叶绿素光敏剂对鸡冠微血管损伤机理探讨
http://www.100md.com
37c医学网
作者：杨耀武 吕春堂 曹 罡 李军昌 高建苑
单位：第四军医大学口腔医学院颌面外科 710032
关键词：鸡冠；叶绿素；衍生物；光动力疗法；痣；机理
实用口腔医学杂志990418 〔摘要〕 目的：观察鸡冠微血管在叶绿素光敏剂光动力治疗后的超微结构变化。方法：24只动物随机分成对照组和治疗组，光动力治疗组治疗参数为：给药至照光间隔时间10 min，光敏剂剂量每千克体重给10 mg，功率密度150 mW/cm2,能量密度90 J/cm2 ,治疗光源为主发射峰位于650 nm的红光。结果：透射电镜观察显示红细胞破坏，形态不规则,内皮细胞肿胀致血管腔变窄，胞膜破裂，线粒体肿胀、空泡化，内质网扩张，核染色质聚积或边集、核溶解，部分区域可见内皮细胞脱落，血管基膜及管周胶原纤维暴露，血栓形成。结论：内皮细胞是光动力损伤的主要靶部位，光动力效应产生的单态氧或氧自由基对内皮细胞造成直接光毒损伤，血管内层损伤导致凝血因子释放，血栓形成引起的缺氧加重、加速了血管组织的损伤。
, 百拇医药
An experiment study of injury mechanism of vascular structure in chicken comb following CPD4 sensitized photodynamic therapy
Yang Yaowu,Lu Chuntang,Cao Gang,et al.Stomatological College, Fourth Military Medical University,Xi'an 710032
〔Abstract〕Objective:To observe the ultrastructure changes of chicken comb following chlorophyll derivative IV(CPD4) sensitized photodynamic therapy (PDT).Methods:Chicken combs were treated with red light at 650 nm of main emitting peak,150 mW/cm2 of power density and 90 J/cm2 of energy density 10 min after injection of CPD4 at the dose of 10 mg/kg in 12 chickens.Another 3 chickens were used as the control .Then the combs were observed with transmission electronic microscope.Results:Swelling and irregular morphology of erythrocytes and endothelial cells(EC) were observed.Loss of cell membrane intergrity,swelling and vacuolization of mitochondria,expansion of endoplasmic reticulum ,dissolution of nucleus,loss of EC,exposure of blood vessel lamina and thrombus were found in the treated chicken combs.Conclusion:EC may be the main target of PDT.Singlet oxygen or oxygen radicals, clotting factor induced by PDT,vascular occlusion and hypoxia may be related to the damage of vascular structure.
, 百拇医药
Key words Chickencomb;Chlorophyll;Derivative;Photochemo
therapy;Nevus;Mechanism
