HOXB1基因转染对HL-60细胞视黄酸代谢和α-干扰素表达的影响
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37c医学网
作者：韦娜 糜漫天 郎海滨
单位：第三军医大学预防医学系营养卫生学教研室，重庆 400038
关键词：基因转染；同源盒基因B1；视黄酸代谢；IFNα表达；白血病细胞
第三军医大学学报001116
提 要：目的 探讨同源盒基因B1(HOXB1)转染对HL-60细胞视黄酸代谢和α-干扰素表达的影响。方法 采用脂质体介导的质粒转染、RT-PCR及高效液相色谱(HPLC)分析等方法进行分析检测。结果 2.5×10-7 mol/L全反式视黄酸(ATRA)能抑制HOXB1转染及非转染HL-60细胞的增殖，HOXB1的高表达能明显减弱ATRA对HL-60细胞的增殖抑制作用；HPLC分析显示，转染细胞ATRA的代谢减慢；ATRA处理能诱导HOXB1转染及未转染HL-60细胞IFNα表达，加用外源性IFNα能上调ATRA处理HL-60细胞IFNα基因表达。结论 HOXB1转染使HL-60细胞ATRA代谢受抑，ATRA增殖抑制作用减弱，外源性IFNα能上调HL-60细胞IFNα表达。
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中图法分类号：R733.71 文献标识码：A
文章编号：1000-5404(2000)11-1069-04
Effects of human Homeobox B1 gene transfection on retinoic acid metabolism and IFNα expression HL-60 cells
WEI Na,MI Man-tian,LANG Hai-bin
(Department of Nutrition and Food Hygiene,Third Military Medical Uuniversity,Chongqing 400038,China)
Abstract：Objective To investigate the effect of human Homeobox B1 gene (HOXB1) on retinoic acid (RA) metabolism and IFNα expression in promyelocyte leukemic cell line HL-60.Methods Plasmid transfection mediated by liposomal reagent ,high performance liquid chromatograph (HPLC) analysis and RT-PCR were used to analyze the metabolism and expression.Results All-trans RA (ATRA) of 2.5×10-7 mol/L inhibited the proliferation of HL-60 cells with or without HOXB1 gene transfection.High expressed HOXB1 could alleviate the inhibition.HPLC analysis revealed that HOXB1 transfection could reduce the metabolism of ATRA in HL-60 cells.Additionally,ATRA treatment could induce IFNα expression in HOXB1 gene transfection cells and non transfection cells,but the use of exogenous IFNαcombined with ATRA increased IFNα mRNA level in HL-60 cells.Conclusion The metabolism of ATRA is inhibited in HL-60 cells with HOXB1 gene transfection and its inhibitory effect on the cell proliferation is alleviated too.Exogenous IFNα can up-regulate the expression of IFNα in HOXB1 gene transfection HL-60 cells.
