重组人钙调素对白芷细胞增殖及结核杆菌生长的影响
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作者：李晓军 武建国 孙大业 邵海枫
单位：李晓军(南京军区南京总医院 解放军医学检验中心， 江苏南京 210002)；武建国(南京军区南京总医院 解放军医学检验中心， 江苏南京 210002)；孙大业(河北师范大学生物系 石家庄 050016)；邵海枫(南京军区南京总医院 解放军医学检验中心， 江苏南京 210002)
关键词：钙调素；基因表达；白芷；细胞增殖；结核杆菌
医学研究生学报000408摘要： 目的：探讨重组人钙调素(rhCaM)对白芷悬浮细胞及结核杆菌增殖作用的影响。 方法：用基因重组技术获得人钙调素基因Ⅲ(hCaMⅢ cDNA)重组表达质粒hCaMⅢ/pBV220,将其转化大肠杆菌DH5α。用Phenyl-Sepharose CL-4B 疏水亲和层析法纯化重组菌超声上清表达产物。将纯化rhCaM加入悬浮培养的白芷细胞及结核杆菌培养基中，观察rhCaM对其增殖作用的影响。 结果：含hCaMⅢ/pBV220的重组菌经温度诱导可高效表达CaM蛋白，经15%SDS-PAGE分析，可观察到一相对分子质量为17 000的表达条带，Western blot 结果证实,此表达条带可与标准鼠抗CaM McAb起特异反应。每1 L菌液经Phenyl-Sepharose CL-4B 疏水亲和层析法纯化可获CaM纯品3～4 mg。rhCaM对白芷细胞增殖作用影响的研究结果表明，rhCaM在低细胞密度培养条件下对白芷细胞有促进增殖作用，效果高于标准植物CaM。本研究同时还发现一定浓度的纯化rhCaM(1、10 μg/ml)可促进牛型结核杆菌的生长。 结论：rhCaM对植物细胞和细菌均有细胞外促增殖作用。
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中图分类号： R392.11 文献标识码： A
文章编号： 1008-8199(2000)04-0234-04
Effects of recombinant human calmodulin on the proliferation of Angelica dahurica cells and Mycobacterium bovis
LI Xiao-Jun WU Jian-Guo SHAO Hai-Feng
(Center of Medical Laboratory Science,Jinling Hospital,Nanjing,210002,Jiangsu,China)
SUN Da-Ye
, 百拇医药
(Department of Biology,Hebei Normal University,Shijiazhuang,050016)
Abstract： Objectives:To explore the effects of recombinant human calmodulin (rhCaM) on the suspension-cultured cells of Angelica dahueica and Mycobacterium bovis. Methods:The hCaMⅢ cDNA-recombinant expression vector(hCaMⅢ/pBV220) was constructed by the genetic recombination techniques.The recombinant plasmid was then transformed into E. coli DH5α. rhCaM was purified by Phenyl-sepharose CL-4B affinity chromatography from recombinant bacterial lysate.The purified rhCaM was added to the suspension-cultured cells of Angelica dahueica and Lowenstein-Jensen culture medium.The effects of rhCaM on the proliferation of Angelica dahueica and Mycobacterium bovis were observed. Results:After heat induction,a high level expression of CaM protein was obtained.SDS-PAGE analysis showed that the recombinant E.coli could express a 17 000 protein. Western blot analysis showed that anti-CaM monoclonal antibody(McAb) specifically bound to the 17 000 band of expression product. 3～ 4 mg of the purified protein were obtained from 1 liter of bacterial culture.The results showed that rhCaM could extracellularly stimulate the proliferation of suspension-cultured cells of Angelica dahueica in the low density of initial cell culture. rhCaM at the final concentration of 1～10 μg/ml in culture medium could also promote the growth of Mycobacterium bovis. Conclusions:rhCaM may have extracellular effects both on plant cells and on bacterium.
