慢性乙型肝炎患者精子中乙型肝炎病毒DNA定位
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作者：张智翔 赵连三 王锦蓉 雷秉钧 刘聪
单位：赵连三(华西医科大学附属第一医院，成都 610041)；王锦蓉(华西医科大学附属第一医院，成都 610041)；雷秉钧(华西医科大学附属第一医院，成都 610041)；刘聪(华西医科大学附属第一医院，成都 610041)；张智翔(现在深圳驻香港部队医院，518048)
关键词：
中华病理学杂志000126
国内外学者曾用斑点杂交和Southern印迹杂交法检测精液中乙型肝炎病毒(HBV) DNA的存在[1，2]。为从形态上明确HBV DNA是否存在于男性慢性乙型肝炎患者成熟精子中及其分布情况，我们采用原位杂交法检测了22例慢性乙型肝炎患者精子中HBV DNA。
一、材料与方法
, 百拇医药
1.标本收集：精液采自1990～1993年华西医科大学附属第一医院22例男性慢性乙型肝炎患者，HBsAg、HBeAg均为阳性，年龄19～25岁。为保持精子新鲜，采集后的标本尽快进行实验。
2.试剂：Digoxigenin试剂盒购自西德Boehringer Mannherm公司。Dig-HBV DNA探针由华西医科大学肝炎研究室制备。
3.方法：先按常规方法对22例精液标本行HBV DNA斑点杂交，再将精液标本用PBS缓冲液反复洗涤，分离去除精浆成分,斑点杂交法检测末次洗涤液HBV DNA，结果阴性后留置精子悬液，各取5 μl精子悬液均匀涂布于经多聚赖氨酸处理过的玻片上，丙酮固定后蒸汽浴变性，与Dig-HBV DNA探针杂交，过夜，漂洗后用氮蓝四唑(NBT)显色，终止显色反应后甲基绿衬染，封片。杂交时设置阳性对照，阴性对照和不加探针自身空白对照。杂交方法参照文献[4]。
二、结果
, 百拇医药
22例男性慢性乙型肝炎患者精液DNA抽提物经斑点杂交检测，结果有14例阳性。 将22例经彻底洗去精浆后的精细胞标本行原位杂交，其中2例HBV DNA阳性。此2例经斑点杂交检测HBV DNA也为阳性。原位杂交阳性标本，镜下显示HBV DNA均位于精子头的膜部和核心部，未见位于顶、体部者(图1)。 对照组无此现象。
图1 精子细胞膜、核心部呈阳性反应 原位杂交 ×100
三、讨论
母婴垂直传播是HBV感染的传播途径之一，但尚未见明确的依据证实HBV父婴垂直传播。Blumberg[3]曾推测HBV DNA可能整合于宿主生殖细胞基因中然后在子代中传播。1985年Hadchouel等[1]用斑点杂交和Southern印迹杂交检测9例乙型肝炎患者精液，发现2例HBV DNA阳性。徐小元等[2]也用此方法检测了慢性乙型肝炎患者精子中HBV DNA的存在。此种检测法证实了精液中确实存在HBV DNA，但不能从形态上定位观察HBV DNA在精子中的存在和分布情况。原位杂交法则弥补了上述不足。我们在精子头的膜部和核心部发现了HBV DNA，从形态上明确了HBV DNA在慢性乙型肝炎患者成熟精子中的分布，为HBV父婴垂直传播提供了可能的证据，有助于进一步研究HBV DNA经生殖细胞传递给子代的可能性[5]。
, 百拇医药
基金项目：国家自然科学基金(38970047)和美国纽约中华医学基金会(CMB)资助项目
参考文献：
[1]Hadchouel M, Scotto J, Huret JL,et al. Presence of HBV DNA in spermatozoa : a possible vertical transmission of HBV via germ line. J Med Virol,1985,16:61-66.
[2]徐小元，刘逢举，田庚善，等. 慢性HBV感染者精子中HBV DNA 存在的初步报告. 兰州医学院学报，1987，1:1-4.
[3]Blumberg BS. Australia antigen and biology of hepatits B. Science, 1977,197:17-25.
[4]赵连三，周思亮，王锦蓉，等. 原位杂交技术研究HBV感染与肝 癌的关系. 中国肿瘤临床，1990，17:330-331.
[]5赵连三，刘晓松，张智翔，等. 乙型肝炎肝炎病毒感染经精子传 播的可能性研究. 中华传染病杂志，1998，16:154-157.