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Key words：gene transfer;Homeobox B1 gene;retinoic acid metabolism;IFNα expression;leukemic cells
在哺乳动物体内，同源盒基因(Homeobox genes,HOX)与胚胎发育和造血细胞生长关系密切。研究显示，HOXB1基因的异常表达与白血病细胞生成有关[1,2]。视黄酸(Retinoic acid,RA)作为一种有效的诱导分化剂，不但与胚胎发育、组织发生及器官的形成有关，还被广泛用于急性早幼粒细胞白血病(APL)的诱导分化治疗。有研究证明，HOX基因启动子区域有视黄酸反应元件(Retinoic acid response elements,RARE),RAR和RXR(RA胞内核受体)与相应配体结合而被活化成转录因子，后者与位于HOX基因启动子区域内的高亲和性顺式反应元件(RAREs)作用活化该基因表达，因此推测，RA对HOX基因表达的影响是其调节细胞分化的关键环节之一。本实验旨在探讨HL-60细胞HOXB1基因的异常高表达与胞内全反式视黄酸(ATRA)代谢、RA诱导分化治疗敏感性的相互关系。
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1 材料与方法
1.1 试剂
DOTAP转染试剂盒、质粒DNA快速抽提试剂盒、DNA片段快速回收试剂盒、TripureTM分离试剂均为宝灵曼公司产品，Rnase 抑制剂、Oligd(T)18、Taq酶、M-MLV逆转录酶、dNTP、Lambda DNA/EcoRⅠ+HindⅢmarker、GeneRulerTM 50 bp DNA Ladder为Sangon 公司产品，IFNα和β-actin PCR扩增引物由Sangon公司合成，全反式视黄酸(All-tran retinoic acid,ATRA)、TPA购自Sigma公司，人重组IFNα购于深圳先科制药有限公司。
1.2 主要仪器
PTC-100多功能PCR仪(MJ Research,Inc),Waters 810高效液相色谱仪，Farstar Plus 流式细胞仪,紫外透照仪及一次成像系统。
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1.3 细胞株的培养与实验分组
1.3.1细胞株 HL-60(人早幼粒细胞白血病)细胞株由中国科学院上海细胞所提供。细胞在含10%热灭活小牛血清的RPMI1640培养液中常规传代。
1.3.2 实验分组 实验设未转染对照细胞+ATRA组、空载体转染细胞+ATRA组、转染细胞+ATRA组、转染细胞+ATRA+IFN组和未转染细胞非ATRA处理组。ATRA处理细胞终浓度为2.5×10-7 mol/L。
1.4 质粒的提取、鉴定
HOXB1质粒由Evans M.R教授惠赠，将质粒转入大肠杆菌中扩增,而后用宝灵曼公司质粒提取试剂盒提取质粒,测量质粒浓度、纯度，行酶切鉴定。
1.5 脂质体介导的质粒转染
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取质粒溶液(HOXB1质粒浓度为0.12 μg/μl)25 μl(相当于HOXB1质粒3μg)与25 μl20 mmol/L HEPES(pH 7.4) 进行转染试验，详细步骤参见转染试剂盒。转染HL-60细胞(细胞密度为1.8×105个/ml) 37℃,5% CO2培养48 h，细胞生长接近融合时1∶4传代,当细胞生长至70%融合时600 μg/ml G418加入培养液中进行筛选。同时,以相同剂量G418处理未转染细胞和空载体对照组细胞6 d后,对照组及空载体组细胞均死亡,将G418浓度降至200 μg/ml维持筛选。
1.6 RNA提取与纯度鉴定
HOXB1质粒转染并经G418筛选获得稳定表达的HL-60细胞，一定剂量ATRA和IFNα处理3d后，用Promega公司TripureTM分离试剂提取3×106～5×106个细胞总RNA，详细步骤参见试剂盒说明书。以紫外分光光度计检测RNA含量及D260/D280比值，RNA保存于-70℃备用。
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1.7 逆转录及PCR扩增
1.7.1RNA提取及逆转录 上述方法提取的总RNA 3 μg65℃、5min后加入RNA酶抑制剂、dNTP、Oligd (T))及逆转录酶，反应总体为20 μl,37℃、1h进行逆转录，70℃、10 min灭活逆转录酶。
1.7.2 PCR扩增引物 IFNα上游引物为5'CAGTTCCAGAAGGCTCAA GC-3'，下游引物为5'-ACCTCCTGCATCATACAGGC-3'，扩增片段173 bp;Human β-actin上游引物为5'-TGGAATCCTGTGGCATCCATGAAA-C-3',下游引物为5'-TAAAACGCAGCTCAGTAACAGTCCG-3'，扩增片段348 bp。