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Key words: Calmodulin； Gene expression； Cell proliferation； Angelica dahurica； Mycobacterium bovis
0 引 言
钙调素(Calmodulin,CaM)作为细胞内信号转导途径中的主要信号分子,介导调控由Ca2+ 引起的一系列生理生化反应,包括细胞增殖、分化、运动等过程[1] 。近年来，陆续发现CaM也存在于细胞外[2～5]，细胞外CaM能促进人白血病细胞[6]及正常人脐静脉内皮细胞[4]和角化细胞[3]的增殖。国内学者于1992年发现牛脑CaM在胞外促进白芷悬浮培养细胞[5]的增殖。CaM分子在进化中高度保守,动物CaM来源多采用从人(或牛、猪等哺乳动物)的脑组织中提取的方法,国外已用基因工程方法制备重组人CaM(rhCaM)[7],而国内尚无类似报道。本研究旨在通过基因重组技术在大肠杆菌中高效表达及纯化重组人CaM(rhCaM),研究纯化的rhCaM对白芷细胞增殖及结核杆菌生长的影响。
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1 材料和方法
1.1 质粒、菌种和细胞 含人CaM基因Ⅲ(hCaMⅢ cDNA)全长(444 bp)的质粒载体(pUC/hCaMⅢ)由美国Strehler EE博士惠赠[8];表达载体pBV220,由中国预防医学科学院病毒所张智清教授构建[9]；大肠杆菌DH5α由军事医学科学院基础医学研究所裴武红博士赠送。牛型分枝结核杆菌购自卫生部菌种保藏中心(TMC1011)。
1.2 目的基因的诱导表达 用基因重组技术获得人钙调素基因Ⅲ(hCaMⅢ cDNA)重组表达质粒hCaMⅢ/pBV220[10] 。 含hCaMⅢ cDNA的重组菌于30℃活化过夜,1∶100稀释到LB培养液中,继续在30℃摇床培养至对数生长中期,迅速转至42℃摇床继续培养4～6 h,离心收集菌体,直接溶于2×SDS凝胶加样缓冲液,于95℃加热3 min后,用15%SDS-PAGE(分离胶浓度15%,浓缩胶浓度3%)分析。为分析表达产物的可溶性,收集诱导后重组菌,经冰浴超声破菌,离心后取上清与沉淀，分别进行SDS-PAGE。
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1.3 rhCaM的纯化[11] 采用Phenyl-Sepharose CL-4B疏水亲和层析法，从重组大肠杆菌超声上清中纯化rhCaM，用Bradford法测定蛋白含量，并通过SDS-PAGE、Western blot、氨基酸组成分析(日立835-5Q型氨基酸自动分析仪)、尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸激酶法(NADK法)测定纯化产物的纯度及特异性。rhCaM经0.22 μm微孔滤膜过滤除菌，-20℃保存。
1.4 结核杆菌培养 按常规操作进行[12]。
1.5 白芷细胞悬浮培养 取培养一定天数的白芷细胞加入灭菌MS培养基(内含30 g/L蔗糖，1 mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸，0.5 mg/L 6-苄基腺嘌呤)中，26℃下以124 r/min培养。
2 结 果
2.1 重组蛋白的表达、纯化与鉴定 重组菌经温度诱导后,用15%SDS-PAGE分析,观察到一相对分子质量与理论值(约17 000)相符的明显诱导表达带,经光密度扫描其表达量约占菌体蛋白的20%,即为人CaM蛋白、空载体(pBV220)转化菌及诱导前的重组菌，均未出现相同条带(图1)。用常规冰浴超声法粉碎细菌,将离心后的上清及沉淀分别进行SDS-PAGE,结果表明目的蛋白绝大部分位于上清,沉淀中含量很少,说明表达产物呈可溶性状态。Western Blotting 法也证实,诱导后重组菌表达的相对分子质量约17 000条带可与标准鼠抗CaM McAb(Sigma)特异性结合并显色。用Phenyl-Sepharose CL-4B疏水亲和层析柱(Pharmacia)从重组菌超声上清中纯化hCaM。纯化CaM在SDS-PAGE图谱上呈单一条带(见图1)。用Bradford 法测定蛋白含量,每1 L重组菌液可获得CaM纯品约3～4 mg。氨基酸组成分析表明，rhCaM与文献报道的牛脑CaM在氨基酸组成上基本一致，其中酸性氨基酸如Asp和Glu的分子数占氨基酸总数的30%以上，不含色氨酸和半胱氨酸。用NAD激酶法测定重组hCaM活性,结果表明重组hCaM与标准hCaM(Sigma)对NAD激酶激活程度基本一致。
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图1 CaM表达及纯化的SDS-PAGE结果分析
Figur 1 SDS-PAGE analysis of hCaM expression and purification
