人脑星形细胞瘤P53蛋白积聚及bcl-2基因表达的研究
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作者：赵文元 周晓平 许涛 刘建民 王文仲
单位：赵文元(第二军医大学长海医院神经外科，上海 200433)；周晓平(第二军医大学长海医院神经外科，上海 200433)；刘建民(第二军医大学长海医院神经外科，上海 200433)；王文仲(第二军医大学长海医院神经外科，上海 200433) 许涛(长海医院麻醉科)
关键词：基因，p53；基因，bcl-2；脑肿瘤
第二军医大学学报000338 【中图分类号】 R 730.264 【文献标识码】 B 【文章编号】 0258-879X(2000)03-0203-02▲
凋亡(apoptosis)是活组织中单个细胞的主动“自杀”过程，受多基因调节，其中，野生型p53基因是重要的凋亡促进基因，而突变型p53基因和bcl-2基因是重要的凋亡抑制基因。我们检测了34例人脑星形细胞瘤组织中P53蛋白积聚和bcl-2 mRNA表达情况，以探讨凋亡抑制对人脑星形细胞瘤的意义。
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 标本来源与分级 34例标本均于我科星形细胞瘤患者第一次手术时获得，液氮保存，病理学诊断依据Kernohan标准，其中星形细胞瘤Ⅰ级8例、Ⅱ级12例、Ⅲ～Ⅳ级14例，另外3例正常脑组织标本于急性颅脑外伤内减压时获得。
1.2 材料与试剂 pbluebcl-2质粒由bluescriptsk(M13-)改建，美国斯坦福大学Klaus Bensch博士馈赠。限制性内切酶Hind Ⅲ，T3 RNA聚合酶为Promega公司产品。地高辛RNA合成NTP，AKP-Anti-DIG-Ab Fab为Boehringer公司产品。抗P53多克隆抗体CM-1为Dako公司提供。PAG由第二军医大学病理学教研室制备。
1.3 免疫组化染色 冷冻标本自液氮取出，4%多聚甲醛固定于恒冷箱冷冻切片，层厚4 μm，20%蔗糖PBS浸泡过夜。染色步骤依石蜡切片IGSS进行，CM-1以1∶1 000稀释。
, 百拇医药
1.4 原位分子杂交 (1)探针制备：以限制性内切酶Hind Ⅲ切开质粒后，取线性质粒DNA 50 ng/μl，T3 RNA聚合酶2 U/μl，1 mmol/L NTP合成cRNA，加入DNA酶去除模板DNA后备用。(2)标本预处理：肿瘤标本自液氮取出，经4%多聚甲醛固定和20%蔗糖PBS浸泡后作冷冻切片，层厚10 μm，切片以0.4% Triton X-100和蛋白酶K处理。(3) 杂交及显色 ： 切片加探针含量0.5 μg/ml杂交液43℃杂交16 h，RNA酶去除多余探针后，加AKP-Anti-DIG-Ab Fab室温4 h，NBT和BCIP室温显色3 h，封片。
1.5 结果判定 阳性染色细胞数小于10%为阴性，大于10%为阳性。
2 结 果
34例星形细胞瘤标本检测结果：(1)P53蛋白染色均位于核内，呈散在黑色颗粒，类圆形，形状规则。34例标本中16例P53蛋白染色阳性，其中星形细胞瘤Ⅰ级4/8，Ⅱ级5/12，Ⅲ～Ⅳ级7/14。(2)bcl-2 mRNA染色位于胞质，呈片状，蓝褐色，形态不规则，34例标本中18例染色阳性, 其中星形细胞瘤Ⅰ级5/8，Ⅱ级7/12，Ⅲ～Ⅳ级6/14。34例星形细胞瘤组织中，7例P53蛋白和bcl-2 mRNA染色均为阳性，占20.59%。正常脑组织P53蛋白和bcl-2 mRNA染色阳性细胞数小于10%。
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3 讨 论
正常组织中常规免疫组织化学方法难以检测到P53蛋白。当p53基因突变后，P53蛋白半衰期延长，在细胞内产生积聚，免疫组化检测阳性，据此推断p53基因突变。我们采用抗P53多克隆抗体CM-1可检测多种p53基因突变产物，34例星形细胞瘤组织中，16例P53蛋白染色阳性，这与有关研究报道一致[1]。
正常神经元细胞轴突及胶质细胞不表达bcl-2基因，我们采用原位分子杂交观察到18/34人脑星形细胞瘤组织有bcl-2 mRNA表达，该结果与文献报道相符[2]。