1.7.3 PCR扩增条件 反应总体积50 μl,加入膜板DNA 0.75 μg，待扩增片段上游和下游引物终浓度为0.3 μmol/L，95℃变性5 min后加5.0 U Taq DNA聚合酶。扩增IFNα和β-actin片段反应参数为94℃ 1 min,61℃ 1 min,72℃ 2 min,共32个循环，最后一个循环后72℃延伸10 min。取4 μl扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，检查有无特异扩增带。
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1.8 细胞周期分析
2.5×10-7 mol/L ATRA处理细胞3 d,碘化丙啶染色后用流式细胞仪对DNA进行定量分析,再结合计算机软件推算出各细胞周期相细胞所占比例,并计算增殖指数(PI)。
PI= G0/G1+S/G0/G1+S+G2/M
1.9 HPLC分析ATRA代谢
各实验组以2.5×105个/ml细胞悬液2 ml加入到24孔培养板中，2.5×10-7 mol/L ATRA处理细胞3 d,同时设未处理组对照。收集细胞及培养液，反复冻溶裂解细胞，15 000×g、5 min,吸取上清液，用2∶1(V/V)氯仿/甲醇加入到上清液中，充分混匀，静置1 h,吸取下层氯仿层，避光条件下置于弱氮气下吹干，以200 μl氯仿定容后采用反相高效液相色谱法检测ATRA含量，间接反应ATRA代谢，结果以nmol/L表示。
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2 结果
2.1 HOXB1转染对HL-60细胞ATRA代谢的影响
HPLC分析显示见图1、2，单纯HOXB1转染及转染细胞加入重组IFNα均能抑制HL-60细胞ATRA代谢，尤以单纯HOXB1转染作用明显。
图1 HL-60 细胞全反式视黄酸的HPLC分析图谱
Fig 1 HPLC analysis of ATRA in HL-60 cells
图2 HOXB1质粒转染对HL-60细胞ATRA代谢的影响
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Fig 2 Effects of HOXB1 transfection on the metabolism of
ATRA in HL-60 cells
A:Control;B:Control vector;C:Hox transfection;D:Hox transfection+IPN (A、B、C、D) ATRA treated for 3 days);E:Negative control (without ATRA)
2.2 HOXB1转染对HL-60细胞增殖能力的影响及ATRA处理的效应
2.5×10-7 mol/L ATRA能显著抑制HOXB1转染及未转染HL-60细胞的增殖，使其受阻于G0/G1期，HOXB1的高表达可使ATRA增殖抑制作用减弱,HOXB1转染细胞加用外源性重组IFNα后对ATRA增殖抑制的拮抗更为明显，见表1。
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表1 HOXB1基因转染对HL-60细胞增殖周期的影响
Tab 1 Effect of HoxB1 gene transfection on the cell
cycle in HL-60 cells Group
G0/G1
S
G2/M
PI
Control
86.7
8.2
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5.1
0.133
Vector control
84.6
11.3
4.1
0.154
HoxB1
82.2
12.2
5.6
0.178
HoxB1+ IFN
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77.6
15.9
6.5
0.224
*Negative control
57.0
34.7
8.4
0.431
Above data represented results of 3 samples,*：without ATRA treatment
2.3 HOXB1转染对HL-60细胞IFNα表达的影响及ATRA处理的效应
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本研究采用RT-PCR 法未检测到野生型HL-60细胞IFNα的表达，但ATRA 处理能诱导HOXB1转染及未转染HL-60细胞IFNα表达，外源性重组IFNα能明显增强ATRA处理HL-60细胞IFNα表达，见图3。
图3 HL-60细胞 IFNα mRNA 逆转录PCR分析
Fig 3 RT-PCR analysis of IFNα mRNA in plasmid
transfection HL-60 cells
