白细胞介素1受体拮抗剂基因转染对脑缺血后细胞粘附分子1表达的影响
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作者：毛颖 周良辅 杨国源
单位：毛颖(200040 上海医科大学附属华山医院神经外科)；周良辅(200040 上海医科大学附属华山医院神经外科)；杨国源(美国密歇根大学神经外科)
关键词：
中华医学杂志000428 白细胞介素1β(IL-1β)是一种强烈致炎细胞因子。IL-1受体拮抗剂(IL-1ra)是相对分子质量为17 000多肽，在体内外实验中都能抑制IL-1的作用[1]。我们在前期实验中，利用腺病毒载体编码人IL-1ra基因，通过脑室内微量注射，使IL-1ra在大鼠和小鼠的室管膜细胞中过度表达，能减少脑缺血后的梗死面积。同时也证实过度表达的IL-1ra蛋白能减轻脑缺血后的脑水肿和炎症反应[2-4]。因IL-1ra的神经保护和抗炎作用的机制尚不明确。为此，我们采用基因转染的方法，研究过度表达的IL-1ra蛋白对小鼠脑缺血后脑内细胞粘附分子1(ICAM-1)表达的影响，探讨IL-1ra神经保护作用机制。
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一、材料和方法
1.腺病毒载体构建：构建复制缺陷的人腺病毒血清5型来源的腺病毒载体，具体方法已有文献介绍[5]。我们构建重组腺病毒载体Ad.RSVIL-1ra和Ad.RSVLacZ，分别携带人类IL-1ra cDNA片段和编码E.coli LacZ基因的cDNA片段。
2.实验分组：雄性成年CD-1小鼠(美国Charles River)，体重30～35 g。分为3组：IL-1ra组(8只)：局灶性脑缺血5 d前小鼠右侧脑室内注入编码人IL-1ra cDNA的腺病毒载体；LacZ组(8只)：同样条件下在小鼠右侧脑室内注入编码人LacZ基因的腺病毒载体； Saline组(7只)：同样条件下在小鼠右侧脑室内注入等量生理盐水。另9个小鼠(每组3个)用于Western blot蛋白分析。
3.腺病毒注射：立体定向下将33 Ga注射针插入小鼠右侧脑室。1 μl腺病毒悬液(浓度1×1012颗粒/ml)注入脑室，速度0.2 μl/min。完成后5 min内缓慢撤出针头。
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4.局灶性脑缺血(大脑中动脉阻断)：脑室内病毒载体或生理盐水注射后5 d，采用小鼠插线模型阻断左侧大脑中动脉。具体步骤已另文介绍[6]。
5.脑血流(CBF)测定：激光多普勒血流测定仪(LDF)(BPM2型，Vasamedics)测量局部脑血流。
6.ICAM-1免疫组织化学染色：大脑中动脉阻断24 h后，将小鼠断头，取脑，干冰速冻。取20 μm厚度的冠状脑片(位于Bregma 0.38处)，采用ABC法进行免疫组织化学染色。CD-54(ICAM-1)单克隆抗体(CA)(1∶300)，DAB显色，苏木素复染核。对照片，用相同浓度的正常大鼠IgG替代一抗。光镜下，脑片上每侧半球选择皮质区和基底节区进行ICAM-1阳性血管(深棕色)计数。
7.ICAM-1蛋白Western blot分析:大脑中动脉阻断24 h后切取前脑6 mm厚冠状脑片，分离缺血侧皮层，作ICAM-1 Western blot分析。采用ECL Western blot分析系统评价。
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8.统计学分析：以ANOVA和经Bonferroni校正的Student′s t检验判断3组间各项指标差异的显著意义。数值均以平均值±标准误表示。差异显著意义定为P<0.05。
二、结果
1.脑血流改变：各实验组小鼠插线后5 min缺血中心区的CBF降至缺血前基值的9%～11%，3组间CBF变化差异无显著意义。
2.ICAM-1免疫组织化学表达和Western blot蛋白分析： 24 h局灶性脑缺血后，IL-1ra基因转染的小鼠缺血皮质区ICAM-1表达阳性的血管数(138±19)明显少于LacZ组(248±25)和Saline组(283±22)对应区(P<0.05)(图1)。但3组间缺血基底节区的ICAM-1阳性血管数相近，没有显著差别，分别为：45±7，49±10和58±10，P>0.05。对侧半球的ICAM-1表达在3组间差异无显著意义(P>0.05)。Western blot分析相对分子量在9 000处出现清晰的ICAM-1蛋白条带，IL-1ra组缺血皮质区蛋白密度明显低于其他2个对照组，与阳性血管计数结果相对应，表明过度表达IL-1ra能明显减少ICAM-1在缺血区的表达。
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图1 ICAM-1免疫组织化学染色显示，IL-1ra组(a)半暗区的ICAM-1阳性血管数明显少于LacZ组(b)和Saline组(c)的相应区(标尺：30 μm) ABC ×10
三、讨论