光动力疗法(photodynamic therapy，PDT)对鲜红斑痣(port wine stains,PWS)的疗效已得到肯定〔1〕。在比较不同光敏剂对动物模型鸡冠光动力效应的研究中发现，新型光敏剂叶绿素衍生物四号(chlorophyll derivative IV,CPD4)对鸡冠微血管有明确的选择性损伤作用且具有体内排泄快、光毒反应小的特点〔2〕，损伤机制尚不明确。本研究通过观察鸡冠微血管在CPD4光动力治疗后的超微结构变化，探讨其损伤机理。
1 材料与方法
1.1 材料与设备
, 百拇医药
伊利莎雄鸡，由兰州军区北关农场提供，体重1.5～2.0 kg，鸡冠红润，冠色均匀一致，避光饲养。
CPD4粉剂，由杭州民生药厂提供，0～4℃避光保存，临用前用生理盐水稀释至所需浓度。
LKB Nova型超薄切片机。
TEM 2000EX型透射电镜。
1.2 动物分组(n为动物数)
1.2.1 空白对照组：正常鸡冠，不给光敏剂，不照光，n=3。
1.2.2 PDT组：CPD4剂量每千克体重给10 mg，功率密度150 mW/cm2 ,能量密度90 J/cm2 ,给药至照光间隔时间10 min，n=21。
, 百拇医药
1.3 取材及处理
对照组一次取材。PDT组在实验处理后即刻、30 min、3 h、1 d、3 d、1周、2周分别从三只动物取材，切取鸡冠组织块约1.0 mm×1.0 mm×2.0 mm,取材后立即置体积分数为5%戊二醛液固定，常规漂洗、脱水、浸透、包埋，切取超薄切片，透射电镜观察组织超微结构变化。
2 结 果
2.1对照组 表皮及真皮组织形态正常。表皮基底细胞核膜、胞膜完整，细胞器无异常改变，细胞间连接形态正常。内皮细胞(Endothelial cell,EC)为扁平形，胞膜及细胞器形态正常，血管壁结构完整，管周胶原纤维形态正常，管腔内可见带核盘状红细胞(图1)。
图1 对照组微血管电镜所见，EC为扁平形，血管基底膜清晰，管腔内见带核盘状红细胞。(×4,000)
, 百拇医药
2.2 PDT组
即刻，上皮基底细胞排列整齐，基底细胞稍肿胀，红细胞肿胀，EC肿胀变圆，胞浆内见空泡，线粒体肿胀、嵴断裂或空泡变性，内质网扩张，血管基膜模糊，管周胶原纤维变性(图2)。30 min～3 h，基底细胞形态同前，红细胞破坏，核固缩或裸核，EC肿胀显著，血管腔变窄，部分血管EC 膜破裂，从管壁脱落，核膜破裂，核固缩、崩解，血管壁不完整，部分管周胶原纤维变性、溶解(图3)。
图2 PDT后即刻，EC肿胀变圆，线粒体嵴断裂，空泡变性，内质网扩张。(×7,500)
图3 PDT后30 min，EC高度肿胀，血管腔变窄。(×4,000)
, 百拇医药
1～3 d，基底细胞形态恢复正常，红细胞呈各种形态不规则改变，EC脱落溶解，部分周细胞膜破坏，核出现染色质边集，血管壁连续性中断，管周胶原纤维变性、溶解(图4)。
图4 PDT后3 d，红细胞呈不规则形态改变，周细胞膜破裂，核染色质边集。(×3,000)
3 讨 论
鸡冠在60年代末已被国外学者用作毛细血管瘤动物模型，吴洋等在毛细血管瘤光选择特性系列研究中发现鸡与人血红蛋白的光吸收特性基本相同，鸡冠、肉垂与人毛细血管瘤区皮肤光反射曲线形态基本一致〔3〕，进一步为鸡冠用作毛细血管瘤动物模型提供了依据。
本研究及前期研究发现，鸡冠微血管在PDT后1～2周开始修复，4周后基本恢复正常，与国内外其他学者报道一致，但PDT用于临床治疗PWS却未见有复发者〔1〕。鸡冠的强修复能力与其种群遗传特性有关，此外鸡冠的血供、颜色、厚度，微血管的直径、数量、分布等与人类PWS均有差别，而且鸡冠对鸡来讲是正常的组织结构，PWS则是人体的一种病变组织，因此鸡冠与人类PWS有许多不同之处。但是目前尚无更理想的PWS模型，我们认为鸡冠用于PWS治疗的实验研究是可行的。
, 百拇医药
CPD4光动力疗法对鸡冠微血管有显著的损伤作用，本实验发现，毛细血管内层、EC是PDT损伤的主要靶部位。电镜观察主要有以下改变：红细胞呈现各种形态不规则的破坏，EC肿胀、膜破裂、变性、坏死、脱落，线粒体、内质网、细胞核等异常改变，血管壁破坏，血管基膜及管周胶原纤维破坏、溶解。
血管EC正常情况下为扁平形，EC保持扁平形状需耗费能量，如细胞产生能量的功能丧失，则细胞趋于圆形或肿胀，EC的肿胀变圆有时也与微血管的过度收缩与变短有关。EC的形态维持主要由细胞骨架完成，其中微丝对维持EC形态起主要作用，并与细胞间的紧密联结及细胞外基质附着有关。微丝的降解是EC受到刺激后产生收缩、细胞间连接分离、细胞脱落等因素所致〔4〕。PDT对EC的损伤有两种可能的机理，一是光敏剂进入血清后被内皮细胞摄取，经一定波长的光激活后发生光敏反应，产生的单态氧或氧自由基直接破坏EC的生物分子，另一种可能则是PDT后导致的血管闭锁、缺氧对EC的损伤。