1.Uninduced DH5α/pBV220
2.Induced DH5α/pBV220
3.Uninduced DH5α/pBV220-hCaMⅢ
4.Induced DH5α/pBV220-hCaMⅢ
5.Purified rhCaM by Phenyl-Sepharose CL-4B column
6.Standard Human Brain CaM(Sigma)
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7.Protein molecular weight marker
2.2 外源rhCaM对白芷细胞增殖作用的影响 取灭菌的标准CaM及rhCaM分别加入细胞悬浮液中，终浓度为10-7mol/L，每种试剂及对照各三个平行样，取培养7天的细胞悬浮液，每次摇匀后吸出30 μl镜检计数，每瓶样品计数10次，取平均值。结果见表1。
2.3 外源rhCaM对结核杆菌生长的影响 将不同浓度的纯化rhCaM与改良罗氏(Lowenstein-Jensen)培养基混合，使其终浓度分别达0.1、1.0、10 μg/ml，制成斜面,每浓度做3管。挑取牛型分枝结核杆菌菌落，将其研磨均匀，用等渗盐水配成0.5个麦氏单位，取菌液0.05 ml均匀涂抹于每管培养基斜面，于35℃孵箱培养。每隔24 h观察菌落生长情况。72 h后rhCaM 浓度为1 μg/ml和10 μg/ml的培养管可观察到菌落生长，但未加rhCaM及rhCaM浓度0.1 μg/ml管未发现明显菌落；96 h后后两管出现菌落(图2，彩图见第283页)。
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图2 rhCaM对结核杆菌生长的作用
Figure 2 Effect of rhCaM on the growth of Mycobacterium bovis
1～ 4:The concentrations of rhCaM in culture medium were 0.0,0.1,1.0 and 10.0 μg/ml respectively.
表1 rhCaM对白芷细胞增殖作用的影响
Table 1 Effect of rhCaM on the cell proliferation of Angelica dehurica Sample
Nitial cell density cell
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Density after culture
Increased cell number
Increased percentage
(cell/ml)
(cell/ml)
(cell/ml)
(%)
rhCaM not added
2 465.1±50.8
4 326.3±174.9
1 861.2
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100
Standard CaM
2 465.1±50.8
5 392.2±442.2
2927.1
157
rhCaM
2 465.1±50.8
5 722.2±1075.8
3257.1
175
3 讨 论
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细胞内CaM与细胞增殖调控的关系已为人们所公认，然而近年来发现CaM也存在于细胞外, 细胞外CaM亦影响细胞增殖。 Boynton等于1980年首先指出，外源性CaM不仅可以恢复被CaM拮抗剂抑制的细胞的DNA合成，而且也可直接促进DNA合成[12]。Gorbacherskaya等在人外周血淋巴细胞的研究中也得到类似结论[13]。Crocker[6]用W7-agarose和CaM抗体首次证明，外源性CaM可促进K562人白血病细胞增殖。随后发现细胞外CaM也能促进正常人脐静脉内皮细胞[4]和角化细胞[3]的增殖。
尽管根据CaM的理化性质,从人、牛等脑组织中提取纯化CaM的方法已较成熟,但因得率较低,目前国外已有利用基因工程的方法制备hCaM的报道[7],目前国内尚未见有关研究报道。本研究将hCaMⅢ cDNA插入原核表达载体pBV220中,构建重组质粒pBV220/hCaMⅢ,以此转化大肠杆菌感受态DH5α,构建的重组菌经30℃活化,42℃诱导,15%SDS-PAGE分析表明,重组菌可表达相对分子质量约17 000的特异性产物,用Phenyl-Sepharose CL-4B疏水亲和层析柱从重组菌超声上清中纯化hCaM，每1 L重组菌可获rhCaM纯品3～4 mg。
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本课题在国内学者研究植物CaM对白芷细胞增殖作用的基础上[2,5]，用纯化rhCaM研究其对白芷细胞的促增殖作用。结果表明，rhCaM在低细胞密度培养条件下对白芷细胞也有促进增殖作用，效果高于标准植物CaM。本研究还同时发现一定浓度的纯化rhCaM(1、10 μg/ml)与改良罗氏培养基混合后，可促进牛型结核杆菌的生长。上述结果均再次证实了细胞外CaM的促增殖作用。对CaM胞外促增殖作用的研究，不仅有助于进一步研究细胞外CaM的细胞调控作用，而且有助于解决医学中某些难培养细胞的生长、增殖等问题。
