反义bcl-2基因转染对单核白血病细胞存活及化疗耐受能力的影响
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37c医学网
作者：何凤田 朱锡华 黄云辉
单位：何凤田 朱锡华 黄云辉(第三军医大学免疫学教研室，重庆 400038)
关键词：bcl-2；反义核酸；U937细胞系；化疗药物
癌症000417
【摘要】目的：探讨bcl-2反义核酸在单核白血病细胞系U937细胞中的作用，以丰富bcl-2及其反义核酸调控肿瘤细胞凋亡的资料。方法：将反义bcl-2基因表达载体pLXSN/as-bcl-2转染于U937细胞，建立U937/as-bcl-2细胞模型，利用流式细胞技术检测模型细胞bcl-2的表达水平；通过细胞计数观察模型细胞在正常培养条件下和有化疗药物Ara-C或三尖杉酯碱存在时的生长和存活特性变化。结果：①模型细胞的bcl-2蛋白表达水平明显下降。②模型细胞在正常培养条件下的生长和存活表型无明显改变。③在Ara-C或三尖杉酯碱存在的情况下，模型细胞的存活率较对照细胞者明显下降。结论：①单独反义bcl-2基因转染可明显抑制U937细胞bcl-2的表达，但对细胞在正常条件下的生长和存活表型无明显影响。②反义bcl-2基因转染可增加U937细胞对化疗药物的敏感性。
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中图分类号：Q753；Q733.7 文献标识码：A 文章编号：1000-467X(2000)04-0344-03
Influence of antisense bcl- 2 gene on survival of mononuclear leukemia cell U937 and the sensitivity of the cell to chemotherapeutic drugs
HE Feng- tian ZHU Xi- hua HUANG Yun- hui
(Department of Immunology, The Third Military Medical University, Chongqing 400038, P. R. China)
【Abstract】 Objective： To enrich the data of tumor cell apoptosis regulated by bcl- 2 and antisense bcl- 2 through studying the role of antisense bcl- 2 in mononuclear leukemia cell line U937. Methods： A U937 cell model (U937/as- bcl- 2) was established by transferring the antisense bcl- 2 expression vector pLXSN/as- bc1- 2 into U937 cell. bcl- 2 expression in the model cell was detected by fluorescence- activated cell sorter. The model cell growth and survival were analyzed by counting the numbers of total and survival cells in normal culture condition or in the presence of Ara- C or harringtonine. Results： ① bcl- 2 expression in the model cell significantly decreased. ② The model cell had a normal growth and survival in normal culture condition.③ The percentage of the survival model cells significantly decreased in the presence of Ara- C or harringtonine. Conclusions： ① Antisense bcl- 2 gene transfer alone can significantly suppress bcl- expression in U937 cells, but it had no obvious effect on the cell growth and survival in normal culture condition. ② Antisense bcl- 2 gene transfer can increase the sensitivity of U937 cell to chemotherapeutic drugs.
, 百拇医药
Key words
Key words： bcl- 2; Antisense nucleic acid; U937 cell line; Chemotherapeutic drug
诸多研究表明，bcl-2作为一种重要凋亡抑制基因，与多种血液、淋巴系统恶性肿瘤的发生和耐药性形成等密切相关。因此，很多学者试图利用bcl-2反义核酸有效抑制bcl-2表达，以达到诱导和加速肿瘤细胞凋亡的目的。目前，这方面的研究已在抑制B细胞肿瘤方面取得了一些成果〔1～3〕，但关于bcl-2反义核酸在其它表达bcl-2的肿瘤细胞中的作用研究较少。因此，有必要探讨bcl-2反义核酸在不同靶细胞中的作用是否具有普遍性，以便寻找更有效的方法治疗bcl-2相关肿瘤。U937细胞不同于B细胞性肿瘤细胞，它是一单核白血病细胞系，能中等水平地表达bcl-2。鉴于此，本文将反义bcl-2基因转染于U937细胞，建立了bcl-2表达受抑制的U937细胞模型，观察了模型细胞生长和存活能力的变化以及对两种化疗药物敏感性的改变，从而丰富了bcl-2及其反义核酸调控肿瘤细胞凋亡的资料。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1主要材料
