (ATRA) and Ara-c.Methods The effects of ATRA and Ara-c on the tolomerase activity of HL-60 cells were detected by PCR-ELISA.Results The tolomerase activity of HL-60 cells declined during the course of differentiation and apoptosis induced by ATRA and Ara-c.Conclusion These findings suggest that ATRA and Ara-c can inhibit tolomerase activity of HL-60 cells.It may be one of the important mechanisms of human promyelocytic leukemia cells differentiation and apoptosis induced by ATRA and Ara-c.
, 百拇医药
Key words HL-60 cell;telomerase activity;all trans-retinonic acid;cytosire arabinoside
端粒酶是一种能够延长端粒末端的核糖核蛋白酶，主要成分是RNA和蛋白质，含有引物特异识别位点，能以自身RNA为模板，合成端粒DNA并加到染色体末端，使端粒延长，从而延长细胞的寿命甚至使其永生化。自从1989年Morin[1]首次在人的癌细胞系中发现端粒酶以来，肿瘤细胞永生化的“端粒-端粒酶”假说已为越来越多的研究结果所证实。现已发现大多数恶性肿瘤细胞中可检测到端粒酶活性[2]。最近有文献报道[2～3],在诱导肿瘤分化的过程中检测到端粒酶活性的下降。这引起了人们对细胞分化与端粒酶活性调节的关注。本文拟用ATRA 和Ara-c 处理体外培养的人早幼粒白血病细胞株HL-60细胞，用PCR-ELISA方法观察ATRA 和Ara-c 对HL-60细胞端粒酶活性的影响。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 细胞和细胞培养 人早幼粒白血病细胞HL-60细胞系由暨南大学血液病研究所提供。用含10%的灭活小牛血清PRMI-1640，加青霉素、链霉素各100 U.ml-1的培养基，在37 ℃饱和湿度，5%CO2培养箱中培养，每3 d换液、传代。
1.2 ATRA 和Ara-c 处理HL-60细胞 ATRA 购自上海第二医科大学瑞金医院血液病研究所，Ara-c 购自暨南大学医学院第一附属医院。分别用无水酒精配成10-2 mmol.L-1 储液，放置于-20 ℃的冰箱中保存。实验时用生理盐水稀释，乙醇的终浓度小于0.1%。选择对数生长期的细胞，接种细胞于24孔培养板中，分四组，每组4孔。第1孔为对照，每孔接种量为1 ml细胞密度为1×106.ml-1。ATRA处理组和Ara-C处理组分别加入10-6mol.L-1和10-7 mol.L-1的ATRA和Ara-c，各50 μl。对照组加入50 μl RPML-1640，置37 ℃饱和湿度，5%CO2培养箱中培养，分别于给药后d 1、d 5、d 7取50 μl细胞悬液。
, 百拇医药
1.3 PCR-ELISA 检测端粒酶活性
1.3.1 端粒酶的提取 收集各实验组细胞,调整细胞数为1×106.ml-1，以3000 rpm×10 min弃上清液,用PBS洗两次,重复离心一次,弃上清液,加入200 μl裂解剂(5% Chaps),冰浴30 min,4 ℃ 15000 rpm离心20 min,移去上清液于用DEFC处理的离心管中。
1.3.2 RT-PCR扩增 取上述提取液2 μl与逆转录酶和dTMP、缓冲液等，在25 ℃的条件下孵育30 min，PCR扩增：50 μl反应体系包括逆转录产物，dNTP，Taq酶、生物素标记的引物Ⅰ和引物Ⅱ，94 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s ，72 ℃ 90 s，循环30次，平衡72 ℃ 10 min。
1.3.3 扩增产物 5 μl扩增产物 及20 μl变性试剂，室温下孵育10 min，加入225 μl的杂交混合液(含地高辛标记的探针)，充分混匀，加入100 μl的混合液于抗生物素蛋白包的微孔板上，然后加入与过氧化酶结合的抗地高辛抗体100 μl，22℃ 30 min ，最后加入100 μl 过氧化酶的代谢产物TMB显色10 min，测定450 nm 和690 nm的OD值。根据OD=1.5 OD450-OD690,计算酶的活性。
, http://www.100md.com
2 结果
见表1。
表1 HL-60细胞经不同浓度ATRA和ARa-c处理后不同时间端粒酶活性变化(n=100,mol.L-1)
ATRA/活性相对百分率
Ara-c/活性相对百分率
10-6
10-7
10-6
10-7
d1
, 百拇医药
47.3
54.3
40.6
57.6
d5
34.5
45.2
44.3
62.5
d7
27.7
40.6
48.4
, http://www.100md.com
65.5
从以上结果可看出:10-6 mmol.L-1 ATRA和Ara-c较10-7 mmol.L-1 ATRA和Ara-c对HL-60细胞端粒酶活性抑制明显，且同一浓度ATRA作用后d 1、d 5、d 7端粒酶活性逐渐减弱，而同一浓度Ara-c作用后d1、d5、d7端粒酶活性稍微上升。
3 讨论
越来越多的资料显示，端粒酶的激活虽然不是细胞癌变的最初因素，但确实是一个维持肿瘤生长的继发性改变。Harley[3]等人提出“端粒-端粒酶”假说。在细胞有丝分裂过程中，伴随部分端粒序列的丢失，当端粒长度缩短到 一定长度，可能触发某种信号，使细胞进入第一致死期M1，此时细胞不再分裂，退出细胞周期而死亡。而肿瘤细胞在某些机制的作用下启动端粒酶表达，而使染色体端粒稳定地维持在一定的长度从而使肿瘤细胞得以持续增殖并获得永生化。尽管目前人们对端粒酶活性的调控机制尚不清楚，但实验证明，通过诱导肿瘤细胞分化可使端粒酶活性下调，说明肿瘤恶性和逆转均与端粒酶活性变化相关[4]。从而为开发以端粒酶为靶点的有效抗肿瘤药物提供新的思路。
, 百拇医药