江苏省自然科学基金资助项目(BK95141307)
李晓军(1962-),女,北京市人,医学硕士,从事微生物免疫学研究专业.
参 考 文 献：
[1] Means,AR,VanBerkum MFA,Bagchi I,et al.Regulatory functions of calmodulin[J].Pharmac Ther,1991,50:255-270.
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[2] JX Li, JW Liu， DY Sun.Immunoelectron microscopic localization of calmodulin in corn root cells[J]. Cell Res,1993,3:11-19.
[3] Goberdhan NJ,Dawson RA,Freedlander E,et al.A calmodulin-like protein as an extracellular mitogen for the keratinocyte[J].Br J Dermatol,1993, 129:678-688.
[4] Dawson, RA,MacNeil S.Mitogenic role for extracellular calmodulin-like activity in normal human umbilical vein endothelial cells[J]. Br J Haematol, 1992,82:151-160.
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[5] DY Sun,HB Li, G Cheng.Extracellular calmodulin accelerates the proliferation of suspension-cultured cells of Angelica dahurica[J]. Plant Science,1994,99:1-8.
[6] Crocker G,Dawson RA, Barton CH,et al.An extracellular role for calmodulin-like activity in cell proliferation[J]. Biochem J, 1988,253:877-884.
[7] Rhyner JA,Koller M,DurusselGerber I,et al.Characterization of the human calmodulin-like protein expressed in Escherichia coli[J]. Biochemistry, 1992,31(51):12826～12832.
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[8] Fischer R,Koller M,Flura M,et al.Multiple divergent mRNAs code for a single human calmodulin[J].J Biol Chem,1988,263:17055～17062.
[9] 张智清，姚立红，侯云德.含PRPL启动子的原核高效表达载体的组建及其应用[J].病毒学报，1990,6:111-115.
[10] 李晓军，武建国，郭大文,等.人钙调素基因表达载体的构建及在大肠杆菌中的表达[J].中国免疫学杂志，2000,16(2)：61-63.
[11] 李晓军，武建国，郭大文，等.人钙调素在大肠杆菌中的表达、纯化及其活性研究[J].中国生物化学与分子生物学报，1999,15(5)：714-718.
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[12] 朱忠勇主编.实用医学检验学[M].北京：人民军医出版社，1992.514.
[13] Boynton AL,Whitfield JF, Macmanus JP.Calmodulin stimulates DNA synthesis by rat liver cells[J]. Biochem Biophys Res Commun,1980,95(2):745-749.
[14] Gorbacherskaya LV,Borovkava TV,Rybin UD.Effect of exogenous calmodulin lymphocyte proliferation in normal subjects[J].Bull Exp Med Biol, 1983,95:361-363.