光敏剂进入体内后被EC摄取通常认为是通过低密度脂蛋白(low density lipoproteins,LDL)途径, LDL受体在EC为高表达。光敏剂首先与血清中的LDL结合，然后通过受体介导进入EC〔5〕。另一个可能的途径是脂质体途径。Okunaka 等〔6〕比较了6种卟啉类光敏剂与双层卵磷脂膜的结合能力及对人红细胞的光溶血性能，发现与双层脂膜结合能力强的光敏剂能产生更强的溶血效应。CPD4与LDL的结合能力及与其他光敏剂的比较有待于进一步研究。光敏剂被激活后产生生物分子的光敏氧化被认为是光动力效应的基础。在体外试验中发现细胞膜是光动力效应的主要靶部位，细胞膜可以由于光动力效应产生一系列变化，如膜大泡、膜溶解、酶失活、蛋白变性等，这些变化也会出现在线粒体、溶酶体、细胞核等。本研究发现PDT后EC发生了明显改变，细胞膜、线粒体、内质网、细胞核均发生了损伤性形态改变，EC肿胀变圆、脱落可能与线粒体等细胞器功能降低及细胞骨架的破坏有关。
, 百拇医药
PDT后血管系统的另一种改变是血管收缩、血栓形成、血流停止〔7〕。血管闭锁的原因一方面是直接光毒反应损伤毛细血管内层及EC后导致基膜及胶原纤维暴露、凝血因子释放，引起血管收缩、血小板聚积、血栓形成；另一方面EC肿胀后内膜向管腔凸出，导致血流减少也是引起微循环障碍的原因之一。罗向东等〔8〕研究了缺氧环境对培养内皮细胞的损伤，发现缺氧后1 h，缺氧组与对照组聚合肌动蛋白含量尚无显著性差异；缺氧后2 h，缺氧组聚合肌动蛋白含量显著降低，扫描电镜照片可看出细胞的收缩和脱落。细胞骨架微丝由聚合肌动蛋白组成，除了直接的光毒作用外，缺氧造成的损伤也不能排除。
从本研究结果看，PDT后即刻至30 min，即可看到EC形态改变及血管壁的损伤，因此可以推测PDT后首先是单态氧或氧自由基对毛细血管内层及EC造成直接损伤，血管受损后激活了凝血系统，导致血流减少，血栓形成及缺氧。在PDT微血管损伤过程中，直接光敏损伤首先发挥作用，随后发生的微循环障碍引起的缺氧加重、加速了血管的损伤。
, 百拇医药
参考文献
1顾瑛,李峻亨,单焕炎,等.铜蒸气激光用于光动力疗法治疗鲜红斑痣50例疗效分析.中国激光医学杂志,1994;3(4):215
2 杨耀武,吕春堂,吴洋,等.叶绿素光敏剂光动力治疗鲜红斑痣.第四军医大学学报,1997;18(6):582
3 吴洋,吕春堂,赵晋龙.毛细血管瘤光选择特性及特异治疗光产生系列研究.III:鸡冠、肉垂与国人毛细血管瘤区皮肤光吸收特性的比较研究.实用口腔医学杂志,1994,10:282
4 Schnitter H, Franke RP,Drenckhahn D. Role of the endothelial actin filament cytoskeleton in rheology and permeability.Z-kardiol, 1989,28(Suppl 6):1
, http://www.100md.com
5 Roberts WG,Hasan T.Role of neovasculature and vascular permeability on the tumor retention of photodynamic agents.Cancer Res, 1992,52:924
6 Okunaka T,Eckhauser MC,Kato H,et al.Correlation between photodynamic efficacy of differing porphyrins and membrane partitioning behavior.Lasers Surg Med, 1992;12:98
7 Schmidt-Erfurth U,Hasan T,Schomacker K,et al.In vivo uptake of liposomal benzoporphyrin derivative and photothrombosis in experimental corneal neovascularization.Lasers Med, Surg, 1995,17:178
8 罗向东,杨宗城,黎鳌,等.缺氧环境对培养的血管内皮细胞的损伤.中华创伤杂志,1996,12:306
