直接转移人白细胞介素-6基因对照射小鼠外周血象恢复的影响
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作者：孙连生 邱丽玲 王嘉玺 柳晓兰 刘明东 付东 罗庆良 毛秉智
单位：孙连生 邱丽玲 柳晓兰 付东 罗庆良 毛秉智(北京放射医学研究所 100850)；王嘉玺(北京基础医学研究所)；刘明东(北京输血研究所)
关键词：
中华放射医学与防护杂志000117 急性放射病(ARS)时造血系统损伤严重，是感染、出血两大致死性并发症的根本原因。造血生长因子可以促进机体造血恢复，在实验和临床研究中都取得了较好的结果，目前是促进急性放射病造血损伤恢复的首选药物。但是，应用细胞因子尚有一些不利因素。相比之下，基因治疗有明显优势。作者采用直接基因转移方法，向体内转移人白细胞介素6(hIL-6)cDNA，探讨应用基因治疗急性放射病的可能性，报道如下。
一、材料和方法
, 百拇医药 1.材料：hIL-6 cDNA：北京基础医学研究所克隆，定点突变后克隆入载体质粒(pCSV)。载体质粒：骨骼肌表达载体质粒(pVR1255)由美国Vical公司提供。内含荧光素酶基因lux。实验动物及造血损伤模型：二级BALB/C、C57BL/6J小鼠，6～7周龄，体重19～23 g，分别分为正常动物治疗、对照组(每组各4只)和照射动物治疗、对照组(每组各6只)。照射模型用60Co γ射线1次性全身照射，BALB/C小鼠吸收剂量为3.5 Gy，C57BL/6J小鼠吸收剂量为5.0 Gy。
2.方法：构建、提取质粒及注射：通过PCR扩增在IL-6 cDNA两端加入EcoRV和BamHI酶切位点，双酶切后连入同样双酶切的载体质粒，为阳性克隆(p1256)。pVR1255双酶切去除lux,Klenow大片断补平连接，为阴性对照(p1250)。碱裂解法提取质粒，经大量核糖核酸酶消化，酚：氯仿抽提，结果光密度A值260/280≈1.9～2.1。照射后3.5 h于小鼠后肢肌肉注射1次，BALB/C品系50 μg/只，C57BL/6J品系80 μg/只。
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观测指标及结果：正常小鼠于转基因后3、7和11 d，照射小鼠于照射后3、7、11、14、21、28和35 d从尾静脉取血，用F-800血细胞计数仪检测外周血象。
统计分析：用t检验比较组间差异显著性。
二、实验结果
1.正常动物：治疗后3、7和11 d两品系小鼠治疗组与对照组间的血细胞数相比差异均无显著性。
2.照射动物：3.5 Gy照射的BALB/C小鼠在照射后7、11和14 d治疗组的血小板数分别是对照组的1.15、1.15和1.16倍，7 d时差异有显著性。两组间白细胞数、红细胞数和血红蛋白相比差异无显著性。5.0 Gy照射的C57BL/6J小鼠照射后7～21 d血小板数均显著高于对照组，分别是对照组的1.53、1.81、1.71和1.20倍(见图1)。其他血细胞变化情况与BALB/C小鼠结果一致。
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图1 5.0 Gy 照射后C57BL/6J小鼠
PLT恢复情况
三、讨论
到目前为止，最成功的基因治疗方法是体外-体内法(ex vivo)，临床应用效果良好，但操作繁琐，对实验条件要求高。相比之下，体内基因直接注射(in vivo)更简捷易用，近年来取得了可喜的成果。尤其是采用质粒载体，与病毒载体相比有较多优点：①外源基因以非复制的游离形式存在，没有潜在的致体细胞突变危险；②无野生型或辅助性病毒引起感染的危险；③不需要通过包装细胞扩增；④无蛋白不会引起炎性反应或免疫反应。这些优点在应用于ARS等伴有机体基因组DNA损伤修复的疾病时更显重要。但是，由于质粒载体转染效率比病毒载体低许多，所以一直未达到实用水平。
近几年在延长质粒载体的表达时间和提高转染效率两个方面都有一定进展。如Tripathy等[1]将hEPO基因插入VR-1012质粒，正常BALB/C小鼠肌注10 μg，10 d后血细胞比积就升高到62%，峰值为66%，90 d时仍维持在62%左右。这说明采用质粒载体转移细胞因子基因可以有较长时间的表达，提示有一定应用前景。载体VR-1012改造后称作VR-1255，被认为是目前表达效率最高的基因直接转移载体[2]。尽管如此，转染效率低下还是一个必须解决的问题。虽然照射可以明显提高体外基因转染效率[3]，但体内如何尚未见报道。因此，只有体内促转染效果也非常显著，才有希望应用于急性放射病的治疗。作者正是从这个角度出发，对此进行了尝试。