收稿日期：1999-05-05, 百拇医药
单位：赵连三(华西医科大学附属第一医院，成都 610041)；王锦蓉(华西医科大学附属第一医院，成都 610041)；雷秉钧(华西医科大学附属第一医院，成都 610041)；刘聪(华西医科大学附属第一医院，成都 610041)；张智翔(现在深圳驻香港部队医院，518048)
关键词：
中华病理学杂志000126
国内外学者曾用斑点杂交和Southern印迹杂交法检测精液中乙型肝炎病毒(HBV) DNA的存在[1，2]。为从形态上明确HBV DNA是否存在于男性慢性乙型肝炎患者成熟精子中及其分布情况，我们采用原位杂交法检测了22例慢性乙型肝炎患者精子中HBV DNA。
一、材料与方法
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1.标本收集：精液采自1990～1993年华西医科大学附属第一医院22例男性慢性乙型肝炎患者，HBsAg、HBeAg均为阳性，年龄19～25岁。为保持精子新鲜，采集后的标本尽快进行实验。
2.试剂：Digoxigenin试剂盒购自西德Boehringer Mannherm公司。Dig-HBV DNA探针由华西医科大学肝炎研究室制备。
3.方法：先按常规方法对22例精液标本行HBV DNA斑点杂交，再将精液标本用PBS缓冲液反复洗涤，分离去除精浆成分,斑点杂交法检测末次洗涤液HBV DNA，结果阴性后留置精子悬液，各取5 μl精子悬液均匀涂布于经多聚赖氨酸处理过的玻片上，丙酮固定后蒸汽浴变性，与Dig-HBV DNA探针杂交，过夜，漂洗后用氮蓝四唑(NBT)显色，终止显色反应后甲基绿衬染，封片。杂交时设置阳性对照，阴性对照和不加探针自身空白对照。杂交方法参照文献[4]。
二、结果
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22例男性慢性乙型肝炎患者精液DNA抽提物经斑点杂交检测，结果有14例阳性。 将22例经彻底洗去精浆后的精细胞标本行原位杂交，其中2例HBV DNA阳性。此2例经斑点杂交检测HBV DNA也为阳性。原位杂交阳性标本，镜下显示HBV DNA均位于精子头的膜部和核心部，未见位于顶、体部者(图1)。 对照组无此现象。
图1 精子细胞膜、核心部呈阳性反应 原位杂交 ×100
三、讨论
母婴垂直传播是HBV感染的传播途径之一，但尚未见明确的依据证实HBV父婴垂直传播。Blumberg[3]曾推测HBV DNA可能整合于宿主生殖细胞基因中然后在子代中传播。1985年Hadchouel等[1]用斑点杂交和Southern印迹杂交检测9例乙型肝炎患者精液，发现2例HBV DNA阳性。徐小元等[2]也用此方法检测了慢性乙型肝炎患者精子中HBV DNA的存在。此种检测法证实了精液中确实存在HBV DNA，但不能从形态上定位观察HBV DNA在精子中的存在和分布情况。原位杂交法则弥补了上述不足。我们在精子头的膜部和核心部发现了HBV DNA，从形态上明确了HBV DNA在慢性乙型肝炎患者成熟精子中的分布，为HBV父婴垂直传播提供了可能的证据，有助于进一步研究HBV DNA经生殖细胞传递给子代的可能性[5]。
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基金项目：国家自然科学基金(38970047)和美国纽约中华医学基金会(CMB)资助项目
参考文献：
[1]Hadchouel M, Scotto J, Huret JL,et al. Presence of HBV DNA in spermatozoa : a possible vertical transmission of HBV via germ line. J Med Virol,1985,16:61-66.
[2]徐小元，刘逢举，田庚善，等. 慢性HBV感染者精子中HBV DNA 存在的初步报告. 兰州医学院学报，1987，1:1-4.
[3]Blumberg BS. Australia antigen and biology of hepatits B. Science, 1977,197:17-25.
[4]赵连三，周思亮，王锦蓉，等. 原位杂交技术研究HBV感染与肝 癌的关系. 中国肿瘤临床，1990，17:330-331.
[]5赵连三，刘晓松，张智翔，等. 乙型肝炎肝炎病毒感染经精子传 播的可能性研究. 中华传染病杂志，1998，16:154-157.
收稿日期：1999-05-05, 百拇医药