IL-1在脑缺血损伤中起着重要作用。在高血压大鼠局灶性永久性脑缺血后6 h，缺血区IL-1β mRNA的表达明显增高[7]。Liu等[8]报道,脑缺血后IL-1β蛋白也可明显增高。将IL-1β直接注射到脑实质或脑室内可引起血脑屏障破坏和梗死面积增大。而给大鼠静脉内或脑室内注射重组人类IL-1受体拮抗剂后，脑缺血损害明显减轻[1]。采用转基因技术，敲除小鼠IL-1，脑缺血后，脑梗死、脑肿胀和神经功能损害较IL-1β表达正常的小鼠减轻。上述不同路径的实验研究都提示IL-1，特别是IL-1β参与脑缺血后的病理过程。但目前对IL-1引起脑损害的具体机制尚不明确。采用上述腺病毒载体的构建和注射方法，我们成功地在大鼠和小鼠脑中诱导转染人IL-1ra基因过度表达，表达的细胞主要为脑室壁的室管膜细胞。产生的IL-1ra蛋白能明显减轻大鼠和小鼠永久性大脑中动脉闭塞后的梗死体积[2，3]。
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ICAM-1使炎症细胞粘附于血管壁，释放细胞毒性物质，破坏内皮细胞，进而移行和浸润脑实质，引起神经元死亡。体外实验发现IL-1能诱导人胶质母细胞瘤和神经母细胞瘤细胞表达ICAM-1，并能被IL-1ra阻断。但没有活体实验证实这一作用途径。本结果证实，小鼠脑中过度表达的人类重组IL-1ra能显著减少缺血皮质区ICAM-1的表达，间接表明局灶性脑缺血后，IL-1表达上调，进一步刺激血管内皮细胞上ICAM-1的表达，易化白细胞在微血管上附壁和移行进入脑实质。但IL-1如何刺激ICAM-1的表达还需进一步研究。
基金项目：美国NIH NS-35089(GYY)；NS-23870(ALB)基金资助项目
参考文献
1，Relton JK, Martin D, Thompson RC, et al. Peripheral administration of interleukin-1 receptor antagonist inhibits brain damage after focal cerebral ischemia in the rat. Exp Neurol， 1996，138:206-213.
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2，Betz AL, Yang GY, Davidson BL. Attenuation of stroke size in rats using an adenoviral vector to induce overexpression of interleukin-1 receptor antagonist in brain. J Cereb Blood Flow Metab ,1995,15:547-551.
3，Yang GY, Zhao YJ, Davidson BL, et al. Overexpression of interleukin-1 receptor antagonist in the mouse brain reduces ischemic brain injury. Brain Res ,1997,751:181-188.
4，Yang GY, Liu XH, Kadoya C, et al. Attenuation of ischemic inflammatory response in mouse brain using an adenoviral vector to induce overexpression of interleukin-1 receptor antagonist. J Cereb Blood Flow Metab, 1998,18:840-847.
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5，Roessler BJ, Hartman JW, Vallance DK, et al. Inhibition of interleukin-1-induced effects in synoviocytes transduced with the human IL-1 receptor antagonist cDNA using an adenoviral vector. Hum Gene Ther, 1995,6:307-316.
6，毛颖，周良辅，杨国源，等.小鼠局灶性脑缺血的脑血流动力学和脑损害的评价.中华实验外科杂志，1999，16：436-438.
7，Minami M, Kuraishi Y, Yabuuchi K, et al. Induction of interleukin-1β mRNA in rat brain after transient forebrain ischemia. J Neurochem, 1992,58:390-392.
8，Liu T, McDonnell PC, Young PR, et al. Interleukin-1β mRNA expression in ischemic rat cortex. Stroke, 1993,24:1746-1751.