ATRA是一种常用的诱导分化剂，是临床上治疗急性早幼粒细胞白血病有效药物之一。国内外研究发现，ATRA不但能够诱导HL-60细胞分化，而且能诱导凋亡。用维甲酸在诱导人早幼粒细胞白血病HL-60细胞分化的同时，能明显抑制端粒酶活性，将细胞阻滞于G0/G1期。Ara-c属于核苷类似药，可抑制逆转录酶的活性，而端粒酶就是合成端粒DNA的特异逆转录酶。Ara-c可特异抑制核苷酸DNA，为作用于S期的特异性药物，从而诱导S期细胞凋亡而减少。而端粒酶的作用是将端粒序列添加到染色体末端，因而端粒酶是在细胞周期的S期发挥作用的[5]。Zhu等人[6]报道处于S期细胞端粒酶活性较其他细胞为高，而停滞于G0/G1期细胞其端粒酶活性则明显下降。
为了探讨ATRA和Ara-c诱导HL-60细胞分化和凋亡的机制，本文采用PCR-ELISA法检测ATRA和Ara-c对HL-60细胞的作用与端粒酶活性变化密切相关。从实验结果看：ATRA处理的HL-60细胞d 1即发生端粒酶活性下降，而Ara-c处理的HL-60细胞其端粒酶活性d 1下降较明显，d 5、d 7稍有上升。产生这种现象的原因可能是ATRA不是直接抑制端粒酶活性，而是诱导细胞分化和凋亡后自身调节网络变化的结果。而Ara-c可能直接通过竞争性抑制端粒酶及诱导凋亡而调节酶活性。然而，端粒酶活性的调节机制仍不清楚，ATRA和Ara-c是否通过其他途径下调端粒酶活性仍需进一步研究证实。
, http://www.100md.com
参考文献
1，Morin GB.The human telomere terminal transferase enzyme is a ribonucleoprotein that synthesizes TTAGG repeats.J Cell,1989；59:521
2，Sharma HW,Sokoloski JA,Perez JR，et al.Differntiation of immortal cells inhibitors telomerase activity.Pro Natl Acad Sci USA，.1995；92:12343
3，Harley CB,Futcher AB,Greider CW.Telomerase shorten during aging of human fibroblasts.J Nature,1990；345:458
, 百拇医药
4，Bestilny EJ,Brown CB,Miura Y,et al.Selective inhibition of telomerase activity during terminal differention of immortal cell lines.Cancer Res，1996；56:3796
5，Shimada Y, Nakano M,Kanda N，et al.Cell cycle-dependent activation of telomerase in natarally syn-thesized culture of atrue slime mold physarum poly-cephalum.Biochem Biophy Res Commun,1991；232:1492
6，Zhu X,Kumar R,Mandal M，et al.Cell cycle-dependent modulation of telomerase activity in tumor cell.Pro Natl Acad Sci USA,1996;93:6091
收稿日期：2000-01-19, http://www.100md.com
单位：吴向华 叶开和(暨南大学医学院，广州 510630)；胡爱群(皖南医学院，芜湖 241001)
关键词：HL-60细胞；端粒酶活性；全反式维甲酸；阿糖胞苷
中国临床药理学与治疗学000113
目的 探讨全反式维甲酸(all trans-retinoic acid, ATRA)和阿糖胞苷(Ara-c)诱导人早幼粒细胞白血病细胞凋亡和分化的机制。方法 采用PCR-ELISA方法观察ATRA 和Ara-c对HL-60细胞端粒酶活性的影响。结果 ATRA和Ara-c在诱导HL-60细胞凋亡和分化过程中均可使端粒酶活性减低。结论 ATRA和Ara-c抑制HK-60细胞端粒酶的活性，可能是其诱导白血病细胞凋亡和分化的重要机制之一。
, http://www.100md.com
中图分类号 R979.1
Effect of the all trans retinoic acid and Ara-c on the telomerase activity of HL-60 cells
WU Xiang-Hua YE Kai-He
(Medical college of Jinan University,Gangzhou 510630)
HU Ai-Qun
(Wannan Medical College,Wuhu 241001)
Aim To investigate the possible mechanism of human promyelocytic leukemia cells differentiation and apoptosis induced by all trans-retinoic acid (ATRA) and Ara-c.Methods The effects of ATRA and Ara-c on the tolomerase activity of HL-60 cells were detected by PCR-ELISA.Results The tolomerase activity of HL-60 cells declined during the course of differentiation and apoptosis induced by ATRA and Ara-c.Conclusion These findings suggest that ATRA and Ara-c can inhibit tolomerase activity of HL-60 cells.It may be one of the important mechanisms of human promyelocytic leukemia cells differentiation and apoptosis induced by ATRA and Ara-c.