U937、PA317及NIH/3T3细胞均为本室保存，反义bcl-2基因表达载体pLXSN/as-bcl-2为本室构建〔4〕。G418(Gibco产品)，鼠抗人bcl-2单抗(SantaCruz产品)，FITC标记的羊抗鼠IgG(Jackson产品)，Ara-C和三尖杉酯碱均为国产。
1.2U937/as-bcl-2细胞模型的建立
用电穿孔法将反义bcl-2基因表达载体pLXSN/as-bcl-2转染于PA317包装细胞，筛选出G418抗性克隆，扩增培养，收集上清，利用NIH/3T3细胞测定病毒滴度。用高滴度病毒上清与U937细胞共培养20小时后，以有限稀释法筛选出G418抗性克隆，命名为U937/as-bcl-2。同法筛选出含空载体pLXSN的U937细胞，命名为U937/neo。随机选4个U937/as-bcl-2细胞克隆和一个U937/neo克隆扩增培养，利用流式细胞技术检测bcl-2特异性的细胞平均荧光强度(MIF)，判断bcl-2表达受抑情况。鼠抗人bcl-2单抗按1∶80稀释，FITC标记的羊抗鼠IgG按1∶100稀释。实验以U937细胞作对照，计算U937/as-bcl-2和U937/neo细胞的MIF与对照细胞MIF的比值。阴性对照为U937细胞不加鼠抗人bcl-2单抗，代之以小鼠IgG。最后选出bcl-2表达受抑程度最高的一个U937/as-bcl-2克隆进行后续实验。
, 百拇医药
1.3U937/as-bcl-2细胞的一般生长特性变化
将U937/as-bcl-2、U937/neo和U937细胞调成1×105/ml细胞悬液，接种于96孔板，0.2ml/孔。然后在正常培养条件下连续6天，每隔24小时，取部分孔中的细胞经台盼蓝染色后计数，绘制细胞的时间变化曲线，计算细胞存活率。实验设三个平行孔，取其平均值。
1.4U937/as-bcl-2细胞对化疗药物敏感性的变化
将三种细胞以4×105/ml接种于96孔板，0.15ml/孔，然后加入含不同浓度Ara-C(或三尖杉酯碱)的培养基50μl，混匀培养24小时后，取细胞计数，计算存活细胞百分率。实验设三复孔，取其平均值。
2 结果
2.1U937/as-bcl-2细胞的bcl-2表达水平变化
, 百拇医药
流式细胞仪分析结果如下：4个克隆来源的U937/as-bcl-2细胞的MIF分别为对照细胞MIF的65.4%、58.1%、46.3%、42.8%(各P<0.05。用最后一个克隆作为模型细胞进行后续实验)；而U937/neo细胞的MIF为对照细胞MIF的100.4%(P>值均0.05)。这一结果表明反义bcl-2基因转染可明显抑制细胞bcl-2蛋白的表达。
2.2U937/as-bc1-2细胞生长及存活情况
在连续六天检测中，U937/as-bcl-2、U937/neo和U937细胞在各时相点的细胞数及存活率间均无明显差异(各P值均>0.05)，说明各细胞在增殖速度和存活能力方面无明显差异，表明在U937细胞，单独反义bcl-2基因转染对细胞在正常培养条件下的生长和存活表型无明显影响。
2.3U937/as-bcl-2细胞对化疗药物耐受能力的改变
, 百拇医药
如图1、2所示，在不同浓度Ara-C和三尖杉酯碱作用24小时后，U937/as-bcl-2细胞在各浓度点的存活率均较U937/neo和U937细胞者明显下降(各P<0.05)，而后两者在各浓度点的存活率间均无明显差异(各P值均>值均0.05)，表明反义bcl-2基因转染使U937细胞对Ara-C和三尖杉酯碱的敏感性增加。
图1受Ara-C处理的U937/as-bcl-2细胞的存活情况各细胞在不同浓度Ara-C作用24小时后，在各浓度点，U937/as-bcl-2细胞的存活率均较另两细胞明显降低。图中标注点代表均值。
图2受三尖杉酯碱处理的U937/as-bcl-2细胞的存活情况各细胞在不同浓度三尖杉酯碱作用24小时后，在各浓度点，U937/as-bcl-2细胞的存活率均较另两细胞者明显降低。图中标注点代表均值。
, 百拇医药
3 讨论
鉴于bcl-2与多种恶性肿瘤的发生和耐药性形成等密切相关以及bcl-2反义核酸在抑制B细胞肿瘤方面已取得的一些成果[1～3]，本文试图探讨bcl-2反义核酸在不同靶细胞中的作用是否具有普遍性，以丰富bcl-2及其反义核酸调控肿瘤细胞凋亡的资料。为此，我们将反义bcl-2基因转染于单核白血病细胞系U937细胞，建立了bcl-2表达受抑的U937细胞模型，观察了模型细胞的一般生长和存活表型以及对两化疗药物(Ara-C和三尖杉酯碱)敏感性的变化，结果表明：第一，单独反义bcl-2基因转染虽可有效抑制U937细胞bcl-2蛋白的表达，但对细胞在正常培养条件下的生长和存活能力无明显影响，这与以往用B细胞性肿瘤细胞进行研究时所取得的结果不相一致(在B细胞性肿瘤，单独bcl-2反义核酸即可抑制瘤细胞生长和致瘤细胞死亡)，说明单独bcl-2反义核酸在不同靶细胞中的作用结果并不完全相同。关于产生这种结果不一的原因尚不清楚，推测可能与bcl-2在不同类型细胞中所起作用的比重不同有关。因此，对单独bcl-2反义核酸在不同肿瘤靶细胞中的作用地位应进行正确评价。第二，反义bcl-2基因转染增加了U937细胞对Ara-C和三尖杉酯碱的敏感性。这就提示：在U937细胞，单独反义bcl-2基因转染虽不明显影响细胞生长和存活表型，但可使某些激发细胞死亡信号的刺激阈值降低。也就是说，bcl-2反义核酸与其它某些促细胞死亡因素间可能存在协同作用。因此，在治疗bcl-2相关肿瘤时，若能联合使用bcl-2反义核酸和其它诱导细胞死亡制剂，或许可使肿瘤细胞对后者的敏感性增加，从而提高治疗效果。
, 百拇医药
通讯作者：何凤田 Tel:86-23-68752234
[参考文献]