(收稿日期:1999-06-02), http://www.100md.com
单位：毛颖(200040 上海医科大学附属华山医院神经外科)；周良辅(200040 上海医科大学附属华山医院神经外科)；杨国源(美国密歇根大学神经外科)
关键词：
中华医学杂志000428 白细胞介素1β(IL-1β)是一种强烈致炎细胞因子。IL-1受体拮抗剂(IL-1ra)是相对分子质量为17 000多肽，在体内外实验中都能抑制IL-1的作用[1]。我们在前期实验中，利用腺病毒载体编码人IL-1ra基因，通过脑室内微量注射，使IL-1ra在大鼠和小鼠的室管膜细胞中过度表达，能减少脑缺血后的梗死面积。同时也证实过度表达的IL-1ra蛋白能减轻脑缺血后的脑水肿和炎症反应[2-4]。因IL-1ra的神经保护和抗炎作用的机制尚不明确。为此，我们采用基因转染的方法，研究过度表达的IL-1ra蛋白对小鼠脑缺血后脑内细胞粘附分子1(ICAM-1)表达的影响，探讨IL-1ra神经保护作用机制。
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一、材料和方法
1.腺病毒载体构建：构建复制缺陷的人腺病毒血清5型来源的腺病毒载体，具体方法已有文献介绍[5]。我们构建重组腺病毒载体Ad.RSVIL-1ra和Ad.RSVLacZ，分别携带人类IL-1ra cDNA片段和编码E.coli LacZ基因的cDNA片段。
2.实验分组：雄性成年CD-1小鼠(美国Charles River)，体重30～35 g。分为3组：IL-1ra组(8只)：局灶性脑缺血5 d前小鼠右侧脑室内注入编码人IL-1ra cDNA的腺病毒载体；LacZ组(8只)：同样条件下在小鼠右侧脑室内注入编码人LacZ基因的腺病毒载体； Saline组(7只)：同样条件下在小鼠右侧脑室内注入等量生理盐水。另9个小鼠(每组3个)用于Western blot蛋白分析。
3.腺病毒注射：立体定向下将33 Ga注射针插入小鼠右侧脑室。1 μl腺病毒悬液(浓度1×1012颗粒/ml)注入脑室，速度0.2 μl/min。完成后5 min内缓慢撤出针头。
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4.局灶性脑缺血(大脑中动脉阻断)：脑室内病毒载体或生理盐水注射后5 d，采用小鼠插线模型阻断左侧大脑中动脉。具体步骤已另文介绍[6]。
5.脑血流(CBF)测定：激光多普勒血流测定仪(LDF)(BPM2型，Vasamedics)测量局部脑血流。
6.ICAM-1免疫组织化学染色：大脑中动脉阻断24 h后，将小鼠断头，取脑，干冰速冻。取20 μm厚度的冠状脑片(位于Bregma 0.38处)，采用ABC法进行免疫组织化学染色。CD-54(ICAM-1)单克隆抗体(CA)(1∶300)，DAB显色，苏木素复染核。对照片，用相同浓度的正常大鼠IgG替代一抗。光镜下，脑片上每侧半球选择皮质区和基底节区进行ICAM-1阳性血管(深棕色)计数。
7.ICAM-1蛋白Western blot分析:大脑中动脉阻断24 h后切取前脑6 mm厚冠状脑片，分离缺血侧皮层，作ICAM-1 Western blot分析。采用ECL Western blot分析系统评价。
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8.统计学分析：以ANOVA和经Bonferroni校正的Student′s t检验判断3组间各项指标差异的显著意义。数值均以平均值±标准误表示。差异显著意义定为P<0.05。
二、结果
1.脑血流改变：各实验组小鼠插线后5 min缺血中心区的CBF降至缺血前基值的9%～11%，3组间CBF变化差异无显著意义。
2.ICAM-1免疫组织化学表达和Western blot蛋白分析： 24 h局灶性脑缺血后，IL-1ra基因转染的小鼠缺血皮质区ICAM-1表达阳性的血管数(138±19)明显少于LacZ组(248±25)和Saline组(283±22)对应区(P<0.05)(图1)。但3组间缺血基底节区的ICAM-1阳性血管数相近，没有显著差别，分别为：45±7，49±10和58±10，P>0.05。对侧半球的ICAM-1表达在3组间差异无显著意义(P>0.05)。Western blot分析相对分子量在9 000处出现清晰的ICAM-1蛋白条带，IL-1ra组缺血皮质区蛋白密度明显低于其他2个对照组，与阳性血管计数结果相对应，表明过度表达IL-1ra能明显减少ICAM-1在缺血区的表达。
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图1 ICAM-1免疫组织化学染色显示，IL-1ra组(a)半暗区的ICAM-1阳性血管数明显少于LacZ组(b)和Saline组(c)的相应区(标尺：30 μm) ABC ×10
三、讨论