, 百拇医药
Key words HL-60 cell;telomerase activity;all trans-retinonic acid;cytosire arabinoside
端粒酶是一种能够延长端粒末端的核糖核蛋白酶，主要成分是RNA和蛋白质，含有引物特异识别位点，能以自身RNA为模板，合成端粒DNA并加到染色体末端，使端粒延长，从而延长细胞的寿命甚至使其永生化。自从1989年Morin[1]首次在人的癌细胞系中发现端粒酶以来，肿瘤细胞永生化的“端粒-端粒酶”假说已为越来越多的研究结果所证实。现已发现大多数恶性肿瘤细胞中可检测到端粒酶活性[2]。最近有文献报道[2～3],在诱导肿瘤分化的过程中检测到端粒酶活性的下降。这引起了人们对细胞分化与端粒酶活性调节的关注。本文拟用ATRA 和Ara-c 处理体外培养的人早幼粒白血病细胞株HL-60细胞，用PCR-ELISA方法观察ATRA 和Ara-c 对HL-60细胞端粒酶活性的影响。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 细胞和细胞培养 人早幼粒白血病细胞HL-60细胞系由暨南大学血液病研究所提供。用含10%的灭活小牛血清PRMI-1640，加青霉素、链霉素各100 U.ml-1的培养基，在37 ℃饱和湿度，5%CO2培养箱中培养，每3 d换液、传代。
1.2 ATRA 和Ara-c 处理HL-60细胞 ATRA 购自上海第二医科大学瑞金医院血液病研究所，Ara-c 购自暨南大学医学院第一附属医院。分别用无水酒精配成10-2 mmol.L-1 储液，放置于-20 ℃的冰箱中保存。实验时用生理盐水稀释，乙醇的终浓度小于0.1%。选择对数生长期的细胞，接种细胞于24孔培养板中，分四组，每组4孔。第1孔为对照，每孔接种量为1 ml细胞密度为1×106.ml-1。ATRA处理组和Ara-C处理组分别加入10-6mol.L-1和10-7 mol.L-1的ATRA和Ara-c，各50 μl。对照组加入50 μl RPML-1640，置37 ℃饱和湿度，5%CO2培养箱中培养，分别于给药后d 1、d 5、d 7取50 μl细胞悬液。
, 百拇医药
1.3 PCR-ELISA 检测端粒酶活性
1.3.1 端粒酶的提取 收集各实验组细胞,调整细胞数为1×106.ml-1，以3000 rpm×10 min弃上清液,用PBS洗两次,重复离心一次,弃上清液,加入200 μl裂解剂(5% Chaps),冰浴30 min,4 ℃ 15000 rpm离心20 min,移去上清液于用DEFC处理的离心管中。
1.3.2 RT-PCR扩增 取上述提取液2 μl与逆转录酶和dTMP、缓冲液等，在25 ℃的条件下孵育30 min，PCR扩增：50 μl反应体系包括逆转录产物，dNTP，Taq酶、生物素标记的引物Ⅰ和引物Ⅱ，94 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s ，72 ℃ 90 s，循环30次，平衡72 ℃ 10 min。
1.3.3 扩增产物 5 μl扩增产物 及20 μl变性试剂，室温下孵育10 min，加入225 μl的杂交混合液(含地高辛标记的探针)，充分混匀，加入100 μl的混合液于抗生物素蛋白包的微孔板上，然后加入与过氧化酶结合的抗地高辛抗体100 μl，22℃ 30 min ，最后加入100 μl 过氧化酶的代谢产物TMB显色10 min，测定450 nm 和690 nm的OD值。根据OD=1.5 OD450-OD690,计算酶的活性。
, http://www.100md.com
2 结果
见表1。
表1 HL-60细胞经不同浓度ATRA和ARa-c处理后不同时间端粒酶活性变化(n=100,mol.L-1)
ATRA/活性相对百分率
Ara-c/活性相对百分率
10-6
10-7
10-6
10-7
d1
, 百拇医药
47.3
54.3
40.6
57.6
d5
34.5
45.2
44.3
62.5
d7
27.7
40.6
48.4
, http://www.100md.com
65.5
从以上结果可看出:10-6 mmol.L-1 ATRA和Ara-c较10-7 mmol.L-1 ATRA和Ara-c对HL-60细胞端粒酶活性抑制明显，且同一浓度ATRA作用后d 1、d 5、d 7端粒酶活性逐渐减弱，而同一浓度Ara-c作用后d1、d5、d7端粒酶活性稍微上升。