[1]Morelli S, Delia D, Capaccioli S, et al. The antisense bcl- 2- IgH transcript is an optimal target for synthetic oligonucleotides [J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1997,94(15)： 8150～ 8155.
[2]Ho PT, Parkinson DR. Antisense oligonucleiotides as therapeutic for malignant diseases [J]. Semin Oncol, 1997， 24(2)： 187～ 202.
[3]Tormo M, Tari AM, McDonnell TJ, et al. Apoptotic induction in transformed follicular lymphoma cells by bcl- 2 downregulation [J]. Leuk Lymphoma, 1998,30(3～ 4)： 367～ 379.
[4] 何凤田，朱锡华.人类bcl-2cDNA在NIH/3T3细胞中的表达[J].免疫学杂志，1997，13(4)：227～229.
收稿日期：1999-04-02
修回日期：1999-05-25, 百拇医药
单位：何凤田 朱锡华 黄云辉(第三军医大学免疫学教研室，重庆 400038)
关键词：bcl-2；反义核酸；U937细胞系；化疗药物
癌症000417
【摘要】目的：探讨bcl-2反义核酸在单核白血病细胞系U937细胞中的作用，以丰富bcl-2及其反义核酸调控肿瘤细胞凋亡的资料。方法：将反义bcl-2基因表达载体pLXSN/as-bcl-2转染于U937细胞，建立U937/as-bcl-2细胞模型，利用流式细胞技术检测模型细胞bcl-2的表达水平；通过细胞计数观察模型细胞在正常培养条件下和有化疗药物Ara-C或三尖杉酯碱存在时的生长和存活特性变化。结果：①模型细胞的bcl-2蛋白表达水平明显下降。②模型细胞在正常培养条件下的生长和存活表型无明显改变。③在Ara-C或三尖杉酯碱存在的情况下，模型细胞的存活率较对照细胞者明显下降。结论：①单独反义bcl-2基因转染可明显抑制U937细胞bcl-2的表达，但对细胞在正常条件下的生长和存活表型无明显影响。②反义bcl-2基因转染可增加U937细胞对化疗药物的敏感性。
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中图分类号：Q753；Q733.7 文献标识码：A 文章编号：1000-467X(2000)04-0344-03
Influence of antisense bcl- 2 gene on survival of mononuclear leukemia cell U937 and the sensitivity of the cell to chemotherapeutic drugs
HE Feng- tian ZHU Xi- hua HUANG Yun- hui
(Department of Immunology, The Third Military Medical University, Chongqing 400038, P. R. China)
【Abstract】 Objective： To enrich the data of tumor cell apoptosis regulated by bcl- 2 and antisense bcl- 2 through studying the role of antisense bcl- 2 in mononuclear leukemia cell line U937. Methods： A U937 cell model (U937/as- bcl- 2) was established by transferring the antisense bcl- 2 expression vector pLXSN/as- bc1- 2 into U937 cell. bcl- 2 expression in the model cell was detected by fluorescence- activated cell sorter. The model cell growth and survival were analyzed by counting the numbers of total and survival cells in normal culture condition or in the presence of Ara- C or harringtonine. Results： ① bcl- 2 expression in the model cell significantly decreased. ② The model cell had a normal growth and survival in normal culture condition.③ The percentage of the survival model cells significantly decreased in the presence of Ara- C or harringtonine. Conclusions： ① Antisense bcl- 2 gene transfer alone can significantly suppress bcl- expression in U937 cells, but it had no obvious effect on the cell growth and survival in normal culture condition. ② Antisense bcl- 2 gene transfer can increase the sensitivity of U937 cell to chemotherapeutic drugs.