我们发现人脑星形细胞瘤组织中存在P53蛋白积聚和bcl-2基因mRNA表达，表明人脑星形细胞瘤中存在凋亡抑制现象。凋亡抑制使得带有DNA损伤或突变的细胞继续存活，最终导致星形细胞瘤的发生。另外有7例星形细胞瘤组织中P53蛋白积聚和bcl-2 mRNA表达同时存在，这与多癌基因协同学说相符合，即靶细胞内多个抑癌基因发生突变和(或)癌基因被激活，从而导致了肿瘤的发生发展，人脑星形细胞瘤也不例外。
, 百拇医药
星形细胞瘤术后常需结合放疗和化疗。目前认为放疗和化疗的抗癌机制之一是激发了凋亡过程，瘤细胞主动自杀死亡。瘤细胞凋亡受到抑制后，由放疗或化疗所诱发的瘤细胞死亡减少，表现为肿瘤对放、化疗产生抵抗。我们观察到人脑星形细胞瘤组织中存在p53突变和bcl-2激活现象，这一方面为从凋亡抑制着手研究部分星形细胞瘤对放疗和化疗的抵抗性提供了新的线索，另一方面提示我们，可能在星形细胞瘤中出现p53基因突变和bcl-2激活是预后不良的信号。在这种情况下必须寻求新的治疗策略，如将野生型p53基因导入瘤细胞或将反义bcl-2转入瘤细胞以封闭bcl-2基因的表达[3]。■
作者简介：赵文元(1969-)，男(汉族)，博士生，主治医师
【参 考 文 献】
[1] David NL. The p53 gene and protein in human brain tumors[J]. J Neuropathol Exp Neurol, 1994, 53(1):11-21.
, 百拇医药
[2] Nakasu S, Nakasu Y, Nioka H, et al. bcl-2 protein expression in tumors of the central nervous system[J]. Acta Neuropathol (Berl), 1994, 88(6):520-526.
[3] Yabuno T, Konishi N, Nakamura M, et al. Drug resistance and apoptosis in ENU-induced rat brain tumors treated with anti-cancer drugs[J]. J Neurooncol, 1998, 36(2): 105-112.
【收稿日期】 1999-09-14
【修回日期】 1999-12-05, http://www.100md.com
单位：赵文元(第二军医大学长海医院神经外科，上海 200433)；周晓平(第二军医大学长海医院神经外科，上海 200433)；刘建民(第二军医大学长海医院神经外科，上海 200433)；王文仲(第二军医大学长海医院神经外科，上海 200433) 许涛(长海医院麻醉科)
关键词：基因，p53；基因，bcl-2；脑肿瘤
第二军医大学学报000338 【中图分类号】 R 730.264 【文献标识码】 B 【文章编号】 0258-879X(2000)03-0203-02▲
凋亡(apoptosis)是活组织中单个细胞的主动“自杀”过程，受多基因调节，其中，野生型p53基因是重要的凋亡促进基因，而突变型p53基因和bcl-2基因是重要的凋亡抑制基因。我们检测了34例人脑星形细胞瘤组织中P53蛋白积聚和bcl-2 mRNA表达情况，以探讨凋亡抑制对人脑星形细胞瘤的意义。
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1 材料和方法
1.1 标本来源与分级 34例标本均于我科星形细胞瘤患者第一次手术时获得，液氮保存，病理学诊断依据Kernohan标准，其中星形细胞瘤Ⅰ级8例、Ⅱ级12例、Ⅲ～Ⅳ级14例，另外3例正常脑组织标本于急性颅脑外伤内减压时获得。
1.2 材料与试剂 pbluebcl-2质粒由bluescriptsk(M13-)改建，美国斯坦福大学Klaus Bensch博士馈赠。限制性内切酶Hind Ⅲ，T3 RNA聚合酶为Promega公司产品。地高辛RNA合成NTP，AKP-Anti-DIG-Ab Fab为Boehringer公司产品。抗P53多克隆抗体CM-1为Dako公司提供。PAG由第二军医大学病理学教研室制备。
1.3 免疫组化染色 冷冻标本自液氮取出，4%多聚甲醛固定于恒冷箱冷冻切片，层厚4 μm，20%蔗糖PBS浸泡过夜。染色步骤依石蜡切片IGSS进行，CM-1以1∶1 000稀释。