1:DNA marker； 2:Untransfected cells +ATRA；3:Control vector +ATRA；4:Transfected cells+ATRA；5:Transfected cell+IFNα+ATRA； 6:Negative cells(with no ATRA in untransfected cells)
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3 讨论
HOX基因在调节造血干/祖细胞的发育方面起重要作用[3]。有研究显示，HOXB6和HOXB9 mRNA在HL-60细胞中低水平表达，用全反式视黄酸处理3 d，HOXB6和HOXB9mRNA表达增多。此外，HOXB8的异常表达能抑制DMSO、G-CSF诱导的HL-60细胞及32Dc13造血前体细胞的分化成熟，以上研究提示，HOX基因不但参与正常的造血调控，还与白血病的形成、诱导分化治疗敏感性密切相关[4，5]。
目前RA已被广泛用于白血病、尤其是急性早幼粒细胞白血病(APL)的诱导分化治疗，但单用RA治疗获得完全临床缓解难以维持，且RA治疗过的病人复发后会出现对RA的抵抗。本实验结果显示，HOXB1的高表达可明显抑制HL-60细胞ATRA代谢、使ATRA增殖抑制作用减弱,HOXB1转染细胞加用外源性重组IFNα后对ATAR代谢的影响与单纯转染组无显著差异，但对ATRA的增殖抑制的拮抗则更明显。有研究认为，RA诱导分化的抵抗与RA加速代谢为RA的极性代谢物4-OXO-RA，致使患者血浆RA水平快速降低有关。但近来已证实4-OXO-RA能以RA相同的亲和力与RARβ结合，提示RA的极性代谢物可能在RAR介导的信号传递过程中也起重要作用，RA代谢物在介导RA功能方面是有活性的[6]。本研究RA代谢减慢后，其对细胞的增殖抑制作用减弱可能与RA极性代谢产物降低有关。本实验还显示，野生型HL-60细胞不表达IFNα，ATRA处理能诱导HOXB1转染及未转染 HL-60细胞IFNα表达，外源性重组IFNα能明显增强ATRA处理HL-60细胞IFNα表达。以往也发现RA可诱导NB4细胞合成IFNα，且IFNα能协同RA诱导细胞增殖抑制、促进细胞分化成熟[7]，本研究加入外源性IFNα后不但未增强RA对HL-60细胞的增殖抑制，反而减弱其效应，原因可能与IFNα对细胞功能的双向调节作用或使用剂量有关。
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有研究提示，RA能通过3条信号传导通路控制HOXB1基因的表达，其中第1、第2条通路以活化HOXB1启动子5'或3'RARE发挥作用，第3条通路为HOXB1基因启动子邻近区域的一个自动调节位点调节，三者间建立了RA诱导HOXB1基因表达的机制[8]。野生型HL-60细胞是否有HOXB1基因表达尚不清楚，本实验将外源性HOXB1介导入HL-60细胞，使其在该细胞中稳定的表达，结果证实HOXB1在HL-60细胞中的异常表达能干扰ATRA的代谢，降低ATRA生物学功效。这种作用是HOXB1大量表达，影响了控制ATRA代谢的细胞色素氧化酶p450(CYP)表达及活性，还是大量ATRA与HOXB1靶基因RARE结合而得以保留尚需进一步探讨。
基金项目：全军“九五”科研基金资助项目(98M093)
作者简介：韦娜(1973-)，女，重庆市南川县人，实验师，主要从事营养与肿瘤方面的研究，发表论文8篇。
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参考文献：
[1]Michael A,Bremmer P.Sequence characterisation and expression of homeobox HOX A7 in the multi-potential erythroleukaemic cell line TF-1[J].Biochim Biophys Acta,1998,1 442(2-3):329-333.
[2]Ognra T,Evans R M.Retinoic acid-triggered cascade of HOXB1 gene activation[J].Proc Natl Acad Sci USA,1995,92(2):387-391.
[3]Shen W F,Largman C,Lowney P,et al.Lineage-restricted expression in homeobox-containing genes in human hematopoietic cell line[J].Proc Natl Acad Sci USA,1989,86(21):8 536-8 540.
, 百拇医药
[4]Ohnishi K,Tobita T,Sinjo K,et al.Modulation of homeobox B6 and B9 genes expression in human leukemia cell lines during myelomonocytic differentiation[J].Leuk Lymphoma,1998,31(5-6):599-608.