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Key words
Key words： bcl- 2; Antisense nucleic acid; U937 cell line; Chemotherapeutic drug
诸多研究表明，bcl-2作为一种重要凋亡抑制基因，与多种血液、淋巴系统恶性肿瘤的发生和耐药性形成等密切相关。因此，很多学者试图利用bcl-2反义核酸有效抑制bcl-2表达，以达到诱导和加速肿瘤细胞凋亡的目的。目前，这方面的研究已在抑制B细胞肿瘤方面取得了一些成果〔1～3〕，但关于bcl-2反义核酸在其它表达bcl-2的肿瘤细胞中的作用研究较少。因此，有必要探讨bcl-2反义核酸在不同靶细胞中的作用是否具有普遍性，以便寻找更有效的方法治疗bcl-2相关肿瘤。U937细胞不同于B细胞性肿瘤细胞，它是一单核白血病细胞系，能中等水平地表达bcl-2。鉴于此，本文将反义bcl-2基因转染于U937细胞，建立了bcl-2表达受抑制的U937细胞模型，观察了模型细胞生长和存活能力的变化以及对两种化疗药物敏感性的改变，从而丰富了bcl-2及其反义核酸调控肿瘤细胞凋亡的资料。
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1 材料与方法
1.1主要材料
U937、PA317及NIH/3T3细胞均为本室保存，反义bcl-2基因表达载体pLXSN/as-bcl-2为本室构建〔4〕。G418(Gibco产品)，鼠抗人bcl-2单抗(SantaCruz产品)，FITC标记的羊抗鼠IgG(Jackson产品)，Ara-C和三尖杉酯碱均为国产。
1.2U937/as-bcl-2细胞模型的建立
用电穿孔法将反义bcl-2基因表达载体pLXSN/as-bcl-2转染于PA317包装细胞，筛选出G418抗性克隆，扩增培养，收集上清，利用NIH/3T3细胞测定病毒滴度。用高滴度病毒上清与U937细胞共培养20小时后，以有限稀释法筛选出G418抗性克隆，命名为U937/as-bcl-2。同法筛选出含空载体pLXSN的U937细胞，命名为U937/neo。随机选4个U937/as-bcl-2细胞克隆和一个U937/neo克隆扩增培养，利用流式细胞技术检测bcl-2特异性的细胞平均荧光强度(MIF)，判断bcl-2表达受抑情况。鼠抗人bcl-2单抗按1∶80稀释，FITC标记的羊抗鼠IgG按1∶100稀释。实验以U937细胞作对照，计算U937/as-bcl-2和U937/neo细胞的MIF与对照细胞MIF的比值。阴性对照为U937细胞不加鼠抗人bcl-2单抗，代之以小鼠IgG。最后选出bcl-2表达受抑程度最高的一个U937/as-bcl-2克隆进行后续实验。
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1.3U937/as-bcl-2细胞的一般生长特性变化
将U937/as-bcl-2、U937/neo和U937细胞调成1×105/ml细胞悬液，接种于96孔板，0.2ml/孔。然后在正常培养条件下连续6天，每隔24小时，取部分孔中的细胞经台盼蓝染色后计数，绘制细胞的时间变化曲线，计算细胞存活率。实验设三个平行孔，取其平均值。
1.4U937/as-bcl-2细胞对化疗药物敏感性的变化
将三种细胞以4×105/ml接种于96孔板，0.15ml/孔，然后加入含不同浓度Ara-C(或三尖杉酯碱)的培养基50μl，混匀培养24小时后，取细胞计数，计算存活细胞百分率。实验设三复孔，取其平均值。
2 结果
2.1U937/as-bcl-2细胞的bcl-2表达水平变化
, 百拇医药
流式细胞仪分析结果如下：4个克隆来源的U937/as-bcl-2细胞的MIF分别为对照细胞MIF的65.4%、58.1%、46.3%、42.8%(各P<0.05。用最后一个克隆作为模型细胞进行后续实验)；而U937/neo细胞的MIF为对照细胞MIF的100.4%(P>值均0.05)。这一结果表明反义bcl-2基因转染可明显抑制细胞bcl-2蛋白的表达。
2.2U937/as-bc1-2细胞生长及存活情况
在连续六天检测中，U937/as-bcl-2、U937/neo和U937细胞在各时相点的细胞数及存活率间均无明显差异(各P值均>0.05)，说明各细胞在增殖速度和存活能力方面无明显差异，表明在U937细胞，单独反义bcl-2基因转染对细胞在正常培养条件下的生长和存活表型无明显影响。