IL-1在脑缺血损伤中起着重要作用。在高血压大鼠局灶性永久性脑缺血后6 h，缺血区IL-1β mRNA的表达明显增高[7]。Liu等[8]报道,脑缺血后IL-1β蛋白也可明显增高。将IL-1β直接注射到脑实质或脑室内可引起血脑屏障破坏和梗死面积增大。而给大鼠静脉内或脑室内注射重组人类IL-1受体拮抗剂后，脑缺血损害明显减轻[1]。采用转基因技术，敲除小鼠IL-1，脑缺血后，脑梗死、脑肿胀和神经功能损害较IL-1β表达正常的小鼠减轻。上述不同路径的实验研究都提示IL-1，特别是IL-1β参与脑缺血后的病理过程。但目前对IL-1引起脑损害的具体机制尚不明确。采用上述腺病毒载体的构建和注射方法，我们成功地在大鼠和小鼠脑中诱导转染人IL-1ra基因过度表达，表达的细胞主要为脑室壁的室管膜细胞。产生的IL-1ra蛋白能明显减轻大鼠和小鼠永久性大脑中动脉闭塞后的梗死体积[2，3]。
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ICAM-1使炎症细胞粘附于血管壁，释放细胞毒性物质，破坏内皮细胞，进而移行和浸润脑实质，引起神经元死亡。体外实验发现IL-1能诱导人胶质母细胞瘤和神经母细胞瘤细胞表达ICAM-1，并能被IL-1ra阻断。但没有活体实验证实这一作用途径。本结果证实，小鼠脑中过度表达的人类重组IL-1ra能显著减少缺血皮质区ICAM-1的表达，间接表明局灶性脑缺血后，IL-1表达上调，进一步刺激血管内皮细胞上ICAM-1的表达，易化白细胞在微血管上附壁和移行进入脑实质。但IL-1如何刺激ICAM-1的表达还需进一步研究。
基金项目：美国NIH NS-35089(GYY)；NS-23870(ALB)基金资助项目
参考文献
1，Relton JK, Martin D, Thompson RC, et al. Peripheral administration of interleukin-1 receptor antagonist inhibits brain damage after focal cerebral ischemia in the rat. Exp Neurol， 1996，138:206-213.
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2，Betz AL, Yang GY, Davidson BL. Attenuation of stroke size in rats using an adenoviral vector to induce overexpression of interleukin-1 receptor antagonist in brain. J Cereb Blood Flow Metab ,1995,15:547-551.
3，Yang GY, Zhao YJ, Davidson BL, et al. Overexpression of interleukin-1 receptor antagonist in the mouse brain reduces ischemic brain injury. Brain Res ,1997,751:181-188.
4，Yang GY, Liu XH, Kadoya C, et al. Attenuation of ischemic inflammatory response in mouse brain using an adenoviral vector to induce overexpression of interleukin-1 receptor antagonist. J Cereb Blood Flow Metab, 1998,18:840-847.
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5，Roessler BJ, Hartman JW, Vallance DK, et al. Inhibition of interleukin-1-induced effects in synoviocytes transduced with the human IL-1 receptor antagonist cDNA using an adenoviral vector. Hum Gene Ther, 1995,6:307-316.
6，毛颖，周良辅，杨国源，等.小鼠局灶性脑缺血的脑血流动力学和脑损害的评价.中华实验外科杂志，1999，16：436-438.
7，Minami M, Kuraishi Y, Yabuuchi K, et al. Induction of interleukin-1β mRNA in rat brain after transient forebrain ischemia. J Neurochem, 1992,58:390-392.
8，Liu T, McDonnell PC, Young PR, et al. Interleukin-1β mRNA expression in ischemic rat cortex. Stroke, 1993,24:1746-1751.
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