[5]Shimamoto T,Ohyashiki K,Toyama K,et al.Homeobox genes in hematopoiesis and leukemogenesis[J].Int J Hematol,1998,67(4):339-350.
[6]Takatsuka J,Takahashi N,Luigi M,et al.Retinoic acid metabolism and inhibition of cell proliferation:An unexpected liaison[J].Cancer Res,1996,56(4):675-678.
, 百拇医药
[7]Chelbi-Alix M K,Pelicano L.Retinoic acid and interferon signaling cross talk in normal and RA-resistant APL cells[J].Leukemia,1999,13(8):1167-1174.
[8]Ognra T,Evans R M.Evidence for two distinct retinoic acid response pathways for HOXB1 gene regulation[J].Proc Natl Acad Sci USA,1995,92(2):392-396.
收稿日期：2000-02-21
修回日期：2000-05-15, http://www.100md.com
单位：第三军医大学预防医学系营养卫生学教研室，重庆 400038
关键词：基因转染；同源盒基因B1；视黄酸代谢；IFNα表达；白血病细胞
第三军医大学学报001116
提 要：目的 探讨同源盒基因B1(HOXB1)转染对HL-60细胞视黄酸代谢和α-干扰素表达的影响。方法 采用脂质体介导的质粒转染、RT-PCR及高效液相色谱(HPLC)分析等方法进行分析检测。结果 2.5×10-7 mol/L全反式视黄酸(ATRA)能抑制HOXB1转染及非转染HL-60细胞的增殖，HOXB1的高表达能明显减弱ATRA对HL-60细胞的增殖抑制作用；HPLC分析显示，转染细胞ATRA的代谢减慢；ATRA处理能诱导HOXB1转染及未转染HL-60细胞IFNα表达，加用外源性IFNα能上调ATRA处理HL-60细胞IFNα基因表达。结论 HOXB1转染使HL-60细胞ATRA代谢受抑，ATRA增殖抑制作用减弱，外源性IFNα能上调HL-60细胞IFNα表达。
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中图法分类号：R733.71 文献标识码：A
文章编号：1000-5404(2000)11-1069-04
Effects of human Homeobox B1 gene transfection on retinoic acid metabolism and IFNα expression HL-60 cells
WEI Na,MI Man-tian,LANG Hai-bin
(Department of Nutrition and Food Hygiene,Third Military Medical Uuniversity,Chongqing 400038,China)
Abstract：Objective To investigate the effect of human Homeobox B1 gene (HOXB1) on retinoic acid (RA) metabolism and IFNα expression in promyelocyte leukemic cell line HL-60.Methods Plasmid transfection mediated by liposomal reagent ,high performance liquid chromatograph (HPLC) analysis and RT-PCR were used to analyze the metabolism and expression.Results All-trans RA (ATRA) of 2.5×10-7 mol/L inhibited the proliferation of HL-60 cells with or without HOXB1 gene transfection.High expressed HOXB1 could alleviate the inhibition.HPLC analysis revealed that HOXB1 transfection could reduce the metabolism of ATRA in HL-60 cells.Additionally,ATRA treatment could induce IFNα expression in HOXB1 gene transfection cells and non transfection cells,but the use of exogenous IFNαcombined with ATRA increased IFNα mRNA level in HL-60 cells.Conclusion The metabolism of ATRA is inhibited in HL-60 cells with HOXB1 gene transfection and its inhibitory effect on the cell proliferation is alleviated too.Exogenous IFNα can up-regulate the expression of IFNα in HOXB1 gene transfection HL-60 cells.