2.3U937/as-bcl-2细胞对化疗药物耐受能力的改变
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如图1、2所示，在不同浓度Ara-C和三尖杉酯碱作用24小时后，U937/as-bcl-2细胞在各浓度点的存活率均较U937/neo和U937细胞者明显下降(各P<0.05)，而后两者在各浓度点的存活率间均无明显差异(各P值均>值均0.05)，表明反义bcl-2基因转染使U937细胞对Ara-C和三尖杉酯碱的敏感性增加。
图1受Ara-C处理的U937/as-bcl-2细胞的存活情况各细胞在不同浓度Ara-C作用24小时后，在各浓度点，U937/as-bcl-2细胞的存活率均较另两细胞明显降低。图中标注点代表均值。
图2受三尖杉酯碱处理的U937/as-bcl-2细胞的存活情况各细胞在不同浓度三尖杉酯碱作用24小时后，在各浓度点，U937/as-bcl-2细胞的存活率均较另两细胞者明显降低。图中标注点代表均值。
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3 讨论
鉴于bcl-2与多种恶性肿瘤的发生和耐药性形成等密切相关以及bcl-2反义核酸在抑制B细胞肿瘤方面已取得的一些成果[1～3]，本文试图探讨bcl-2反义核酸在不同靶细胞中的作用是否具有普遍性，以丰富bcl-2及其反义核酸调控肿瘤细胞凋亡的资料。为此，我们将反义bcl-2基因转染于单核白血病细胞系U937细胞，建立了bcl-2表达受抑的U937细胞模型，观察了模型细胞的一般生长和存活表型以及对两化疗药物(Ara-C和三尖杉酯碱)敏感性的变化，结果表明：第一，单独反义bcl-2基因转染虽可有效抑制U937细胞bcl-2蛋白的表达，但对细胞在正常培养条件下的生长和存活能力无明显影响，这与以往用B细胞性肿瘤细胞进行研究时所取得的结果不相一致(在B细胞性肿瘤，单独bcl-2反义核酸即可抑制瘤细胞生长和致瘤细胞死亡)，说明单独bcl-2反义核酸在不同靶细胞中的作用结果并不完全相同。关于产生这种结果不一的原因尚不清楚，推测可能与bcl-2在不同类型细胞中所起作用的比重不同有关。因此，对单独bcl-2反义核酸在不同肿瘤靶细胞中的作用地位应进行正确评价。第二，反义bcl-2基因转染增加了U937细胞对Ara-C和三尖杉酯碱的敏感性。这就提示：在U937细胞，单独反义bcl-2基因转染虽不明显影响细胞生长和存活表型，但可使某些激发细胞死亡信号的刺激阈值降低。也就是说，bcl-2反义核酸与其它某些促细胞死亡因素间可能存在协同作用。因此，在治疗bcl-2相关肿瘤时，若能联合使用bcl-2反义核酸和其它诱导细胞死亡制剂，或许可使肿瘤细胞对后者的敏感性增加，从而提高治疗效果。
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通讯作者：何凤田 Tel:86-23-68752234
[参考文献]
[1]Morelli S, Delia D, Capaccioli S, et al. The antisense bcl- 2- IgH transcript is an optimal target for synthetic oligonucleotides [J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1997,94(15)： 8150～ 8155.
[2]Ho PT, Parkinson DR. Antisense oligonucleiotides as therapeutic for malignant diseases [J]. Semin Oncol, 1997， 24(2)： 187～ 202.
[3]Tormo M, Tari AM, McDonnell TJ, et al. Apoptotic induction in transformed follicular lymphoma cells by bcl- 2 downregulation [J]. Leuk Lymphoma, 1998,30(3～ 4)： 367～ 379.
[4] 何凤田，朱锡华.人类bcl-2cDNA在NIH/3T3细胞中的表达[J].免疫学杂志，1997，13(4)：227～229.
收稿日期：1999-04-02
修回日期：1999-05-25, 百拇医药