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1.4 原位分子杂交 (1)探针制备：以限制性内切酶Hind Ⅲ切开质粒后，取线性质粒DNA 50 ng/μl，T3 RNA聚合酶2 U/μl，1 mmol/L NTP合成cRNA，加入DNA酶去除模板DNA后备用。(2)标本预处理：肿瘤标本自液氮取出，经4%多聚甲醛固定和20%蔗糖PBS浸泡后作冷冻切片，层厚10 μm，切片以0.4% Triton X-100和蛋白酶K处理。(3) 杂交及显色 ： 切片加探针含量0.5 μg/ml杂交液43℃杂交16 h，RNA酶去除多余探针后，加AKP-Anti-DIG-Ab Fab室温4 h，NBT和BCIP室温显色3 h，封片。
1.5 结果判定 阳性染色细胞数小于10%为阴性，大于10%为阳性。
2 结 果
34例星形细胞瘤标本检测结果：(1)P53蛋白染色均位于核内，呈散在黑色颗粒，类圆形，形状规则。34例标本中16例P53蛋白染色阳性，其中星形细胞瘤Ⅰ级4/8，Ⅱ级5/12，Ⅲ～Ⅳ级7/14。(2)bcl-2 mRNA染色位于胞质，呈片状，蓝褐色，形态不规则，34例标本中18例染色阳性, 其中星形细胞瘤Ⅰ级5/8，Ⅱ级7/12，Ⅲ～Ⅳ级6/14。34例星形细胞瘤组织中，7例P53蛋白和bcl-2 mRNA染色均为阳性，占20.59%。正常脑组织P53蛋白和bcl-2 mRNA染色阳性细胞数小于10%。
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3 讨 论
正常组织中常规免疫组织化学方法难以检测到P53蛋白。当p53基因突变后，P53蛋白半衰期延长，在细胞内产生积聚，免疫组化检测阳性，据此推断p53基因突变。我们采用抗P53多克隆抗体CM-1可检测多种p53基因突变产物，34例星形细胞瘤组织中，16例P53蛋白染色阳性，这与有关研究报道一致[1]。
正常神经元细胞轴突及胶质细胞不表达bcl-2基因，我们采用原位分子杂交观察到18/34人脑星形细胞瘤组织有bcl-2 mRNA表达，该结果与文献报道相符[2]。
我们发现人脑星形细胞瘤组织中存在P53蛋白积聚和bcl-2基因mRNA表达，表明人脑星形细胞瘤中存在凋亡抑制现象。凋亡抑制使得带有DNA损伤或突变的细胞继续存活，最终导致星形细胞瘤的发生。另外有7例星形细胞瘤组织中P53蛋白积聚和bcl-2 mRNA表达同时存在，这与多癌基因协同学说相符合，即靶细胞内多个抑癌基因发生突变和(或)癌基因被激活，从而导致了肿瘤的发生发展，人脑星形细胞瘤也不例外。
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星形细胞瘤术后常需结合放疗和化疗。目前认为放疗和化疗的抗癌机制之一是激发了凋亡过程，瘤细胞主动自杀死亡。瘤细胞凋亡受到抑制后，由放疗或化疗所诱发的瘤细胞死亡减少，表现为肿瘤对放、化疗产生抵抗。我们观察到人脑星形细胞瘤组织中存在p53突变和bcl-2激活现象，这一方面为从凋亡抑制着手研究部分星形细胞瘤对放疗和化疗的抵抗性提供了新的线索，另一方面提示我们，可能在星形细胞瘤中出现p53基因突变和bcl-2激活是预后不良的信号。在这种情况下必须寻求新的治疗策略，如将野生型p53基因导入瘤细胞或将反义bcl-2转入瘤细胞以封闭bcl-2基因的表达[3]。■
作者简介：赵文元(1969-)，男(汉族)，博士生，主治医师
【参 考 文 献】
[1] David NL. The p53 gene and protein in human brain tumors[J]. J Neuropathol Exp Neurol, 1994, 53(1):11-21.
, 百拇医药
[2] Nakasu S, Nakasu Y, Nioka H, et al. bcl-2 protein expression in tumors of the central nervous system[J]. Acta Neuropathol (Berl), 1994, 88(6):520-526.
[3] Yabuno T, Konishi N, Nakamura M, et al. Drug resistance and apoptosis in ENU-induced rat brain tumors treated with anti-cancer drugs[J]. J Neurooncol, 1998, 36(2): 105-112.
【收稿日期】 1999-09-14
【修回日期】 1999-12-05, http://www.100md.com