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Key words：gene transfer;Homeobox B1 gene;retinoic acid metabolism;IFNα expression;leukemic cells
在哺乳动物体内，同源盒基因(Homeobox genes,HOX)与胚胎发育和造血细胞生长关系密切。研究显示，HOXB1基因的异常表达与白血病细胞生成有关[1,2]。视黄酸(Retinoic acid,RA)作为一种有效的诱导分化剂，不但与胚胎发育、组织发生及器官的形成有关，还被广泛用于急性早幼粒细胞白血病(APL)的诱导分化治疗。有研究证明，HOX基因启动子区域有视黄酸反应元件(Retinoic acid response elements,RARE),RAR和RXR(RA胞内核受体)与相应配体结合而被活化成转录因子，后者与位于HOX基因启动子区域内的高亲和性顺式反应元件(RAREs)作用活化该基因表达，因此推测，RA对HOX基因表达的影响是其调节细胞分化的关键环节之一。本实验旨在探讨HL-60细胞HOXB1基因的异常高表达与胞内全反式视黄酸(ATRA)代谢、RA诱导分化治疗敏感性的相互关系。
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1 材料与方法
1.1 试剂
DOTAP转染试剂盒、质粒DNA快速抽提试剂盒、DNA片段快速回收试剂盒、TripureTM分离试剂均为宝灵曼公司产品，Rnase 抑制剂、Oligd(T)18、Taq酶、M-MLV逆转录酶、dNTP、Lambda DNA/EcoRⅠ+HindⅢmarker、GeneRulerTM 50 bp DNA Ladder为Sangon 公司产品，IFNα和β-actin PCR扩增引物由Sangon公司合成，全反式视黄酸(All-tran retinoic acid,ATRA)、TPA购自Sigma公司，人重组IFNα购于深圳先科制药有限公司。
1.2 主要仪器
PTC-100多功能PCR仪(MJ Research,Inc),Waters 810高效液相色谱仪，Farstar Plus 流式细胞仪,紫外透照仪及一次成像系统。
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1.3 细胞株的培养与实验分组
1.3.1细胞株 HL-60(人早幼粒细胞白血病)细胞株由中国科学院上海细胞所提供。细胞在含10%热灭活小牛血清的RPMI1640培养液中常规传代。
1.3.2 实验分组 实验设未转染对照细胞+ATRA组、空载体转染细胞+ATRA组、转染细胞+ATRA组、转染细胞+ATRA+IFN组和未转染细胞非ATRA处理组。ATRA处理细胞终浓度为2.5×10-7 mol/L。
1.4 质粒的提取、鉴定
HOXB1质粒由Evans M.R教授惠赠，将质粒转入大肠杆菌中扩增,而后用宝灵曼公司质粒提取试剂盒提取质粒,测量质粒浓度、纯度，行酶切鉴定。
1.5 脂质体介导的质粒转染
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取质粒溶液(HOXB1质粒浓度为0.12 μg/μl)25 μl(相当于HOXB1质粒3μg)与25 μl20 mmol/L HEPES(pH 7.4) 进行转染试验，详细步骤参见转染试剂盒。转染HL-60细胞(细胞密度为1.8×105个/ml) 37℃,5% CO2培养48 h，细胞生长接近融合时1∶4传代,当细胞生长至70%融合时600 μg/ml G418加入培养液中进行筛选。同时,以相同剂量G418处理未转染细胞和空载体对照组细胞6 d后,对照组及空载体组细胞均死亡,将G418浓度降至200 μg/ml维持筛选。
1.6 RNA提取与纯度鉴定
HOXB1质粒转染并经G418筛选获得稳定表达的HL-60细胞，一定剂量ATRA和IFNα处理3d后，用Promega公司TripureTM分离试剂提取3×106～5×106个细胞总RNA，详细步骤参见试剂盒说明书。以紫外分光光度计检测RNA含量及D260/D280比值，RNA保存于-70℃备用。
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1.7 逆转录及PCR扩增
1.7.1RNA提取及逆转录 上述方法提取的总RNA 3 μg65℃、5min后加入RNA酶抑制剂、dNTP、Oligd (T))及逆转录酶，反应总体为20 μl,37℃、1h进行逆转录，70℃、10 min灭活逆转录酶。