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实验结果中未看到直接转移hIL-6促进正常小鼠血小板生成的效果，可能有两方面原因：①IL-6不是巨核系特异的造血生长因子，作用没有TPO强，也许加大转基因剂量会观察到类似转移TPO基因的效果[4]。②转移的质粒纯度不高影响转染效率。与正常小鼠相反，在这两个品系的照射小鼠上均观察到有一定的治疗效果，无论是PLT还是WBC治疗组都比对照组有显著性升高，尤其是促PLT恢复效果更佳。5.0 Gy照射C57BL/6J小鼠在照射后11 d对照组动物血小板在最低值时，治疗组血小板出现平台性升高，这正是急性放射病抗出血时希望达到的最佳效果。从结果可以推测照射增加了转染效率，实现了hIL-6蛋白在体内的高表达，且增加转染效率的程度可能与一定的照射剂量相关。因此，作者认为可以应用本方法进行急性放射病的实验治疗研究。进一步转染TPO基因的质粒正在构建中。
另外，两个品系小鼠都有hIL-6表达说明，基因直接转移方法用于治疗目的时动物品系可能对治疗效果影响不大，可以按不同疾病模型的要求选择动物品系，而不必像制作核酸疫苗一样考虑品系对效果的影响。■
, 百拇医药
参考文献
[1]Tripathy SK,Svensson EC,Black HB,et al.Long-term expression of erythropoietin in the systemic circulation of mice after intramuscular injection of a plasmid DNA vector.Proc Natl Acad Sci USA,1996,93:10876-10880.
[2]Hartikka J,Sawdey M,Cornefert-Jensen F,et al.An improved plasmid DNA expression vector for direct injection into skeletal muscle.Human Gene Therapy,1996,7:1205-1217.
[3]Stevens CW,Zeng M,Cerniglia GJ,et al.Ionizing radiation greatly improves gene transfer efficiency in mammalian cells.Human Gene Therapy,1996,7:1727-1734.
[4]李景泰，赵建增，刘丽.血小板生成素cDNA体内传送促进血小板生成的研究.生物技术通讯，1997，8：150-151.
收稿日期:1999-02-06, 百拇医药
单位：孙连生 邱丽玲 柳晓兰 付东 罗庆良 毛秉智(北京放射医学研究所 100850)；王嘉玺(北京基础医学研究所)；刘明东(北京输血研究所)
关键词：
中华放射医学与防护杂志000117 急性放射病(ARS)时造血系统损伤严重，是感染、出血两大致死性并发症的根本原因。造血生长因子可以促进机体造血恢复，在实验和临床研究中都取得了较好的结果，目前是促进急性放射病造血损伤恢复的首选药物。但是，应用细胞因子尚有一些不利因素。相比之下，基因治疗有明显优势。作者采用直接基因转移方法，向体内转移人白细胞介素6(hIL-6)cDNA，探讨应用基因治疗急性放射病的可能性，报道如下。
一、材料和方法
, 百拇医药 1.材料：hIL-6 cDNA：北京基础医学研究所克隆，定点突变后克隆入载体质粒(pCSV)。载体质粒：骨骼肌表达载体质粒(pVR1255)由美国Vical公司提供。内含荧光素酶基因lux。实验动物及造血损伤模型：二级BALB/C、C57BL/6J小鼠，6～7周龄，体重19～23 g，分别分为正常动物治疗、对照组(每组各4只)和照射动物治疗、对照组(每组各6只)。照射模型用60Co γ射线1次性全身照射，BALB/C小鼠吸收剂量为3.5 Gy，C57BL/6J小鼠吸收剂量为5.0 Gy。
2.方法：构建、提取质粒及注射：通过PCR扩增在IL-6 cDNA两端加入EcoRV和BamHI酶切位点，双酶切后连入同样双酶切的载体质粒，为阳性克隆(p1256)。pVR1255双酶切去除lux,Klenow大片断补平连接，为阴性对照(p1250)。碱裂解法提取质粒，经大量核糖核酸酶消化，酚：氯仿抽提，结果光密度A值260/280≈1.9～2.1。照射后3.5 h于小鼠后肢肌肉注射1次，BALB/C品系50 μg/只，C57BL/6J品系80 μg/只。
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观测指标及结果：正常小鼠于转基因后3、7和11 d，照射小鼠于照射后3、7、11、14、21、28和35 d从尾静脉取血，用F-800血细胞计数仪检测外周血象。
统计分析：用t检验比较组间差异显著性。
二、实验结果