(收稿：1998-04-05 修回：1999-01-22), 百拇医药
单位：第四军医大学口腔医学院颌面外科 710032
关键词：鸡冠；叶绿素；衍生物；光动力疗法；痣；机理
实用口腔医学杂志990418 〔摘要〕 目的：观察鸡冠微血管在叶绿素光敏剂光动力治疗后的超微结构变化。方法：24只动物随机分成对照组和治疗组，光动力治疗组治疗参数为：给药至照光间隔时间10 min，光敏剂剂量每千克体重给10 mg，功率密度150 mW/cm2,能量密度90 J/cm2 ,治疗光源为主发射峰位于650 nm的红光。结果：透射电镜观察显示红细胞破坏，形态不规则,内皮细胞肿胀致血管腔变窄，胞膜破裂，线粒体肿胀、空泡化，内质网扩张，核染色质聚积或边集、核溶解，部分区域可见内皮细胞脱落，血管基膜及管周胶原纤维暴露，血栓形成。结论：内皮细胞是光动力损伤的主要靶部位，光动力效应产生的单态氧或氧自由基对内皮细胞造成直接光毒损伤，血管内层损伤导致凝血因子释放，血栓形成引起的缺氧加重、加速了血管组织的损伤。
, 百拇医药
An experiment study of injury mechanism of vascular structure in chicken comb following CPD4 sensitized photodynamic therapy
Yang Yaowu,Lu Chuntang,Cao Gang,et al.Stomatological College, Fourth Military Medical University,Xi'an 710032
〔Abstract〕Objective:To observe the ultrastructure changes of chicken comb following chlorophyll derivative IV(CPD4) sensitized photodynamic therapy (PDT).Methods:Chicken combs were treated with red light at 650 nm of main emitting peak,150 mW/cm2 of power density and 90 J/cm2 of energy density 10 min after injection of CPD4 at the dose of 10 mg/kg in 12 chickens.Another 3 chickens were used as the control .Then the combs were observed with transmission electronic microscope.Results:Swelling and irregular morphology of erythrocytes and endothelial cells(EC) were observed.Loss of cell membrane intergrity,swelling and vacuolization of mitochondria,expansion of endoplasmic reticulum ,dissolution of nucleus,loss of EC,exposure of blood vessel lamina and thrombus were found in the treated chicken combs.Conclusion:EC may be the main target of PDT.Singlet oxygen or oxygen radicals, clotting factor induced by PDT,vascular occlusion and hypoxia may be related to the damage of vascular structure.
, 百拇医药
Key words Chickencomb;Chlorophyll;Derivative;Photochemo
therapy;Nevus;Mechanism