收稿日期：2000-04-10, http://www.100md.com
单位：李晓军(南京军区南京总医院 解放军医学检验中心， 江苏南京 210002)；武建国(南京军区南京总医院 解放军医学检验中心， 江苏南京 210002)；孙大业(河北师范大学生物系 石家庄 050016)；邵海枫(南京军区南京总医院 解放军医学检验中心， 江苏南京 210002)
关键词：钙调素；基因表达；白芷；细胞增殖；结核杆菌
医学研究生学报000408摘要： 目的：探讨重组人钙调素(rhCaM)对白芷悬浮细胞及结核杆菌增殖作用的影响。 方法：用基因重组技术获得人钙调素基因Ⅲ(hCaMⅢ cDNA)重组表达质粒hCaMⅢ/pBV220,将其转化大肠杆菌DH5α。用Phenyl-Sepharose CL-4B 疏水亲和层析法纯化重组菌超声上清表达产物。将纯化rhCaM加入悬浮培养的白芷细胞及结核杆菌培养基中，观察rhCaM对其增殖作用的影响。 结果：含hCaMⅢ/pBV220的重组菌经温度诱导可高效表达CaM蛋白，经15%SDS-PAGE分析，可观察到一相对分子质量为17 000的表达条带，Western blot 结果证实,此表达条带可与标准鼠抗CaM McAb起特异反应。每1 L菌液经Phenyl-Sepharose CL-4B 疏水亲和层析法纯化可获CaM纯品3～4 mg。rhCaM对白芷细胞增殖作用影响的研究结果表明，rhCaM在低细胞密度培养条件下对白芷细胞有促进增殖作用，效果高于标准植物CaM。本研究同时还发现一定浓度的纯化rhCaM(1、10 μg/ml)可促进牛型结核杆菌的生长。 结论：rhCaM对植物细胞和细菌均有细胞外促增殖作用。
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中图分类号： R392.11 文献标识码： A
文章编号： 1008-8199(2000)04-0234-04
Effects of recombinant human calmodulin on the proliferation of Angelica dahurica cells and Mycobacterium bovis
LI Xiao-Jun WU Jian-Guo SHAO Hai-Feng
(Center of Medical Laboratory Science,Jinling Hospital,Nanjing,210002,Jiangsu,China)
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(Department of Biology,Hebei Normal University,Shijiazhuang,050016)
Abstract： Objectives:To explore the effects of recombinant human calmodulin (rhCaM) on the suspension-cultured cells of Angelica dahueica and Mycobacterium bovis. Methods:The hCaMⅢ cDNA-recombinant expression vector(hCaMⅢ/pBV220) was constructed by the genetic recombination techniques.The recombinant plasmid was then transformed into E. coli DH5α. rhCaM was purified by Phenyl-sepharose CL-4B affinity chromatography from recombinant bacterial lysate.The purified rhCaM was added to the suspension-cultured cells of Angelica dahueica and Lowenstein-Jensen culture medium.The effects of rhCaM on the proliferation of Angelica dahueica and Mycobacterium bovis were observed. Results:After heat induction,a high level expression of CaM protein was obtained.SDS-PAGE analysis showed that the recombinant E.coli could express a 17 000 protein. Western blot analysis showed that anti-CaM monoclonal antibody(McAb) specifically bound to the 17 000 band of expression product. 3～ 4 mg of the purified protein were obtained from 1 liter of bacterial culture.The results showed that rhCaM could extracellularly stimulate the proliferation of suspension-cultured cells of Angelica dahueica in the low density of initial cell culture. rhCaM at the final concentration of 1～10 μg/ml in culture medium could also promote the growth of Mycobacterium bovis. Conclusions:rhCaM may have extracellular effects both on plant cells and on bacterium.