1.7.2 PCR扩增引物 IFNα上游引物为5'CAGTTCCAGAAGGCTCAA GC-3'，下游引物为5'-ACCTCCTGCATCATACAGGC-3'，扩增片段173 bp;Human β-actin上游引物为5'-TGGAATCCTGTGGCATCCATGAAA-C-3',下游引物为5'-TAAAACGCAGCTCAGTAACAGTCCG-3'，扩增片段348 bp。
1.7.3 PCR扩增条件 反应总体积50 μl,加入膜板DNA 0.75 μg，待扩增片段上游和下游引物终浓度为0.3 μmol/L，95℃变性5 min后加5.0 U Taq DNA聚合酶。扩增IFNα和β-actin片段反应参数为94℃ 1 min,61℃ 1 min,72℃ 2 min,共32个循环，最后一个循环后72℃延伸10 min。取4 μl扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，检查有无特异扩增带。
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1.8 细胞周期分析
2.5×10-7 mol/L ATRA处理细胞3 d,碘化丙啶染色后用流式细胞仪对DNA进行定量分析,再结合计算机软件推算出各细胞周期相细胞所占比例,并计算增殖指数(PI)。
PI= G0/G1+S/G0/G1+S+G2/M
1.9 HPLC分析ATRA代谢
各实验组以2.5×105个/ml细胞悬液2 ml加入到24孔培养板中，2.5×10-7 mol/L ATRA处理细胞3 d,同时设未处理组对照。收集细胞及培养液，反复冻溶裂解细胞，15 000×g、5 min,吸取上清液，用2∶1(V/V)氯仿/甲醇加入到上清液中，充分混匀，静置1 h,吸取下层氯仿层，避光条件下置于弱氮气下吹干，以200 μl氯仿定容后采用反相高效液相色谱法检测ATRA含量，间接反应ATRA代谢，结果以nmol/L表示。
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2 结果
2.1 HOXB1转染对HL-60细胞ATRA代谢的影响
HPLC分析显示见图1、2，单纯HOXB1转染及转染细胞加入重组IFNα均能抑制HL-60细胞ATRA代谢，尤以单纯HOXB1转染作用明显。
图1 HL-60 细胞全反式视黄酸的HPLC分析图谱
Fig 1 HPLC analysis of ATRA in HL-60 cells
图2 HOXB1质粒转染对HL-60细胞ATRA代谢的影响
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Fig 2 Effects of HOXB1 transfection on the metabolism of
ATRA in HL-60 cells
A:Control;B:Control vector;C:Hox transfection;D:Hox transfection+IPN (A、B、C、D) ATRA treated for 3 days);E:Negative control (without ATRA)
2.2 HOXB1转染对HL-60细胞增殖能力的影响及ATRA处理的效应
2.5×10-7 mol/L ATRA能显著抑制HOXB1转染及未转染HL-60细胞的增殖，使其受阻于G0/G1期，HOXB1的高表达可使ATRA增殖抑制作用减弱,HOXB1转染细胞加用外源性重组IFNα后对ATRA增殖抑制的拮抗更为明显，见表1。
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表1 HOXB1基因转染对HL-60细胞增殖周期的影响
Tab 1 Effect of HoxB1 gene transfection on the cell
cycle in HL-60 cells Group
G0/G1
S
G2/M
PI
Control
86.7
8.2
, 百拇医药
5.1
0.133
Vector control
84.6
11.3
4.1
0.154
HoxB1
82.2
12.2
5.6
0.178
HoxB1+ IFN
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77.6
15.9
6.5
0.224
*Negative control
57.0
34.7
8.4
0.431
Above data represented results of 3 samples,*：without ATRA treatment