光动力疗法(photodynamic therapy，PDT)对鲜红斑痣(port wine stains,PWS)的疗效已得到肯定〔1〕。在比较不同光敏剂对动物模型鸡冠光动力效应的研究中发现，新型光敏剂叶绿素衍生物四号(chlorophyll derivative IV,CPD4)对鸡冠微血管有明确的选择性损伤作用且具有体内排泄快、光毒反应小的特点〔2〕，损伤机制尚不明确。本研究通过观察鸡冠微血管在CPD4光动力治疗后的超微结构变化，探讨其损伤机理。
1 材料与方法
1.1 材料与设备
, 百拇医药
伊利莎雄鸡，由兰州军区北关农场提供，体重1.5～2.0 kg，鸡冠红润，冠色均匀一致，避光饲养。
CPD4粉剂，由杭州民生药厂提供，0～4℃避光保存，临用前用生理盐水稀释至所需浓度。
LKB Nova型超薄切片机。
TEM 2000EX型透射电镜。
1.2 动物分组(n为动物数)
1.2.1 空白对照组：正常鸡冠，不给光敏剂，不照光，n=3。
1.2.2 PDT组：CPD4剂量每千克体重给10 mg，功率密度150 mW/cm2 ,能量密度90 J/cm2 ,给药至照光间隔时间10 min，n=21。
, 百拇医药
1.3 取材及处理
对照组一次取材。PDT组在实验处理后即刻、30 min、3 h、1 d、3 d、1周、2周分别从三只动物取材，切取鸡冠组织块约1.0 mm×1.0 mm×2.0 mm,取材后立即置体积分数为5%戊二醛液固定，常规漂洗、脱水、浸透、包埋，切取超薄切片，透射电镜观察组织超微结构变化。
2 结 果
2.1对照组 表皮及真皮组织形态正常。表皮基底细胞核膜、胞膜完整，细胞器无异常改变，细胞间连接形态正常。内皮细胞(Endothelial cell,EC)为扁平形，胞膜及细胞器形态正常，血管壁结构完整，管周胶原纤维形态正常，管腔内可见带核盘状红细胞(图1)。
图1 对照组微血管电镜所见，EC为扁平形，血管基底膜清晰，管腔内见带核盘状红细胞。(×4,000)
, 百拇医药
2.2 PDT组
即刻，上皮基底细胞排列整齐，基底细胞稍肿胀，红细胞肿胀，EC肿胀变圆，胞浆内见空泡，线粒体肿胀、嵴断裂或空泡变性，内质网扩张，血管基膜模糊，管周胶原纤维变性(图2)。30 min～3 h，基底细胞形态同前，红细胞破坏，核固缩或裸核，EC肿胀显著，血管腔变窄，部分血管EC 膜破裂，从管壁脱落，核膜破裂，核固缩、崩解，血管壁不完整，部分管周胶原纤维变性、溶解(图3)。
图2 PDT后即刻，EC肿胀变圆，线粒体嵴断裂，空泡变性，内质网扩张。(×7,500)
图3 PDT后30 min，EC高度肿胀，血管腔变窄。(×4,000)
, 百拇医药
1～3 d，基底细胞形态恢复正常，红细胞呈各种形态不规则改变，EC脱落溶解，部分周细胞膜破坏，核出现染色质边集，血管壁连续性中断，管周胶原纤维变性、溶解(图4)。
图4 PDT后3 d，红细胞呈不规则形态改变，周细胞膜破裂，核染色质边集。(×3,000)
3 讨 论
鸡冠在60年代末已被国外学者用作毛细血管瘤动物模型，吴洋等在毛细血管瘤光选择特性系列研究中发现鸡与人血红蛋白的光吸收特性基本相同，鸡冠、肉垂与人毛细血管瘤区皮肤光反射曲线形态基本一致〔3〕，进一步为鸡冠用作毛细血管瘤动物模型提供了依据。
本研究及前期研究发现，鸡冠微血管在PDT后1～2周开始修复，4周后基本恢复正常，与国内外其他学者报道一致，但PDT用于临床治疗PWS却未见有复发者〔1〕。鸡冠的强修复能力与其种群遗传特性有关，此外鸡冠的血供、颜色、厚度，微血管的直径、数量、分布等与人类PWS均有差别，而且鸡冠对鸡来讲是正常的组织结构，PWS则是人体的一种病变组织，因此鸡冠与人类PWS有许多不同之处。但是目前尚无更理想的PWS模型，我们认为鸡冠用于PWS治疗的实验研究是可行的。
, 百拇医药
CPD4光动力疗法对鸡冠微血管有显著的损伤作用，本实验发现，毛细血管内层、EC是PDT损伤的主要靶部位。电镜观察主要有以下改变：红细胞呈现各种形态不规则的破坏，EC肿胀、膜破裂、变性、坏死、脱落，线粒体、内质网、细胞核等异常改变，血管壁破坏，血管基膜及管周胶原纤维破坏、溶解。
血管EC正常情况下为扁平形，EC保持扁平形状需耗费能量，如细胞产生能量的功能丧失，则细胞趋于圆形或肿胀，EC的肿胀变圆有时也与微血管的过度收缩与变短有关。EC的形态维持主要由细胞骨架完成，其中微丝对维持EC形态起主要作用，并与细胞间的紧密联结及细胞外基质附着有关。微丝的降解是EC受到刺激后产生收缩、细胞间连接分离、细胞脱落等因素所致〔4〕。PDT对EC的损伤有两种可能的机理，一是光敏剂进入血清后被内皮细胞摄取，经一定波长的光激活后发生光敏反应，产生的单态氧或氧自由基直接破坏EC的生物分子，另一种可能则是PDT后导致的血管闭锁、缺氧对EC的损伤。