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Key words: Calmodulin； Gene expression； Cell proliferation； Angelica dahurica； Mycobacterium bovis
0 引 言
钙调素(Calmodulin,CaM)作为细胞内信号转导途径中的主要信号分子,介导调控由Ca2+ 引起的一系列生理生化反应,包括细胞增殖、分化、运动等过程[1] 。近年来，陆续发现CaM也存在于细胞外[2～5]，细胞外CaM能促进人白血病细胞[6]及正常人脐静脉内皮细胞[4]和角化细胞[3]的增殖。国内学者于1992年发现牛脑CaM在胞外促进白芷悬浮培养细胞[5]的增殖。CaM分子在进化中高度保守,动物CaM来源多采用从人(或牛、猪等哺乳动物)的脑组织中提取的方法,国外已用基因工程方法制备重组人CaM(rhCaM)[7],而国内尚无类似报道。本研究旨在通过基因重组技术在大肠杆菌中高效表达及纯化重组人CaM(rhCaM),研究纯化的rhCaM对白芷细胞增殖及结核杆菌生长的影响。
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1 材料和方法
1.1 质粒、菌种和细胞 含人CaM基因Ⅲ(hCaMⅢ cDNA)全长(444 bp)的质粒载体(pUC/hCaMⅢ)由美国Strehler EE博士惠赠[8];表达载体pBV220,由中国预防医学科学院病毒所张智清教授构建[9]；大肠杆菌DH5α由军事医学科学院基础医学研究所裴武红博士赠送。牛型分枝结核杆菌购自卫生部菌种保藏中心(TMC1011)。
1.2 目的基因的诱导表达 用基因重组技术获得人钙调素基因Ⅲ(hCaMⅢ cDNA)重组表达质粒hCaMⅢ/pBV220[10] 。 含hCaMⅢ cDNA的重组菌于30℃活化过夜,1∶100稀释到LB培养液中,继续在30℃摇床培养至对数生长中期,迅速转至42℃摇床继续培养4～6 h,离心收集菌体,直接溶于2×SDS凝胶加样缓冲液,于95℃加热3 min后,用15%SDS-PAGE(分离胶浓度15%,浓缩胶浓度3%)分析。为分析表达产物的可溶性,收集诱导后重组菌,经冰浴超声破菌,离心后取上清与沉淀，分别进行SDS-PAGE。
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1.3 rhCaM的纯化[11] 采用Phenyl-Sepharose CL-4B疏水亲和层析法，从重组大肠杆菌超声上清中纯化rhCaM，用Bradford法测定蛋白含量，并通过SDS-PAGE、Western blot、氨基酸组成分析(日立835-5Q型氨基酸自动分析仪)、尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸激酶法(NADK法)测定纯化产物的纯度及特异性。rhCaM经0.22 μm微孔滤膜过滤除菌，-20℃保存。
1.4 结核杆菌培养 按常规操作进行[12]。
1.5 白芷细胞悬浮培养 取培养一定天数的白芷细胞加入灭菌MS培养基(内含30 g/L蔗糖，1 mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸，0.5 mg/L 6-苄基腺嘌呤)中，26℃下以124 r/min培养。
2 结 果
2.1 重组蛋白的表达、纯化与鉴定 重组菌经温度诱导后,用15%SDS-PAGE分析,观察到一相对分子质量与理论值(约17 000)相符的明显诱导表达带,经光密度扫描其表达量约占菌体蛋白的20%,即为人CaM蛋白、空载体(pBV220)转化菌及诱导前的重组菌，均未出现相同条带(图1)。用常规冰浴超声法粉碎细菌,将离心后的上清及沉淀分别进行SDS-PAGE,结果表明目的蛋白绝大部分位于上清,沉淀中含量很少,说明表达产物呈可溶性状态。Western Blotting 法也证实,诱导后重组菌表达的相对分子质量约17 000条带可与标准鼠抗CaM McAb(Sigma)特异性结合并显色。用Phenyl-Sepharose CL-4B疏水亲和层析柱(Pharmacia)从重组菌超声上清中纯化hCaM。纯化CaM在SDS-PAGE图谱上呈单一条带(见图1)。用Bradford 法测定蛋白含量,每1 L重组菌液可获得CaM纯品约3～4 mg。氨基酸组成分析表明，rhCaM与文献报道的牛脑CaM在氨基酸组成上基本一致，其中酸性氨基酸如Asp和Glu的分子数占氨基酸总数的30%以上，不含色氨酸和半胱氨酸。用NAD激酶法测定重组hCaM活性,结果表明重组hCaM与标准hCaM(Sigma)对NAD激酶激活程度基本一致。
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图1 CaM表达及纯化的SDS-PAGE结果分析