1.正常动物：治疗后3、7和11 d两品系小鼠治疗组与对照组间的血细胞数相比差异均无显著性。
2.照射动物：3.5 Gy照射的BALB/C小鼠在照射后7、11和14 d治疗组的血小板数分别是对照组的1.15、1.15和1.16倍，7 d时差异有显著性。两组间白细胞数、红细胞数和血红蛋白相比差异无显著性。5.0 Gy照射的C57BL/6J小鼠照射后7～21 d血小板数均显著高于对照组，分别是对照组的1.53、1.81、1.71和1.20倍(见图1)。其他血细胞变化情况与BALB/C小鼠结果一致。
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图1 5.0 Gy 照射后C57BL/6J小鼠
PLT恢复情况
三、讨论
到目前为止，最成功的基因治疗方法是体外-体内法(ex vivo)，临床应用效果良好，但操作繁琐，对实验条件要求高。相比之下，体内基因直接注射(in vivo)更简捷易用，近年来取得了可喜的成果。尤其是采用质粒载体，与病毒载体相比有较多优点：①外源基因以非复制的游离形式存在，没有潜在的致体细胞突变危险；②无野生型或辅助性病毒引起感染的危险；③不需要通过包装细胞扩增；④无蛋白不会引起炎性反应或免疫反应。这些优点在应用于ARS等伴有机体基因组DNA损伤修复的疾病时更显重要。但是，由于质粒载体转染效率比病毒载体低许多，所以一直未达到实用水平。
近几年在延长质粒载体的表达时间和提高转染效率两个方面都有一定进展。如Tripathy等[1]将hEPO基因插入VR-1012质粒，正常BALB/C小鼠肌注10 μg，10 d后血细胞比积就升高到62%，峰值为66%，90 d时仍维持在62%左右。这说明采用质粒载体转移细胞因子基因可以有较长时间的表达，提示有一定应用前景。载体VR-1012改造后称作VR-1255，被认为是目前表达效率最高的基因直接转移载体[2]。尽管如此，转染效率低下还是一个必须解决的问题。虽然照射可以明显提高体外基因转染效率[3]，但体内如何尚未见报道。因此，只有体内促转染效果也非常显著，才有希望应用于急性放射病的治疗。作者正是从这个角度出发，对此进行了尝试。
, http://www.100md.com
实验结果中未看到直接转移hIL-6促进正常小鼠血小板生成的效果，可能有两方面原因：①IL-6不是巨核系特异的造血生长因子，作用没有TPO强，也许加大转基因剂量会观察到类似转移TPO基因的效果[4]。②转移的质粒纯度不高影响转染效率。与正常小鼠相反，在这两个品系的照射小鼠上均观察到有一定的治疗效果，无论是PLT还是WBC治疗组都比对照组有显著性升高，尤其是促PLT恢复效果更佳。5.0 Gy照射C57BL/6J小鼠在照射后11 d对照组动物血小板在最低值时，治疗组血小板出现平台性升高，这正是急性放射病抗出血时希望达到的最佳效果。从结果可以推测照射增加了转染效率，实现了hIL-6蛋白在体内的高表达，且增加转染效率的程度可能与一定的照射剂量相关。因此，作者认为可以应用本方法进行急性放射病的实验治疗研究。进一步转染TPO基因的质粒正在构建中。
另外，两个品系小鼠都有hIL-6表达说明，基因直接转移方法用于治疗目的时动物品系可能对治疗效果影响不大，可以按不同疾病模型的要求选择动物品系，而不必像制作核酸疫苗一样考虑品系对效果的影响。■
, 百拇医药
参考文献
[1]Tripathy SK,Svensson EC,Black HB,et al.Long-term expression of erythropoietin in the systemic circulation of mice after intramuscular injection of a plasmid DNA vector.Proc Natl Acad Sci USA,1996,93:10876-10880.
[2]Hartikka J,Sawdey M,Cornefert-Jensen F,et al.An improved plasmid DNA expression vector for direct injection into skeletal muscle.Human Gene Therapy,1996,7:1205-1217.
[3]Stevens CW,Zeng M,Cerniglia GJ,et al.Ionizing radiation greatly improves gene transfer efficiency in mammalian cells.Human Gene Therapy,1996,7:1727-1734.
[4]李景泰，赵建增，刘丽.血小板生成素cDNA体内传送促进血小板生成的研究.生物技术通讯，1997，8：150-151.
收稿日期:1999-02-06, 百拇医药