3 讨论
越来越多的资料显示，端粒酶的激活虽然不是细胞癌变的最初因素，但确实是一个维持肿瘤生长的继发性改变。Harley[3]等人提出“端粒-端粒酶”假说。在细胞有丝分裂过程中，伴随部分端粒序列的丢失，当端粒长度缩短到 一定长度，可能触发某种信号，使细胞进入第一致死期M1，此时细胞不再分裂，退出细胞周期而死亡。而肿瘤细胞在某些机制的作用下启动端粒酶表达，而使染色体端粒稳定地维持在一定的长度从而使肿瘤细胞得以持续增殖并获得永生化。尽管目前人们对端粒酶活性的调控机制尚不清楚，但实验证明，通过诱导肿瘤细胞分化可使端粒酶活性下调，说明肿瘤恶性和逆转均与端粒酶活性变化相关[4]。从而为开发以端粒酶为靶点的有效抗肿瘤药物提供新的思路。
, 百拇医药
ATRA是一种常用的诱导分化剂，是临床上治疗急性早幼粒细胞白血病有效药物之一。国内外研究发现，ATRA不但能够诱导HL-60细胞分化，而且能诱导凋亡。用维甲酸在诱导人早幼粒细胞白血病HL-60细胞分化的同时，能明显抑制端粒酶活性，将细胞阻滞于G0/G1期。Ara-c属于核苷类似药，可抑制逆转录酶的活性，而端粒酶就是合成端粒DNA的特异逆转录酶。Ara-c可特异抑制核苷酸DNA，为作用于S期的特异性药物，从而诱导S期细胞凋亡而减少。而端粒酶的作用是将端粒序列添加到染色体末端，因而端粒酶是在细胞周期的S期发挥作用的[5]。Zhu等人[6]报道处于S期细胞端粒酶活性较其他细胞为高，而停滞于G0/G1期细胞其端粒酶活性则明显下降。
为了探讨ATRA和Ara-c诱导HL-60细胞分化和凋亡的机制，本文采用PCR-ELISA法检测ATRA和Ara-c对HL-60细胞的作用与端粒酶活性变化密切相关。从实验结果看：ATRA处理的HL-60细胞d 1即发生端粒酶活性下降，而Ara-c处理的HL-60细胞其端粒酶活性d 1下降较明显，d 5、d 7稍有上升。产生这种现象的原因可能是ATRA不是直接抑制端粒酶活性，而是诱导细胞分化和凋亡后自身调节网络变化的结果。而Ara-c可能直接通过竞争性抑制端粒酶及诱导凋亡而调节酶活性。然而，端粒酶活性的调节机制仍不清楚，ATRA和Ara-c是否通过其他途径下调端粒酶活性仍需进一步研究证实。
, http://www.100md.com
参考文献
1，Morin GB.The human telomere terminal transferase enzyme is a ribonucleoprotein that synthesizes TTAGG repeats.J Cell,1989；59:521
2，Sharma HW,Sokoloski JA,Perez JR，et al.Differntiation of immortal cells inhibitors telomerase activity.Pro Natl Acad Sci USA，.1995；92:12343
3，Harley CB,Futcher AB,Greider CW.Telomerase shorten during aging of human fibroblasts.J Nature,1990；345:458
, 百拇医药
4，Bestilny EJ,Brown CB,Miura Y,et al.Selective inhibition of telomerase activity during terminal differention of immortal cell lines.Cancer Res，1996；56:3796
5，Shimada Y, Nakano M,Kanda N，et al.Cell cycle-dependent activation of telomerase in natarally syn-thesized culture of atrue slime mold physarum poly-cephalum.Biochem Biophy Res Commun,1991；232:1492
6，Zhu X,Kumar R,Mandal M，et al.Cell cycle-dependent modulation of telomerase activity in tumor cell.Pro Natl Acad Sci USA,1996;93:6091
收稿日期：2000-01-19, http://www.100md.com