Figur 1 SDS-PAGE analysis of hCaM expression and purification
1.Uninduced DH5α/pBV220
2.Induced DH5α/pBV220
3.Uninduced DH5α/pBV220-hCaMⅢ
4.Induced DH5α/pBV220-hCaMⅢ
5.Purified rhCaM by Phenyl-Sepharose CL-4B column
6.Standard Human Brain CaM(Sigma)
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7.Protein molecular weight marker
2.2 外源rhCaM对白芷细胞增殖作用的影响 取灭菌的标准CaM及rhCaM分别加入细胞悬浮液中，终浓度为10-7mol/L，每种试剂及对照各三个平行样，取培养7天的细胞悬浮液，每次摇匀后吸出30 μl镜检计数，每瓶样品计数10次，取平均值。结果见表1。
2.3 外源rhCaM对结核杆菌生长的影响 将不同浓度的纯化rhCaM与改良罗氏(Lowenstein-Jensen)培养基混合，使其终浓度分别达0.1、1.0、10 μg/ml，制成斜面,每浓度做3管。挑取牛型分枝结核杆菌菌落，将其研磨均匀，用等渗盐水配成0.5个麦氏单位，取菌液0.05 ml均匀涂抹于每管培养基斜面，于35℃孵箱培养。每隔24 h观察菌落生长情况。72 h后rhCaM 浓度为1 μg/ml和10 μg/ml的培养管可观察到菌落生长，但未加rhCaM及rhCaM浓度0.1 μg/ml管未发现明显菌落；96 h后后两管出现菌落(图2，彩图见第283页)。
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图2 rhCaM对结核杆菌生长的作用
Figure 2 Effect of rhCaM on the growth of Mycobacterium bovis
1～ 4:The concentrations of rhCaM in culture medium were 0.0,0.1,1.0 and 10.0 μg/ml respectively.
表1 rhCaM对白芷细胞增殖作用的影响
Table 1 Effect of rhCaM on the cell proliferation of Angelica dehurica Sample
Nitial cell density cell
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Density after culture
Increased cell number
Increased percentage
(cell/ml)
(cell/ml)
(cell/ml)
(%)
rhCaM not added
2 465.1±50.8
4 326.3±174.9
1 861.2
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Standard CaM
2 465.1±50.8
5 392.2±442.2
2927.1
157
rhCaM
2 465.1±50.8
5 722.2±1075.8
3257.1
175
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细胞内CaM与细胞增殖调控的关系已为人们所公认，然而近年来发现CaM也存在于细胞外, 细胞外CaM亦影响细胞增殖。 Boynton等于1980年首先指出，外源性CaM不仅可以恢复被CaM拮抗剂抑制的细胞的DNA合成，而且也可直接促进DNA合成[12]。Gorbacherskaya等在人外周血淋巴细胞的研究中也得到类似结论[13]。Crocker[6]用W7-agarose和CaM抗体首次证明，外源性CaM可促进K562人白血病细胞增殖。随后发现细胞外CaM也能促进正常人脐静脉内皮细胞[4]和角化细胞[3]的增殖。
尽管根据CaM的理化性质,从人、牛等脑组织中提取纯化CaM的方法已较成熟,但因得率较低,目前国外已有利用基因工程的方法制备hCaM的报道[7],目前国内尚未见有关研究报道。本研究将hCaMⅢ cDNA插入原核表达载体pBV220中,构建重组质粒pBV220/hCaMⅢ,以此转化大肠杆菌感受态DH5α,构建的重组菌经30℃活化,42℃诱导,15%SDS-PAGE分析表明,重组菌可表达相对分子质量约17 000的特异性产物,用Phenyl-Sepharose CL-4B疏水亲和层析柱从重组菌超声上清中纯化hCaM，每1 L重组菌可获rhCaM纯品3～4 mg。