2.3 HOXB1转染对HL-60细胞IFNα表达的影响及ATRA处理的效应
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本研究采用RT-PCR 法未检测到野生型HL-60细胞IFNα的表达，但ATRA 处理能诱导HOXB1转染及未转染HL-60细胞IFNα表达，外源性重组IFNα能明显增强ATRA处理HL-60细胞IFNα表达，见图3。
图3 HL-60细胞 IFNα mRNA 逆转录PCR分析
Fig 3 RT-PCR analysis of IFNα mRNA in plasmid
transfection HL-60 cells
1:DNA marker； 2:Untransfected cells +ATRA；3:Control vector +ATRA；4:Transfected cells+ATRA；5:Transfected cell+IFNα+ATRA； 6:Negative cells(with no ATRA in untransfected cells)
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3 讨论
HOX基因在调节造血干/祖细胞的发育方面起重要作用[3]。有研究显示，HOXB6和HOXB9 mRNA在HL-60细胞中低水平表达，用全反式视黄酸处理3 d，HOXB6和HOXB9mRNA表达增多。此外，HOXB8的异常表达能抑制DMSO、G-CSF诱导的HL-60细胞及32Dc13造血前体细胞的分化成熟，以上研究提示，HOX基因不但参与正常的造血调控，还与白血病的形成、诱导分化治疗敏感性密切相关[4，5]。
目前RA已被广泛用于白血病、尤其是急性早幼粒细胞白血病(APL)的诱导分化治疗，但单用RA治疗获得完全临床缓解难以维持，且RA治疗过的病人复发后会出现对RA的抵抗。本实验结果显示，HOXB1的高表达可明显抑制HL-60细胞ATRA代谢、使ATRA增殖抑制作用减弱,HOXB1转染细胞加用外源性重组IFNα后对ATAR代谢的影响与单纯转染组无显著差异，但对ATRA的增殖抑制的拮抗则更明显。有研究认为，RA诱导分化的抵抗与RA加速代谢为RA的极性代谢物4-OXO-RA，致使患者血浆RA水平快速降低有关。但近来已证实4-OXO-RA能以RA相同的亲和力与RARβ结合，提示RA的极性代谢物可能在RAR介导的信号传递过程中也起重要作用，RA代谢物在介导RA功能方面是有活性的[6]。本研究RA代谢减慢后，其对细胞的增殖抑制作用减弱可能与RA极性代谢产物降低有关。本实验还显示，野生型HL-60细胞不表达IFNα，ATRA处理能诱导HOXB1转染及未转染 HL-60细胞IFNα表达，外源性重组IFNα能明显增强ATRA处理HL-60细胞IFNα表达。以往也发现RA可诱导NB4细胞合成IFNα，且IFNα能协同RA诱导细胞增殖抑制、促进细胞分化成熟[7]，本研究加入外源性IFNα后不但未增强RA对HL-60细胞的增殖抑制，反而减弱其效应，原因可能与IFNα对细胞功能的双向调节作用或使用剂量有关。
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有研究提示，RA能通过3条信号传导通路控制HOXB1基因的表达，其中第1、第2条通路以活化HOXB1启动子5'或3'RARE发挥作用，第3条通路为HOXB1基因启动子邻近区域的一个自动调节位点调节，三者间建立了RA诱导HOXB1基因表达的机制[8]。野生型HL-60细胞是否有HOXB1基因表达尚不清楚，本实验将外源性HOXB1介导入HL-60细胞，使其在该细胞中稳定的表达，结果证实HOXB1在HL-60细胞中的异常表达能干扰ATRA的代谢，降低ATRA生物学功效。这种作用是HOXB1大量表达，影响了控制ATRA代谢的细胞色素氧化酶p450(CYP)表达及活性，还是大量ATRA与HOXB1靶基因RARE结合而得以保留尚需进一步探讨。
基金项目：全军“九五”科研基金资助项目(98M093)
作者简介：韦娜(1973-)，女，重庆市南川县人，实验师，主要从事营养与肿瘤方面的研究，发表论文8篇。
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参考文献：
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收稿日期：2000-02-21
修回日期：2000-05-15, http://www.100md.com