光敏剂进入体内后被EC摄取通常认为是通过低密度脂蛋白(low density lipoproteins,LDL)途径, LDL受体在EC为高表达。光敏剂首先与血清中的LDL结合，然后通过受体介导进入EC〔5〕。另一个可能的途径是脂质体途径。Okunaka 等〔6〕比较了6种卟啉类光敏剂与双层卵磷脂膜的结合能力及对人红细胞的光溶血性能，发现与双层脂膜结合能力强的光敏剂能产生更强的溶血效应。CPD4与LDL的结合能力及与其他光敏剂的比较有待于进一步研究。光敏剂被激活后产生生物分子的光敏氧化被认为是光动力效应的基础。在体外试验中发现细胞膜是光动力效应的主要靶部位，细胞膜可以由于光动力效应产生一系列变化，如膜大泡、膜溶解、酶失活、蛋白变性等，这些变化也会出现在线粒体、溶酶体、细胞核等。本研究发现PDT后EC发生了明显改变，细胞膜、线粒体、内质网、细胞核均发生了损伤性形态改变，EC肿胀变圆、脱落可能与线粒体等细胞器功能降低及细胞骨架的破坏有关。
, 百拇医药
PDT后血管系统的另一种改变是血管收缩、血栓形成、血流停止〔7〕。血管闭锁的原因一方面是直接光毒反应损伤毛细血管内层及EC后导致基膜及胶原纤维暴露、凝血因子释放，引起血管收缩、血小板聚积、血栓形成；另一方面EC肿胀后内膜向管腔凸出，导致血流减少也是引起微循环障碍的原因之一。罗向东等〔8〕研究了缺氧环境对培养内皮细胞的损伤，发现缺氧后1 h，缺氧组与对照组聚合肌动蛋白含量尚无显著性差异；缺氧后2 h，缺氧组聚合肌动蛋白含量显著降低，扫描电镜照片可看出细胞的收缩和脱落。细胞骨架微丝由聚合肌动蛋白组成，除了直接的光毒作用外，缺氧造成的损伤也不能排除。
从本研究结果看，PDT后即刻至30 min，即可看到EC形态改变及血管壁的损伤，因此可以推测PDT后首先是单态氧或氧自由基对毛细血管内层及EC造成直接损伤，血管受损后激活了凝血系统，导致血流减少，血栓形成及缺氧。在PDT微血管损伤过程中，直接光敏损伤首先发挥作用，随后发生的微循环障碍引起的缺氧加重、加速了血管的损伤。
, 百拇医药
参考文献
1顾瑛,李峻亨,单焕炎,等.铜蒸气激光用于光动力疗法治疗鲜红斑痣50例疗效分析.中国激光医学杂志,1994;3(4):215
2 杨耀武,吕春堂,吴洋,等.叶绿素光敏剂光动力治疗鲜红斑痣.第四军医大学学报,1997;18(6):582
3 吴洋,吕春堂,赵晋龙.毛细血管瘤光选择特性及特异治疗光产生系列研究.III:鸡冠、肉垂与国人毛细血管瘤区皮肤光吸收特性的比较研究.实用口腔医学杂志,1994,10:282
4 Schnitter H, Franke RP,Drenckhahn D. Role of the endothelial actin filament cytoskeleton in rheology and permeability.Z-kardiol, 1989,28(Suppl 6):1
, http://www.100md.com
5 Roberts WG,Hasan T.Role of neovasculature and vascular permeability on the tumor retention of photodynamic agents.Cancer Res, 1992,52:924
6 Okunaka T,Eckhauser MC,Kato H,et al.Correlation between photodynamic efficacy of differing porphyrins and membrane partitioning behavior.Lasers Surg Med, 1992;12:98
7 Schmidt-Erfurth U,Hasan T,Schomacker K,et al.In vivo uptake of liposomal benzoporphyrin derivative and photothrombosis in experimental corneal neovascularization.Lasers Med, Surg, 1995,17:178
8 罗向东,杨宗城,黎鳌,等.缺氧环境对培养的血管内皮细胞的损伤.中华创伤杂志,1996,12:306
(收稿：1998-04-05 修回：1999-01-22), 百拇医药