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本课题在国内学者研究植物CaM对白芷细胞增殖作用的基础上[2,5]，用纯化rhCaM研究其对白芷细胞的促增殖作用。结果表明，rhCaM在低细胞密度培养条件下对白芷细胞也有促进增殖作用，效果高于标准植物CaM。本研究还同时发现一定浓度的纯化rhCaM(1、10 μg/ml)与改良罗氏培养基混合后，可促进牛型结核杆菌的生长。上述结果均再次证实了细胞外CaM的促增殖作用。对CaM胞外促增殖作用的研究，不仅有助于进一步研究细胞外CaM的细胞调控作用，而且有助于解决医学中某些难培养细胞的生长、增殖等问题。
江苏省自然科学基金资助项目(BK95141307)
李晓军(1962-),女,北京市人,医学硕士,从事微生物免疫学研究专业.
参 考 文 献：
[1] Means,AR,VanBerkum MFA,Bagchi I,et al.Regulatory functions of calmodulin[J].Pharmac Ther,1991,50:255-270.
, 百拇医药
[2] JX Li, JW Liu， DY Sun.Immunoelectron microscopic localization of calmodulin in corn root cells[J]. Cell Res,1993,3:11-19.
[3] Goberdhan NJ,Dawson RA,Freedlander E,et al.A calmodulin-like protein as an extracellular mitogen for the keratinocyte[J].Br J Dermatol,1993, 129:678-688.
[4] Dawson, RA,MacNeil S.Mitogenic role for extracellular calmodulin-like activity in normal human umbilical vein endothelial cells[J]. Br J Haematol, 1992,82:151-160.
, 百拇医药
[5] DY Sun,HB Li, G Cheng.Extracellular calmodulin accelerates the proliferation of suspension-cultured cells of Angelica dahurica[J]. Plant Science,1994,99:1-8.
[6] Crocker G,Dawson RA, Barton CH,et al.An extracellular role for calmodulin-like activity in cell proliferation[J]. Biochem J, 1988,253:877-884.
[7] Rhyner JA,Koller M,DurusselGerber I,et al.Characterization of the human calmodulin-like protein expressed in Escherichia coli[J]. Biochemistry, 1992,31(51):12826～12832.
, 百拇医药
[8] Fischer R,Koller M,Flura M,et al.Multiple divergent mRNAs code for a single human calmodulin[J].J Biol Chem,1988,263:17055～17062.
[9] 张智清，姚立红，侯云德.含PRPL启动子的原核高效表达载体的组建及其应用[J].病毒学报，1990,6:111-115.
[10] 李晓军，武建国，郭大文,等.人钙调素基因表达载体的构建及在大肠杆菌中的表达[J].中国免疫学杂志，2000,16(2)：61-63.
[11] 李晓军，武建国，郭大文，等.人钙调素在大肠杆菌中的表达、纯化及其活性研究[J].中国生物化学与分子生物学报，1999,15(5)：714-718.
, 百拇医药
[12] 朱忠勇主编.实用医学检验学[M].北京：人民军医出版社，1992.514.
[13] Boynton AL,Whitfield JF, Macmanus JP.Calmodulin stimulates DNA synthesis by rat liver cells[J]. Biochem Biophys Res Commun,1980,95(2):745-749.
[14] Gorbacherskaya LV,Borovkava TV,Rybin UD.Effect of exogenous calmodulin lymphocyte proliferation in normal subjects[J].Bull Exp Med Biol, 1983,95:361-363.
收稿日期：2000-04-10, http://www.100md.com